CC BY
154
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 616-036.22:616.921.5+616.34(470.341)
СПЕКТР ГЕНОТИПОВ РОТАВИРУСОВ, ЦИРКУЛИРОВАВШИХ НА ТЕРРИТОРИИ НИЖНЕГО НОВГОРОДА В 2005-2012 ГОДЫ. ДОМИНИРОВАНИЕ ГЕНОТИПА G4P[8]
Н.В. Епифанова1, Т.А. Сашина1-2, Н.А. Новикова1-2, О.В. Морозова1-2,
С.Г. Фомина1, Л.Б. Луковникова12, А.Ю. Кашников1
1ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной»,
2ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
Епифанова Наталия Владимировна - mail: epifanovanv@mail.ru
С использованием электрофоретипирования РНК, мультиплексной ПЦР и секвенирования участков генома показано генетическое разнообразие ротавирусов, циркулировавших на
территории Нижнего Новгорода в 2005-2012 годах, которое было представлено двумя видами - А (99,8%) и С (0,2%), восемью G^-генотипами ротавирусов вида А и сорока четырьмя электрофоретипами РНК (геновариантами). Установлен спектр и распределение генотипов: G4P[8] - 64,5%, G1P[8] - 16,9%, G2P[4] - 7,3%, G9P[8] - 4,4%, G3P[8] - 3,8%, редкие генотипы G3P[9], G3P[6] и G6P[9] выявлены в 2,7%, 0,2%, 0,2% случаев соответственно. Филогенетический анализ последовательностей генов, кодирующих белки VP7, VP4(VP8*), VP6 и NSP4, показал принадлежность ротавирусов доминирующего в период наблюдения генотипа G4P[8] к сублинии G4-Ic, линиям P[8]-3, I1-2, E1-1. Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для оценки изменений в структуре ротавирусных популяций.
Ключевые слова: ротавирус, генотип, электрофоретип, филогенетический анализ.
The genetic diversity of rotaviruses circulating in Nizhny Novgorod in 2005-2012 was represented by two species - A (99,8%) and C (0,2%), eight rotavirus A G[P] genotypes, and forty-four electropherotypes (genovariants), which was established by means of multiplex PCR, genome sequencing and e-typing. The spectrum and distribution of genotypes was as follows: G4P[8] - 64,5%, G1P[8] - 16,9%, G2P[4] - 7,3%, G9P[8] - 4,4%, G3P[8] - 3,8%. Rare genotypes G3P[9], G3P[6] and G6P[9] constituted 2,7%, 0,2% and 0,2% respectively. Phylogenetic analysis of gene sequences encoding proteins VP7, VP4 (VP8*), VP6 and NSP4 showed that predominant in the observation period rotavirus genotype G4P[8] belongs to sublineage G4-Ic, lineages P[8]-3, I1-2, E1-1. The data obtained may be further used to assess changes in the structure of rotavirus populations.
Key words: rotavirus, genotype, electropherotype, phylogenetic analysis.
Введение
Ротавирусная инфекция занимает ведущее место в структуре острых кишечных инфекций (ОКИ) преимущественно у детей младшего возраста, широко распространена во всем мире и наносит существенный социальноэкономический ущерб [1]. В настоящее время разработаны ротавирусные вакцины, эффективность применения которых может зависеть от антигенных свойств циркулирующих ротавирусов. Генетическое и антигенное разнообразие ротавирусов (род Rotavirus семейство Reoviridae) определяется вариабельностью генома, состоящего из 11 сегментов двунитевой РНК, кодирующих шесть структурных (VP1-VP4, VP6, VP7) и шесть неструктурных (NSP1-NSP6) белков. Различия в электрофоретической подвижности сегментов при электрофорезе в полиакриламидном геле используют для определения электрофоретипа (ЭФ-типа) РНК ротавирусов [2, 3].
Для молекулярной характеристики штаммов ротавирусов определяют последовательности генов, кодирующих четыре ключевых белка - белки наружного капсида VP7 (G-протеин) и VP4 (Р-протеин), к которым в организме инфицированного человека вырабатываются вирусней-
трализующие антитела, белок внутреннего капсида VP6 (1-протеин), несущий видовые антигенные детерминанты, и неструктурный белок №Р4 (Е-протеин), являющийся вирусным энтеротоксином [4]. На свойствах белков VP7 и VP4 основана бинарная классификация, отражающая комбинацию G и [Р] серотип/генотипов ротавируса [4]. По данным мета-анализа в период 1996-2007 годов пять наиболее распространенных в мире вариантов - G1P[8], G3P[8], G2P[4], G4P[8], G9P[8] - составляли 74,7% циркулирующих ротавирусов при доминировании G1P[8] [5]. В наших исследованиях по идентификации G[P] типов ротавирусов человека, распространенных на территории Нижнего Новгорода и г. Дзержинска в 1997-2005 годы, также было показано преобладание G1P[8] [6].
Целью настоящей работы явилось определение спектра G[P] типов ротавирусов, циркулировавших на территории Нижнего Новгорода в 2005-2012 годах, и молекулярная характеристика доминирующего генотипа вируса.
Материалы и методы
Материалом для исследования служили образцы фекалий детей в возрасте до 17 лет, госпитализированных с острой кишечной инфекцией в период с июля 2005 по
июнь 2012 года в один из детских инфекционных стационаров Нижнего Новгорода.
Обнаружение и электрофоретипирование РНК ротавирусов проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле, как описано ранее [7]. РНК ротавирусов также выявляли методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции (ОТ/ПЦР) с использованием праймеров Con1, Con2 [8]. Для постановки ПЦР выделение РНК, ОТ и амплификацию фрагментов кДНК осуществляли с использованием реагентов производства ЦНИИЭ и ЗАО «Силекс» (Москва). Продукты амплификации визуализировали методом электрофореза в агарозном геле.
Генотипы ротавирусов G1-G4, G9, P[4], P[6], P[9] определяли методом мультиплексной ПЦР с помощью набора типоспецифических праймеров [8, 9, 10, 11] и методом сек-венирования соответствующих участков генов, как предложено [12, 13].
Для трех изолятов ротавирусов генотипа G4P[8] с различными ЭФ-типами РНК были получены фрагменты кДНК, соответствующие генам белков VP7, VP6, NSP4 и участку гена VP4, кодирующему вариабельный домен VP8*, с использованием специфичных для каждого гена праймеров: 9Beg, 9End, GEN_VP6F, GEN_VP6R, GEN_ NSP4F, GEN_NSP4R, Con3mod, Con2 [9, 11, 13, 14]. Праймеры синтезировали в ООО «Синтол». Полученные ампликоны очищали на спин-колонках для выделения ДНК из геля (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург). Определение первичной структуры фрагментов кДНК генома ротавирусов осуществляли в автоматическом режиме с использованием генетического анализатора Beckman Coulter CEQ8000 и набора реагентов DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter, США), согласно рекомендациям производителя.
Нуклеотидные последовательности фрагментов кДНК анализировали с помощью веб-инструмента для геноти-пирования ротавирусов А RotaC [rotac.regatools.be] [15], пакета программ BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/] и программного обеспечения MEGA, версия 5.2 [16]. Для сравнения использовали нуклеотидные последовательности ротавирусов, имеющиеся в базе данных GenBank, номера которых указаны на филогенетических деревьях. Филограммы построены методом присоединения соседей (Neighbor-Joining) по двупараметрической модели Kimura. Достоверность топологии филограмм оценивали с помощью бутстреп-анализа с использованием 1000 случайных выборок. На филограммах указывали статистические индексы поддержки более 60. Полученные в данном исследовании последовательности фрагментов генома ротавирусов, циркулировавших на территории Нижнего Новгорода, представлены в международной базе данных GenBank под номерами KJ162412-KJ162423. Статистическую обработку данных проводили общепринятым методом с использованием критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Выявление и генотипирование ротавирусов. При исследовании образцов фекалий 7190 детей, госпитализированных с ОКИ, РНК ротавирусов была выявлена в 31,8±0,5% (21,6-50,2% в разные годы) случаев. ЭФ-тип РНК определен для 1819 клинических изолятов ротавируса. Идентифицировано 44 различных ЭФ-типа РНК (генова-рианта вируса), которые были распределены по ранее
предложенной нами схеме, основанной на анализе электрофоретической подвижности 10-11 сегментов ротави-русного генома, на пять электрофорегрупп (ЭФ-групп) [3].
Два геноварианта, относящиеся к ЭФ-группе «сверхдлинных» ЭФ-типов, имели профиль РНК с распределением сегментов в 4-3-2-2, что указывает на их принадлежность к ротавирусу вида С. За период наблюдения было выявлено всего четыре таких изолята (0,2%), что свидетельствует о низком уровне циркуляции ротавируса вида С на исследуемой территории. Ранее при изучении генетического разнообразия ротавирусов на европейской части России в 1984-1997 годах ротавирусы вида С были обнаружены нами в 1,2% случаев на 4 из 14 территорий, в основном при спорадической заболеваемости, на одной из территорий они вызвали групповое заболевание ОКИ в дошкольном учреждении [17]. Низкая частота выявления ротавирусов С, но их постоянное присутствие в популяциях, а также способность вызывать вспышки ОКИ отмечаются и в зарубежных исследованиях [18, 19].
Сорок два геноварианта, входящих в ЭФ-группы «длинных», «коротких», «промежуточных» и «широких» ЭФ-типов РНК, имели профили с распределением сегментов на классы 4-2-3-2, характерные для ротавирусов вида А (1815 изолятов - 99,8%). При G[P]-типировании установлено, что в анализируемый период времени на территории Нижнего Новгорода циркулировали ротавирусы вида А, относящиеся к пяти G-типам ^1, G2, G3, G4, G9) и четырем р]-типам ^[4], P[6], P[8], P[9]). Спектр генотипов включал восемь G[P]-комбинаций (рис. 1).
РИС. 1. Спектр и распределение G[P]-типов ротавируса вида А, циркулировавшего в Нижнем Новгороде в 2005-2012 годы.
Ротавирусы G1 выявлялись только в ассоциации с P[8]. В эпидсезон 2005-2006 г. частота их обнаружения составила 46,9±5,1%, а в сезон 2011-2012 г. снизилась до 7,1±1,6% (р<0,001). Генотип 02Г[4] определялся в популяции ротавирусов с частотой выявления от 2,4 до 17,7% в разные сезоны. Ротавирусы G3 наиболее часто выявлялись в ассоциации с P[8] (0,7-13,7%), реже - с Р[9] (1,0-5,9%) и в единичных случаях - с Р[6]. Четыре изолята со специфичностью P[9], G-тип которых не удалось определить с помощью набора праймеров для G1-4 и G9, показали при секвенировании принадлежность к генотипу G6 [20]. Ранее ротавирусы генотипа G6P[9] у человека на территории России не обнаруживались. Этот генотип является типичным для ротавирусов крупного рогатого скота и редко выявляется у человека [21].
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Доминирующим явился генотип G4P[8], который составил почти две трети типированных изолятов. Частота обнаружения ротавирусов данного типа в сезон 2005-2006 г. составила 31,3±4,7% и повысилась до 85,8±2,1% в сезон 2010-2011 г. (р<0,001). В конце периода наблюдения (сезон 20112012 г.) частота его обнаружения снизилась до 40,3±3,1% (р<0,001). В это время в 30,8±2,9% случаев был обнаружен ротавирус G9P[8]. Ротавирус данного генотипа впервые был идентифицирован нами на изучаемой территории в марте 2011 года, его детальная характеристика представлена ранее [7].
Активизация циркуляции ротавирусов G4P[8] была зафиксирована в разных странах в конце 1990-х - начале 2000-х годов [22, 23, 24, 25 , 26, 27]. На территории России в период с 2005 по 2007 год ротавирусы G1P[8] и G4P[8] встречались практически в эквивалентных количествах суммарно по пяти городам (Москва, Челябинск, Тюмень, Махачкала, Хабаровск) [28], а в сезон 2010-2011 г. доля G4P[8] почти в два раза превысила долю G1P[8] в среднем по 11 городам России [29]. ВЗападной Сибири (Новосибирск, Омск) замена доминирующего генотипа ротавируса с G1P[8] на G4P[8] произошла в период с 2007 по 2009 год [30].
Секвенирование и филогенетический анализ участков генома ротавирусов доминирующего генотипа G4P[8]. Генотип G4P[8] в изучаемый период был идентифицирован в 1170 ротавирус-содержащих образцов и был представлен тремя геновариантами - 52-й, 85-й, 42-й ЭФ-типы РНК - в следующих соотношениях: 59,6%:25,4%:15,0%. Три изолята с данными ЭФ-типами РНК - NN1354-12 (52-й), NN2715-11 (85-й), NN934-12 (42-й) (рис. 2) были отобраны для более детальной молекулярной характеристики ротавирусов доминирующего генотипа с использованием сек-венирования нуклеотидных последовательностей кДНК четырех основных генов. При типировании с помощью веб-сервиса RotaC все исследованные геноварианты отнесены к генотипу G4-P[8]-I1-E1. На основе полученных нуклеотидных последовательностей с использованием родственных последовательностей, имеющихся в базе данных GenBank, построены филогенетические деревья отдельно для каждого гена (рис. 3).
Филогенетический анализ на основе нуклеотидных последовательностей гена VP7 показал, что изучаемые нижегородские изоляты относятся к линии I, которая по ранее предложенной классификации [31] соответствует антигенному субтипу А или ST3-подобным штаммам. Линия I разделяется на несколько сублиний - 1а, 1Ь, 1с, И, 1е. Как видно на филограмме, нижегородские ротавирусы G4-типа относятся к сублинии 1с, внутри которой образуют обособленный кластер с ротавирусами из Европы и Западной Сибири. Ротавирусы G4 сублинии 1с были впервые обнаружены в мае 1998 года при вспышке ОКИ в Аргентине [22] и в дальнейшем быстро распространились по соседним Южно-Американским странам [23, 24, 32], появились в Европе и Азии [33, 34].
Анализ выведенных аминокислотных последовательностей белка VP7 показал, что нижегородские варианты ротавируса, так же, как и другие представители сублинии 1с, имеют инсерцию аспарагина (^ в позиции 76 (антигенный регион D) и две аминокислотные замены А146Т (антигенный регион В) и D131E (рис. 4), что, по мнению К. Vok с
соавт. и F. Восса^о с соавт., могло стать причиной повышения вирулентности вируса [22, 24]. Действительно, инсерция без сопутствующих замен в позициях 131 и 146 (изоляты Fin84, сублиния 1а и Агд 1723, сублиния 1Ь), а также замена D131E без инсерции (корейские изоляты, сублиния 1е,) не привели к широкому распространению этих вариантов вируса. Вероятно, сочетание инсерции и двух замен, которые находятся в конформационных антигенных эпитопах 7-1а и 7-2 [35], оказалось наиболее благоприятным для успешного распространения вируса новой сублинии.
РИС. 2.
Электрофореграммы РНК геновариантов ротавируса генотипа G4P[8]:
1 - NN934-12 (42-й), 2 - NN1354-12 (52-й), 3- NN2715-11 (85-й).
2
3
При филогенетическом анализе гена VP4 и выведенных аминокислотных последовательностей домена VP8* установлено, что нижегородские изоляты принадлежат к наиболее распространенной в последние годы линии P[8]-3 и имеют характерные для данной линии аминокислотные замены (S145G и N/D195G). На филограмме они входят в обособленный кластер из восьми изолятов, который сформирован только ротавирусами со специфичностью G4P[8], в основном российскими (за исключением изолята Art, выделенного в 2008 г. в Греции) (рис. 3). Особенностью ротавирусов, входящих в этот кластер, является наличие замены A191T, отличающей их от всех остальных представленных в дереве изолятов.
По гену VP6 исследуемые нижегородские варианты ротавируса G4P[8] относятся к генотипу I1. Ранее мы выделили внутри генотипа I1 две линии - I1-1 и I1-2, которые в свою очередь разделили на четыре и две сублинии соответственно [11]. Анализ последовательностей, полученных в данной работе, позволил выделить в линии I1-2, дополнительно к I1-2a и I1-2b, еще две сублинии - I1-2c и I1-2d (рис. 3). Дивергенция последовательностей внутри сублиний составляет 0,3-2,9%, между сублиниями достигает
1
"К
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
HQ537525 RUS/Ncw10-N713/201WG4P8
- FJ932742 RUS/Omsk07-102/2007/G4P8 JN849134 BEUBE1113/2009/G4P8 GU392992 DEU/GER167-08/2008/G4P8 • KJ162419 RUS/NN934-12/2012/G4P8
- • KJ162420 RUS/NN1354-12/2012/G4P8 -• KJ162418 RUS/NN2715-11/2011/G4P8
- DQ 904525 JPNfJ-4624/2003(G4 • GU377138 RUS/NcMJ4-H36Q(2004/G4P8 JN849138 BEL/BE1129/2009/G4P8 GQ452935 RUS/Omsk08-476f2008fG4P8 AF480280 URY/Mvd9907/1999/G4 DQ396438ITA/755/ OQf2000/G 4 DQ396442 ГГА/П12/99-00/1999/G4 AY954109 BRA/R195/200WG4
- AF373912 ARG/Arg 1730/1998/G4P8 AF373913 ARG/Arg 864/1998/G4P8 —AF373911 ARG/Arg 1717/1998/G4P8 DQ015684 PRY/Py98102/G4P8
HQ425286 KOR/KMR02&2002/G4P6 HQ425287 KOR/KMR028/2002(G4P6 HQ425289 KOR/KMR538/2000/G4P8 HQ425290 KOR/KMR541/2000/G4P8 AF373892 ARG/Arg 931/1998/G4P8 AF373907 ARG/Arg 987/1998/G4P8 AF 373894 ARG/Arg 925f1998/G4P8 AF 373898 ARG/Arg 1239/1998/G4P8 AF 373909 ARG/Arg 1723/1998/G4P8 AF254139 IRE/CIT-176RV/200WG4 AJ288002 FIN/Fin-G4-84/1984/G4P8
GU565090 USA/RotaTeq-BrB-9/1996/G4P5 HM773950 USA/Bet hesdafDC5115/1977/G4P8 HM 773961 USA/Bet hesdafDC827/1978/G4P8 ■ EF672616 GBR/ST3/1975TC4P5 AB039035 JPWHoc №1980/G4P8 AB039034 JPN/Odelia/1984/G4P8 AF373918 ARG/Arg 928/1998/G4P8 M 86833ITA/VA75/G4
Ic
Id
Ie
lb
la
100 LM 86834ITA/VA79/G4
K02033 USA/Waf1974/G1P 8
— KC890872 GRC/Ath198/2008/G4P8 HQ738614 RUS/O msk09-482/2009/G 4P 8
- • KJ162423 RUS/NN1354-12/2012/G4P8 • KJ162422 RUS/NN934-12/2012/G4P8 KC020035 RUS/Nov11-N2709/2011/G4P8
JX682961 RUS/Nov11-N2998/2011/G4P8 • KJ162421 RUS/NN2715-11/2011/G4P8 391JX682953 RUS/Ncw1 1-N2826/2011/G4P8 JX682985 RUS/Novl2-N3925/2012/G4P8
- FJ747616 DEU/GER126-08/2008/G 3G12P 8
- KC677703 RUS/NN445-12/2012/G9P8
- JX470499 CAWS W123/2005/P8 FJ425174 TUN/6854/ARW2002/G 8P 8
j- GU226782 RUS/1083/2008/G4P8 1 FJ410007 RUS/6208 Moscovrf2005/P8 HQ392229 BEUBE00028/2007/G1P8 L EF150329 ITA/ITA-CIC83/2006/G10P8 EF150322ITA/ITA-COS 4/2005/G9P 8 EU045222 PRWPy99449/1999 G4P8 KC193626 /BEUBE00061/2000/G1P8 JX261745 RU S/NovO 5-122/2005/G9P8 AF 170841 2AF/GR1106/1986/G4P8
HM 773868 USA/Bethesda/DC1359/1980/G4P8 KC579589 /US A/DC1179/1978/G1P 8 HM773912 USA/Вelhesda/DC4613/1980fG4P8 ее L FJ947321 USA/BethesdafDC1730/1979/G3P8 HM 773956 USA/BethesdafDC827/1978/G 4P 8 U30716 JP WF45/1987/G9P 8
GU565044 USA/Vacc ine/RotaTeq-WI79-4/1992/G6P 8 JN849149 ВEL/0E1280/20OQfG1P8 HQ445970 RUS/Nov08-3296f2008/G9P8 AJ302148 MWI/OP354/1998fP8
P[8]-3
j—Jl эР--HG
I---A^
JN849113 USA/V ac cine/Rotarix-A 41CB052A/1988/G1P 8 HM 773945 USA/В ethesda/DC5115/1977/G4P8 L34161 USA/Wa/1974/G1P8
AB039943 JPN/Hochi/1980/G4P8 - A B039942 JP N1 Odelia/1984/G 4P8
I AJ540227 USA/DS-1/1976/G2P4
P[8]-2
P[8]-4
P[8]-l
6OjGU390453 RUS/NOV09-D100/2009/G4P8 74J JX841143 RUS/Ncwl 1-N2903/2011/P8
----• KJ162413 RUS/NN934-12/2012/G4P8
GU390438 RUS/NOV05-177/2005/G 9P8 KC890880 GRC/Ath193/2009/G4P8 HM 773870 USA/Bethesda/DC1359/198WG4P8 HM773947 USA/BethesdafDC5115/1977/G4P8
- HM773958 USA/Bethesda/DC827/1978/G4P8 AF531912 IND/RMC100/1992/G4P8
JF490925/VU06-07-27/2006/G1P8 HM 773738 USA/2008747322/2008fG3P 8 GU199521 В GD/Dhaka6/2001 /G11P 25 JF790293 USA/VU05-06-72f2005/G12P8 KC689355 RUS/NN445-12/2012Ю9Р8 &4L KC195773 AUS/CK00081/2007/G1P8 EF426127 USA/US9810/1999/G4P8 JQ230088 RUS/NovI 0-N351/201WG4P8 HQ738584 RUS/Omsk08-246/2008fG3P8 JN258906 BEL/BE00094/2009/G1P8 ев IJK683585 BRA/se17241-09/2009IG1P8 - KC846945 PAK/3090/2010/G1P8
j---• KJ162412 RUS/NN2715-11/2011/G4P 8
-JX867364 RUS/O 979/2010/G4P8
----• KJ162414 RUS/NN1354-12/2012/G4P8
JX867358 RUS/0646/2010/G4P8
- JX841180 RUS/Novl1-N322Qf2011/G3P8 JX841142 RUS/Novl 1-N2826f2011/G4P8 HQ738599 RUS/Omsk09-526/2009/G4P8 GQ477127 RUS/Nov09-D47/2009/G1 P8
JQ713648 JPN/K8/1977/G1P9 AF260931 CHNf97B53/1997/G1P8 100 p JQ 230099 RUS/Novl 1 -N2687/2011/G4P6 HQ61102 RU S/0 Novi 0-N459/201Q/P6 HM 773859 USA/BethesdafDC1208/1980/G4P8 HM 773892 USA/BethesdafDC4320/1988fG4P8 EF426131 USA/US6253/1997/G3P8
----EU753964 IND/mcs/13-07/2007/G9P6
JX943613 US A/Rot arb</2009fG1P8 K02086 USA/Wa/1974/G1P8 11
DQ870507 USA/DS-1/1976/G2P4 12
Il-2c
II-2a
II-2b
II-2d
NSP4
11-2
11-1
— EF 011980 SVNfS hM В 7/2006/G4P 8
— GU138210 RUS/O msk07-78/2007/G4P8
— EU734177ITA/128/07-34/2006/G3P6 JQ 988897 HRV/CR2006/2006/G8P8
I---JN258916 BEL/B E00097/2010/G1P8
L KC443574 AUS/CK20019/2001/G1P8 б!—DQ270111 RUS/N.N.12705/2004/G1P8
- FJ747623 DEU/GER126-08/2008/G3G12P8 • KJ162417 RUS/NN1354-12/2012/G4P 8
- KC689358 RUS/NN2626-11/2011/G9P8 KC689359 RUS/NN445-12/2012/G9P8
------GQ465031 RUS/NOV09-D10f2009fG9P8
GQ465008 RUS/NOV05-101/2005Ю9Р8
• KJ162416 RUS/NN934-12/2012/G4P8 GQ465005 RUS/Nov04-H390/G 1P 4
- FJ915086 RUS/Omsk07-50/2007/G 1P8 HQ392203 BEL/BE00025/2007/G1P8
- GQ 465028 RUS/Nov09-B56f2009/G4P 8
- • KJ162415 RUS/NN2715-11/G4P8
- FJ915085 RUS/Omsk07-7/2007/G1 P8 I— AF 173215 TWN(TA79/1985/G 4P 8
773962 USA/BethesdafDC827/1978fG4P8 HM 773951 USA/BethesdafDC5115/1977/G4P8 KC579981 USA/DC484/1974/G1P8 I K02032 USA/W a/1974/G1P8 E1 GQ465037 RUS/NOV09-D83/2009 G1P8
HM 773896 RUS/B ethesda/DC4320/1988/G 4P8 HM 773907 RRUS/B ethesda/DC4608/1980/G 4P 8 DQ270114 RUS/N.N.12908/2004 G4P9
J-GQ465
II *
LGQ465C
I HM
ijKC!
19 1---------------HM
El-1
- EF159574 CYNfLL36755/2003fG5P6
----------AF284778 CYNf97SZ37/1997/G9
-------JF781167 CHNfpig/NMTU2008/G 9P23
- HM 773874 USA/Bethesda/DC1359/198WG4P8
- JN258357 USA/2007719674/2007/G1P8 I GQ465014 RUS/NOV06-974/2006/G9P8 - JF491032 USA/VU08-09-19/2008/G3P8 721 DQ270116 RUS/N.N.13286/2005/G3P6
I AF 174305 USA/DS-1/1976fG2P4 E2
El-2
El-3
РИС. 3.
Филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных последовательностей участков генов, кодирующих белки VР7, VP4 (доменVP8*), VP6, NSP4 ротавирусов. • - ротавирусы, выявленные в ходе данного исследования, ■ - референсные штаммы ротавирусов.
5,0%. Изолят NN934-12 входит в сублинию 11-2с, сформированную ротавирусами, циркулировавшими на территории Новосибирска в 2005-2011 годах, и штаммом Ath193, выявленным в Греции в 2009 году. Изоляты NN2715-11 и NN1354-12 относятся к сублинии 11-2с1 наряду с ротавирусами, циркулировавшими в Западной Сибири в 2009-2011 годах, а также изолятом 3090, выявленным в Пакистане в 2009 году.
По гену NSP4 нижегородские изоляты относятся к линии Е1-1, при этом изолят NN1354-12 с 85-м ЭФ-типом РНК имеет гомологию по данному гену 99,8-100% с ранее охарактеризованными нами ротавирусами G9P[8] [7], а также очень сходную с ними картину миграции всех сегментов РНК. Изоляты с 52-м (NN2715-11) и 42-м (NN934-12) ЭФ-типами РНК образуют внутри линии отдельный кластер вместе с изолятом ВЕ00025, выделенным в 2007 году в Бельгии, и ротавирусами, выявленными в Западной Сибири (Новосибирск, Омск) в 2004-2009 годах. Особенностью этой группы ротавирусов является наличие аминокислотной замены К163Р.
Заключение
Генетическое разнообразие ротавирусов, циркулировавших на территории Нижнего Новгорода в 2005-2012 годах, было представлено двумя видами - А и С, восемью G[P]-генотипами ротавируса А и сорока четырьмя геновариантами. Определен спектр и распределение генотипов: G4P[8] - 64,5%, G1P[8] - 16,9%, G2P[4] -7,3%, G9P[8] - 4,4%, G3P[8] - 3,8%, редкие генотипы G3P[9], G3P[6] и G6P[9] выявлены в 2,7%, 0,2%, 0,2% случаев соответственно. Установленный нами факт доминирования ротавирусов генотипа G4P[8] на территории Нижнего Новгорода в 2005-2012 годах дополняет данные, полученные в этот период на ряде территорий России и других стран. Филогенетический анализ последовательностей генов, кодирующих основные вирусные белки, показал принадлежность ротавирусов доминиру-
ющего генотипа к новой сублинии G4-Ic и наиболее распространенным в настоящее время линиям P[8]-3, I1-2, E1-1. Исследованные генетические варинаты ротавируса были сходны по генам VP7 и VP4 и гетерогенны по генам VP6 и NSP4. Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для оценки изменений в структуре ротавирусных популяций, в том числе для изучения влияния вакцинопрофилактики на типовой состав территориальной ротавирусной популяции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ogilvie I., Khoury H., El Khoury A.C., Goetghebeur M.M. Burden of rotavirus gastroenteritis in the pediatric population in Central and Eastern Europe: serotype distribution and burden of illness. Hum Vaccin. 2011. V. 7. № 5. P. 523-533.
2. Kalica A.R., Greenberg H.B., Espejo R.T., Flores J., Wyatt R.G., Kapikian A.Z.,
Chanock R.M. Distinctive ribonucleic acid patterns of human rotavirus subgroup 1 and 2. Infect. and Immun. 1981. V. 33. № 3. P. 958-961.
3. Новикова Н.А., Анцупова А.С., Епифанова Н.В., Альтова Е.Е.,
Троицкая М.В. Электрофоретический анализ геномной РНК ротавирусов. Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1989. № 5. С. 45-49.
Novikova N.A., Antsupova A.S., Epifanova N.V., Al'tova E.E., Troitskaya M.V. Elektroforeticheskiy analiz genomnoy RNK rotavirusov. Mol. genetika, mikrobiol. i virusol. 1989. № 5. S. 45-49.
4. Estes M.K., Kapikian A.Z. Rotaviruses. In: Knipe D.M., Howley P.M.,
Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., Roizman B.., Straus S.E. ed. Fields Virology.
Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins/Wolters Kluwer. 2007. P. 1917-1974.
5. Banyai K., Laszlo B., Duque J., Steele A.D., Nelson E.A., Gentsch J.R., Parashar U.D. Systematic review of regional and temporal trends in global rotavirus strain diversity in the pre rotavirus vaccine era: insights for understanding the impact of rotavirus vaccination programs. Vaccine. 2012. V. 30. Suppl. 1. P. A122-130.
6. Новикова Н.А., Федорова О.Ф., Епифанова Н.В., Чупрова А.Б. G[P] типы ротавируса группы А человека и их распространение в Нижнем Новгороде и г. Дзержинске в 1997-2005 гг. Вопросы вирусологии. 2007. Т. 52. № 3. С. 19-23.
Novikova N.A., Fedorova O.F., Epifanova N.V., Chuprova A.B. G[P] tipy rotavirusa gruppy A cheloveka i ikh rasprostranenie v g. Nizhnem Novgorode i g. Dzerzhinske v 1997-2005 gg. Voprosy virusologii. 2007. T. 52. № 3. S. 19-23.
7. Епифанова Н.В, Морозова О.В., Сашина Т.А., Новикова Н.А. Характеристика ротавируса генотипа G9, выявленного в Нижнем Новгороде в 2011-2012 годах. Медицинский алфавит. Эпидемиология и гигиена. 2013. Т. 4. № 24. С. 20-26.
РИС. 4.
Аминокислотные последовательности белка VP7 ротавирусов гентипа Б4.I, II - линии, 1а, 1Ь, 1с, М, 1е - сублинии, А, В, С, D, F - антигенные эпитопы белка VP7, * - характерные особенности сублинии 1с нижегородские изоляты выделены жирным шрифтом.
Epifanova N.V., Morozova O.V., Sashina T.A., Novikova N.A. Kharakteristika rotavirusa genotipa G9, vyyavlennogo v Nizhnem Novgorode v 2011-12 godakh. Meditsinskiy alfavit. Epidemiologiya i gigiena. 2013. T 4. № 24. S. 20-26.
8. Gentsch J.R., Glass R.I., Woods P., Gouvea V., Gorziglia M., Flores J., Das B.K., Bhan M.K. Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction J. Clin. Microbiol. 1992. V. 30. № 6. 1365-1373.
9. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Федорова О.Ф. G^-генотипирование ротавирусов с использованием полимеразной цепной реакции. Методические рекомендации. Нижний Новгород, 2007. 16 с.
Novikova N.A., Epifanova N.V., Fedorova O.F. G[P]-genotipirovanie rotavirusov s ispol'zovaniem polimeraznoy tsepnoy reaktsii. Metodicheskie rekomendatsii. Nizhniy Novgorod, 2007. 16 s.
10. Das B.K., Gentsch J.R., Cicirello H.G., Woods P.A., Gupta A., Ramachandran M., Kumar R., Bhan M.K., Glass R.I. Characterization of rotavirus strains from newborns in New Delhi, India J. Clin. Microbiol. 1994. V. 32. № 7. P. 1820-1822.
11. Gouvea V., Glass R.I., Woods P., Taniguchi K., Clark H.F., Forrester B., Fang Z.Y. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. J. Clin. Microbiol. 1990. № 28 (2). Р. 276-282.
12. DiStefano D.J., Kraiouchkine N., Mallette L., Maliga M., Kulnis G., Keller P.M., Clark H.F., Shaw A.R. Novel rotavirus VP7 typing assay using a one-step reverse transcriptase PCR protocol and product sequencing and utility of the assay for epidemiological studies and strain characterization, including serotype subgroup analysis. J. Clin Microbiol. 2005. V. 43. № 12. P. 5876-5880.
13. Maunula L., von Bonsdorff C.H. Short sequences define genetic lineages: phylogenetic analysis of group A rotaviruses based on partial sequences of genome segments 4 and 9. J. Gen. Virol. 1998. V. 79 (Pt. 2.). P. 321-32.
14. Matthijnssens J., Ciarlet M., Heiman E., Arijs I., Delbeke T., McDonald S.M., Palombo E.A., Iturriza-G mara M., Maes P., Patton J.T., Rahman M., Van Ranst M. Full genome-based classification of rotaviruses reveals common origin between human Wa-like and porcine rotavirus strains and human DS-1-like and bovine rotavirus strains. J. Virol. 2008. V. 82. № 7. P. 3204-3219.
15. Maes P., Matthijnssens J., Rahman M., Van Ranst M.. RotaC: a web-based tool for the complete genome classification of group A rotaviruses. BMC Microbiol. 2009. V. 9. 238. doi: 10.1186/1471-2180-9-238.
16. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28. № 10. P. 2731-2739.
17. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Фардзинова В.Ф., Чечуева Л.И., Февралева Е.Л., Кашников А.Ю. Обнаружение атипичных ротавирусов человека и их характеристика. Микробиология. 1994. № 2. С. 103-106.
Novikova N.A., Epifanova N.V, Fardzinova V.F., Chechueva L.I., Fevraleva E.L., Kashnikov A.Yu. Obnaruzhenie atipichnykh rotavirusov cheloveka i ikh kharakteristika. Zhurn. Mikrobiol. 1994. № 2. S. 103-106.
18. Kuzuya M., Fujii R., Hamano M., Nishijima M., Ogura H. Detection and molecular characterization of human group C rotaviruses in Okayama Prefecture, Japan, between 1986 and 2005. J Med Virol. 2007. V. 79. № 8. P. 1219-1228.
19. Kumazaki M., Usuku S. Epidemiological and genetic analysis of human group C rotaviruses isolated from outbreaks of acute gastroenteritis in Yokohama, Japan, between 2006 and 2012. Arch Virol. 2013 Oct 25. [Epub ahead of print]
20. Епифанова Н.В., Сашина Т.А., Морозова О.В., Новикова Н.А. Выявление редких G/P-комбинаций ротавирусов группы A у детей с острой кишечной инфекцией // Материалы V-го Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. Инфекционные болезни. 2013. T. 11. Прил. 1. С. 136-137.
Epifanova N.V, Sashina T.A., Morozova O.V., Novikova N.A. Vyyavlenie redkikh G/P-kombinatsiy rotavirusov gruppy A u detey s ostroy kishechnoy infektsiey // Materialy V-go Ezhegodnogo Vserossiyskogo Kongressa po infektsionnym boleznyam. Infektsionnye bolezni. 2013. T 11. Pril. 1.
S. 136-137.
21. De Grazia S., Martella V., Rotolo V., Bonura F., Matthijnssens J., Banyai K., Ciarlet M., Giammanco G.M. Molecular characterization of genotype G6 human rotavirus strains detected in Italy from 1986 to 2009. Infect Genet Evol. 2011. V. 11. № 6. P. 1449-1455.
22. Bok K., Matson D.O., Gomez J.A. Genetic variation of capsid protein VP7 in genotype G4 human rotavirus strains: simultaneous emergence and spread of different lineages in Argentina. J Clin Microbiol. 2002. V. 40. № 6. P. 2016-2022.
23. Volotao E.M., Soares C.C., Maranhao A.G., Rocha L.N., Hoshino Y., Santos N. Rotavirus surveillance in the city of Rio de Janeiro-Brazil during 20002004: detection of unusual strains with G8P[4] or G10P[9] specificities. J. Med. Virol. 2006. V. 78. № 2. P. 263-272.
24. Bucardo F., Karlsson B., Nordgren J., Paniagua M., Gonzalez A., Amador J.J., Espinoza F., Svensson L. Mutated G4P[8] rotavirus associated with a nationwide outbreak of gastroenteritis in Nicaragua in 2005. J Clin Microbiol. 2007. V. 45. № 3. P. 990-997.
25. Van Damme P., Giaquinto C., Maxwell M., Todd P., Van der Wielen M.; REVEAL Study Group. Distribution of rotavirus genotypes in Europe, 2004-2005: the REVEAL Study. J Infect Dis. 2007. V. 195. Suppl 1. P. 17-25.
26. Oh H.K., Hong S.H., Ahn B.Y., Min H.K. Phylogenetic Analysis of the Rotavirus Genotypes Originated from Children < 5 Years of Age in 16 Cities in South Korea, between 2000 and 2004. Osong Public Health Res Perspect. 2012. V. 3. № 1. P. 36-42.
27. Kargar M., Akbarizadeh A.R.. Prevalence and molecular genotyping of group A rotaviruses in Iranian children. Indian J. Virol. 2012. V. 23. № 1. P. 24-28.
28. Podkolzin A.T., Fenske E.B., Abramycheva N.Y., Shipulin G.A., Sagalova O.I., Mazepa V.N., Ivanova G.N., Semena A.V., Tagirova Z.G., Alekseeva M.N., Molochny V.P., Parashar U.D., Vinje J., Maleev V.V., Glass R.I., Pokrovsky V.I. Hospital-based surveillance of rotavirus and other viral agents of diarrhea in children and adults in Russia, 2005-2007. J Infect Dis. 2009. V. 200. Sl. P. 228-233.
29. Подколзин А.Т., Петухов Д.Н., Веселова О.А., Коновалова Т.А., Чернявская О.П., Морозова Н.С., Черепанова Е.А. Позитивные и проблемные аспекты применения ротавирусных вакцин. Эпидемиология и вакционопро-филактика. 2013. T. 68. № 1. С. 80-89.
PodkolzinA.T.,PetukhovD.N., VeselovaO.A.,Konovalova T.A., Chernyavskaya O.P., Morozova N.S., Cherepanova E.A. Pozitivnye i problemnye aspekty primeneniya rotavirusnykh vaktsin. Epidemiologiya i vaktsionoprofilaktika. 2013. T. 68. № 1. S. 80-89.
30. Жираковская Е.В., Аксанова Р.Х. Горбунова М.Г., Тикунов А.Ю., Курильщиков А.М., Соколов С.Н., Нетесов С.В., Тикунова Н.В. Генетическое разнообразие изолятов ротавирусов группы А, выявленных в Западной Сибири в 2007-2011 гг. Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 2012. № 4. С. 34-41.
Zhirakovskaya E.V., Aksanova R.Kh. Gorbunova M.G., Tikunov A.Yu., Kuril'shchikov A.M., Sokolov S.N., Netesov S.V., Tikunova N.V. Geneticheskoe raznoobrazie izolyatov rotavirusov gruppy A, vyyavlennykh v Zapadnoy Sibiri v 2007-2011 gg. Mol. genetika, mikrobiol. i virusol. 2012. № 4. S. 34-41.
31. Green K.Y., Sarasini A., Qian Y., Gerna G. Genetic variation in rotavirus serotype 4 subtypes. . Virology. 1992. V. 188. № 1. P. 362-368.
32. Berois M., Libersou S., Russi J., Arbiza J., Cohen J. Genetic variation in the VP7 gene of human rotavirus isolated in Montevideo-Uruguay from 1996-1999. J. Med. Virol. 2003. V. 71. № 3. P. 456-462.
33. Arista S. Giammanco G.M., De Grazia S., Colomba C., Martella V. Genetic variability among serotype G4 Italian human rotaviruses. J Clin Microbiol. 2005. V. 43. № 3. P. 1420-1425.
34. Trinh Q.D., Pham N.T., Nguyen T.A., Phan T.G., Yan H., Hoang le P., Khamrin P., Maneekarn N., Li Y., Okitsu S., Mizuguchi M., Ushijima H. Sequence analysis of the VP7 gene of human rotaviruses G2 and G4 isolated in Japan, China, Thailand, and Vietnam during 2001-2003. J. Med. Virol. 2010. V. 82. № 5. P. 878-885.
35. Zeller M., Patton J.T., Heylen E., De Coster S., Ciarlet M., Van Ranst M., Matthijnssens J. Genetic analyses reveal differences in the VP7 and VP4 antigenic epitopes between human rotaviruses circulating in Belgium and rotaviruses in Rotarix and RotaTeq. J Clin Microbiol. 2012. V. 50. № 3. P. 966-976.
