CC BY
20
УДК 616.157-078
РАНЕЕ НЕ ОБНАРУЖЕННЫЙ ТРАНСПОЗОН ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PYOGENES, УСТОЙЧИВЫЙ К ДЕЙСТВИЮ ТЕТРАЦИКЛИНА
Е.М. Полякова, А.В. Дмитриев Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Россия
NOT PREVIOUSLY DETECTED TRANSPOSON STRAINS STREPTOCOCCUS PYOGENES, RESISTANT TO THE TETRACYCLINE
E.M. Polyakova, A.V. Dmitriev Establishment of the Russian Academy of Medical Sciences and Research Institute of Experimental Medicine,
North-Western Branch of RAMS, Russia
©Коллектив авторов, 2011 г.
Впервые у Streptococcus pyogenes обнаружен транспозон, характерный для Streptococcus pneumoniae. Установлена локализация транспозона в геноме S.pyogenes. Показано, что обнаруженный транспозон содержит ген tetM и обеспечивает устойчивость штаммов S. pyogenes к тетрациклину.
Ключевые слова: Streptococcus pyogenes, транспозон, устойчивость к тетрациклину.
In this study, the transposon specific for Streptococcus pneumoniae was discovered in Streptococcus pyogenes strains. The exact location of transposon in S. pyogenes genome was identified. This transposon was found to possess tetM gene and provide resistance of S. pyogenes to tetracycline.
Key words: Streptococcus pyogenes, transposon, tetracycline resistance.
Введение
Streptococcus pyogenes (стрептококк группы А, СГА) - патогенный микроорганизм, вызывающий различные заболевания человека, включая тяжелые инвазивные формы инфекции [1,
2, 3, 4, 5]. Развитие данных заболеваний связано с наличием у S. pyogenes целого ряда факторов патогенности, некоторые из которых входят в состав мобильных генетических элементов [6, 7, 8]. В составе мобильных элементов также часто встречаются гены, обусловливающие устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам, что существенно осложняет лечение заболевания [9, 10, 11, 12]. Так, например, для S. pyogenes показана устойчивость практически ко всем группам антибиотиков, за исключением препаратов пенициллинового ряда. В последние годы наблюдается увеличение числа штаммов S. pyogenes, устойчивых к действию эритромицина, клиндамицина и/или тетрациклина [13, 14, 15], что во многом связано с появлением новых генетических детерминант, ответственных за анти-биотикоустойчивость штаммов [16, 17]. Таким образом, одной из важных задач современной микробиологии является изучение механизмов возникновения антибиотикоустойчивости, в частности, обусловленной горизонтальным переносом мобильных генетических элементов.
Материалы и методы
Объектами исследования явились 35 штаммов S. pyogenes генотипов emml и emm12, выделенные в Санкт-Петербурге в 2007-2008 гг. от больных и носителей (табл. 1). Культуры S. pyogenes выращивали в бульоне Todd-Hewitt (HiMedia, Индия) в течение 18 часов при 37о С.
Хромосомную ДНК выделяли фенол-хло-роформенной экстракцией. emm генотип определяли по методике, опубликованной на сайте Centers for Disease Control and Prevention (www. cdc.gov/ncidod/biotech/strep/protocol_emm-type.htm). Фрагменты ДНК выделяли из агарозного геля с использованием набора «Bacterial Genomic DNA Miniprep kit» (Axygen, США). Секвенирование ДНК проводили на секвена-торе CEQTM 8000 (BECKMAN COULTER, США).
Амплификацию фрагментов ДНК проводили с использованием праймеров (табл. 2) в следующем режиме: первичная денатурация ДНК
- 3 мин при 95оС; 30 циклов амплификации -15 сек при 95оС, 1 мин при температуре отжига праймеров, 1 мин при 72оС; окончательная достройка - 10 мин при 72оС. Для анализа штаммов методом RAPD проводили ПЦР с использованием праймера Н2 (18) в смеси объемом 50 мкл, содержащей 20 нг хромосомной ДНК при
Таблица 1
Штаммы S. pyogenes, использованные в работе
Количество штаммов Генотип Год выделения Диагноз
5 скарлатина
1 2007 лакунарная ангина
1 emml носительство
2008 носительство
1 скарлатина
1 гнойный синусит
скарлатина
1 emm12 2007 острый тонзиллит
1 хронический тонзиллит
12 носительство
Таблица 2
Праймеры, использованные в работе
Прямой праймер (название), 5’^3’ Обратный праймер (название), 5’^3’ Размер ПЦР продукта (п.н.)
cctcccgccacc (H2) — множественные продукты ПЦР (рис. 1)
tgaatgagctttgatacgacg (tn1f) 434
cagtcacgacgttgtaaaacga (M3(2)) atgtttttcgccagcttcag (tn1r) 1400
ccgccaccattaagaaagtc (tn2f) cgccacctgaatactcttttga (tn2r) 536
aaagagaagcaacaggagcg (tn3f) ttttcttaaatgctcgtaaagcc (tn3r) 173
ttcaattgagtgtctacgatgttcgca (tetMf) agccctgttagtaccccagcag (tetMr) 191
tccttcccttccaagatgtg (carb) tcctaaaccagatcccttacca (cons) 444
tcatgcaggcgacccaatc (1916f) cacgcttcctaattctgtaatcgc (tetM2r) 1501
приведенных выше условиях, за исключением температуры отжига праймера, которая составляла 38оС. Электрофорез ПЦР продуктов проводили в 1% агарозном геле, и ДНК визуализировали бромистым этидием в проходящем УФ-свете.
Рестрикцию хромосомной ДНК проводили с использованием фермента НіпШіІ (Такага, Япония) при температуре 37оС в течение ночи.
Лигирование хромосомной ДНК, рестрици-рованной Hind.HI, с коммерческим препаратом риС118 Н^ІІІ/БАР (Такага), проводили при помощи Т4 ДНК-лигазы (Такага) при температуре 16оС в течение ночи.
Оценку антибиотикоустойчивости штаммов осуществляли дискодиффузионным методом
Рис. 1. Паттерн RAPD, содержащий маркерный фрагмент ДНК размером 550 п.н. ( трек 1) и патрон RAPD, не содержащий этот фрагмен ( трек 2 )
согласно соответствующим методическим указаниям (МУК 4.2.1890-04).
Результаты и их обсуждение
Методом RAPD (randomly amplified polymorphic DNA, ПЦР со «случайной» затравкой) было проанализировано 35 штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенных в Санкт-Петербурге. В результате исследования оказалось, что 5 из 35 штаммов содержали в структуре паттерна RAPD фрагмент ДНК размером 550 п.н. (рис. 1, табл. 3). Данный маркерный фрагмент ДНК был выделен из геля, а его нуклеотидная последовательность секвенирована и депонирована в базу данных GenBank. В результате анализа было обнаружено, что нуклеотидная последовательность маркерного фрагмента ДНК на 98-100% гомологична фрагментам двух генов транспозона (SPT_1915 и SPT_1916), характерного для штаммов Streptococcus pneumoniae [19], и не описанного ранее для S. pyogenes.
На основании полученных данных было предположено, что наличие маркерного фрагмента размером 550 п.н. в паттерне RAPD штаммов S. pyogenes может свидетельствовать о наличии полноразмерного транспозона в геноме этих штаммов. Для проверки данного предположения на основании нуклеотидной последовательности S. pneumoniae были сконструированы пары праймеров tn1f-tn1r, tn2f-tn2r и tn3f-tn3r (табл. 2, рис. 2). В результате ПЦР анализа было показано, что все 5 штаммов, имеющие маркерный фрагмент ДНК, содержали и другие гены, характерные для транспозона S. pneumoniae (SPT_1906, SPT_1907, SPT_1915, SPT_1916 и SPT_1931) (табл. 3). В геноме остальных 30 штаммов S. pyogenes транспозон выявлен не был.
Таблица 3
Устойчивость штаммов к тетрациклину и результататы ПЦР анализа
Количество штаммов Наличие маркерного фрагмента ДНК (550 п.н.) Наличие транспозона (гены SPT 1906, SPT 1907, SPT 1915, SPT 1916, SPT_1931) Наличие гена tetM Принадлежность tetM транспозону Устойчивость к тетрациклину
4 + + + + +
1 + + + + -
30 - - - - -
<Х>00<Х><><><>С><><><Х><>0<Х><><Х>С><><><Х><>0<Х><><>0С><><><Х><>0<Х><><>0<><><^^
фОМОСОМЙ
tn3r , cons хромосома
I I — ген Spy 0237 ИШ - ген SPT1906 Н - ген SPT1907 — - ген SPT 1915
транспозон
ШШ — ген SPT 1916 Ш - генШ
I------1 - ген SPT 1931
| — ген Spy 0238
Рис. 2. Локализация генов транспозона на хромосомной ДНК S. pyogenes
Рис. 3. Схема эксперимента по определению локализации транспозона в геноме S. pyogenes
Локализацию обнаруженного транспозона в геноме S. pyogenes определяли следующим образом. Была проведена рестрикция хромосомной ДНК штамма S. pyogenes, содержащего транспозон, рестриктазой HindIII, и лигирование рестрицированной хромосомы с коммерческим препаратом pUC118 HindIII/BAP (вектор pUC118, рестрицированный HindIII и обработанный щелочной фосфатазой) (рис. 3: А, Б). В результате лигирования молекул вектора с большим количеством фрагментов, полученных после рестрикции хромосомной ДНК, ожидалось образование разных вариантов рекомбинантных молекул вектора, отличающихся встроившимися в них фрагментами хромосомной ДНК. Искомая молекула представляла собой вектор pUC118, содержащий вставку, состоящую из фрагмента хромосомной ДНК S. pyogenes и прилегающего к нему 5’-участка транспозона (рис. 3: В). Лигазную смесь использовали в качестве ДНК матрицы для ПЦР с праймерами М3(2) (на фрагмент вектора, перед вставкой) и tn1R
(на фрагмент транспозона) (табл. 2, рис. 3: В). В результате ПЦР образовался амлификат, состоящий из последовательности №1, соответствующей фрагменту вектора перед вставкой, последовательности №2, соответствующей хромосомной ДНК, и последовательности №3, соответствующей 5’-участку транспозона (рис. 3: Г). Секвенирование полученного амплификата позволило определить, что в геноме данного штамма транспозон расположен рядом с хромосомным геном Spy_0237 (рис. 2) (согласно полногеномному сиквенсу штамма S. pyogenes SF370). Для проверки полученных данных были сконструированы соответствующие праймеры и проведена ПЦР с парами праймеров carb и tn1R, tn3f и cons (табл. 2). В результате ПЦР и последующего секвенирования оказалось, что у трех из 35 штаммов S. pyogenes транспозон расположен между хромосомными генами Spy_0237 и Spy_0238 (рис. 2), а у двух других штаммов имеет иную локализацию в геноме. В результате компьютерного анализа был выявлен сайт интеграции транспозона, представляющий собой последовательность TTTTTTATTTTTAAAA.
Исходя из того, что у штаммов S. pneumoniae в состав подобного транспозона входит ген tetM, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, было предположено, что исследуемые штаммы
S. pyogenes, содержащие этот транспозон, также содержат ген tetM. Для проверки данного предположения были сконструированы праймеры на ген tetM (табл. 2). В результате ПЦР оказалось, что ген tetM присутствовал в геноме всех 5 штаммов S. pyogenes, содержащих обнаруженный транспозон (табл. 3). Последовательность гена была определена при помощи секвениро-вания и депонирована в базу данных GenBank.
Чтобы определить, входит ли ген tetM в состав данного транспозона, на основании нуклеотидной последовательности транспозона S. pneumoniae были сконструированы соответствующие праймеры: 1916f и tetM2R, где tetM2R -праймер на ген tetM, а 1916f - праймер на ген SPT_1916, расположенный рядом с геном tetM и также принадлежащий транспозону (табл. 2, рис. 2). В результате ПЦР анализа было показано, что у всех 5 штаммов S. pyogenes ген tetM ассоциирован с обнаруженным транспозоном.
С целью выявить возможную взаимосвязь между наличием гена tetM и устойчивостью штаммов S. pyogenes к тетрациклину была проведена оценка чувствительности данных штаммов к тетрациклину. В результате исследования
было выявлено, что 4 из б штаммов, содержащих ген tetM, устойчивы к тетрациклину (табл. 3).
В результате проведенного исследования в геноме б из 3б исследуемых штаммов был выявлен транспозон, не обнаруженный ранее у штаммов S. pyogenes, но характерный для штаммов S. pneumoniae. Присутствие транспозона в геноме штаммов коррелировало с наличием в паттерне RAPD маркерного фрагмента ДНК размером бб0 п.н., что подчеркивает значимость метода RAPD для выявления мобильных генетических элементов, во многом обуславливающих геномные различия между штаммами.
У трех из пяти штаммов S. pyogenes транспо-зон был расположен между двумя хромосомными генами: Spy_0237 и Spy_0238, а два штамма содержали транспозон в другом участке генома (локализация не установлена). Данный факт не является неожиданным, учитывая способность транспозонов встраиваться в различные участки генома, что подтверждается данным по локализации этого транспозона в геноме S. pneumoniae. Например, его локализация в штаммах S. pneumoniae Taiwan 19F и TCH8431/19A отличается от таковой в штаммах S. pneumoniae P1031 и G54 [19].
Для всех б штаммов S. pyogenes, содержащих транспозон, было показано наличие ассоциированного с ним гена tetM. При этом, 4 из б штаммов S. pyogenes были устойчивы к тетрациклину. Важным является тот факт, что 30 штаммов, не содержащих ген tetM, были чувствительны к тетрациклину. Таким образом, устойчивость исследуемых штаммов S. pyogenes к тетрациклину объясняется присутствием в их геноме транспо-зона и гена tetM. Лишь один из б штаммов, содержащих ген tetM, был чувствителен к тетрациклину, что, возможно, связано с нарушением синтеза белка TetM, ответственного за защиту бактериальных рибосом от действия тетрациклина, или нарушениями его функциональной активности [20, 21, 22].
Таким образом, результаты исследования дают основание утверждать, что впервые в геноме S. pyogenes обнаружен транспозон, по-видимому, приобретенный посредством межвидового горизонтального переноса генов от штаммов S. pneumoniae, и обеспечивший устойчивость S. pyogenes к тетрациклину.
Литература
1. Banks D. J., Lei B. and Musser J. M. Prophage induction and expression of prophage-encoded virulence factors in group A streptococcus serotype
M3 strain MGAS315 // Infect. Immun. - 2003. -V. 71. - №12. - P. 7079-7086.
2. Carapetis J., Robins-Browne R. et.al. Increasing severity of invasive group A streptococcal disease in Australia: clinical and molecular epidemiological features and identification of a new virulent M-non-typeable clone // Clin. Infect. Dis. - 1995.
- V. 21. - №5. - P. 1220-1227.
3. Holm S. E., Norrby A. et.al. Aspects of pathogenesis of serious group A streptococcal infections in Sweden 1988-1989 // J. Infect. Dis. - 1992. -V. 166. - №1. - P. 31-37.
4. O’Brien K. L., Beall B. et al. Epidemiology of invasive group A streptococcus disease in the United States, 1995-1999 // Clin. Infect. Dis. - 2002.-V. 35. - №11. - P. 268-276.
5. Sharkawy A., Low D. E. et al. Severe group A streptococcal soft tissue infections in Ontario: 1992-1996 // Clin. Infect. Dis. - 2002. - V. 34. -№4. - P. 454-460.
6. Beres S. B., Sylva G. L. et.al. Genome sequence of a serotype M3 strain of group A Streptococcus: phage-encoded toxins, the high-virulence phenotype, and clone emergence // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2002. - V. 99. - №15. - P. 10078-10083.
7. Ferretti J. J., McShan W. M. et.al. Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes // Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America.
- 2001. - V. 98. - №8. - P. 4658-4663.
8. Smoot J. C., Barbian K. D. et. al. Genome sequence and comparative microarray analysis of serotype M18 group A streptococcus strains associated with acute rheumatic fever outbreaks // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2002. - V. 99. - №7. - P. 4668-4673.
9. Ardanuy C., Domenech A. et.al. Molecular characterization of macrolide- and multidrug-resistant Streptococcus pyogenes isolated from adult patients in Barcelona, Spain (1993-2008) // J. Antimicrob. Chemother. - 2010. - V. 65 - №4. - P. 634-643.
10. Brenciani A., Kayode K., et.al. Distribution and molecular analysis of mef(A)-containing elements in tetracycline-susceptible and-resistant Streptococcus pyogenes clinical isolates with efflux-mediated erythromycin resistance // J. Antimicrob. Chemother. - 2004. - V. 54. №6. - P. 991-998.
11. Brenciani A., Bacciaglia A. et.al. Om46.1, the main Streptococcus pyogenes element carrying mef(A) and tet(O) genes // Antimicrob. Agents Chemother. - 2010. - V. 54. - №1. - P. 221-229.
12. Metzgar D., Erin A. et.al. Local changes in rates of group A streptococcus disease and antibi-
otic resistance are associated with geographically widespread strain turnover events // Virulence. -2010. - V. 1. - №4. - P. 247-253.
13. Smeesters P., Cadar S. et.al. Polyclonal dissemination of tetracycline resistance among Streptococcus pyogenes paediatric isolates from Brazil // J. Infect. Dev. Ctries. - 2010. - V. 4. - №11. - P. 704-711.
14. Pavlovic L., Grego E. and Sipetic-Grujicic S. Prevalence of Macrolide Resistance in Streptococcus pyogenes collected in Serbia // Jpn. J. Infect. Dis. - 2010. - V. 63. - №4. - P. 275-276.
15. Ikebe T., Wada A. et.al. Emergence of clindamycin-resistant Streptococcus pyogenes isolates obtained from patients with severe invasive infections in Japan // Jpn. J. Infect. Dis. - 2010. V. 64.
- № 4. - P. 304-305.
16. Clermont D., Chesneau O. et.al. New tetracycline resistance determinants coding for ribo-somal protection in streptococci and nucleotide sequence of tet(T) isolated from Streptococcus pyogenes A498 // Antimicrob. Agents Chemother.-1997. -V. 41 - №1. - P. 112-116.
17. Hammerum A., Nielsen H. et.al. Detection of tet(M), tet(O) and tet(S) in tetracycline/minocy-
cline-resistant Streptococcus pyogenes bacterae-mia isolates // J. Antimicrob. Chemother. - 2003.
- V. 53. - №1. - P. 118-119.
18. Rogers S., Commons R. et al. Strain prevalence, rather than innate virulence potential, is the major factor responsible for an increase in serious group A streptococcus infections // J. Infect. Dis. -2007. - V. 195. - №11. - P. 1625-1633.
19. Dopazo J., Mendoza A. et.al. Annotated draft genomic sequence from a Streptococcus pneumoniae type 19F clinical isolate // Microb. Drug. Resist. - 2001. - V. 7. - №2. - P. 99-125.
20. Burdett V. Tet(M)-promoted release of tetracycline from ribosomes is GTP dependent // J. Bacteriol. - 1996. - V. 178. - №11. - P. 3246-3251.
21. Taylor D. E. and A. Chau. Tetracycline resistance mediated by ribosomal protection // Antimicrob. Agents Chemother. - 1996. - V. 40. - №1. - P. 1-5.
22. Taylor D. E., Trieber C. A. et. al. Host mutations (miaA and rpsL) reduce tetracycline resistance mediated by Tet(O) and Tet(M) // 1998.
- Antimicrob. Agents Chemother. - V. 42. - №1.
- P. 59-64.
Полякова Екатерина Михайловна
Тел: 8-952-391-73-61
E-mail: ekaterinapolyakova@rambler.ru
