CC BY
40
ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ БЕСПРИБОРНОЙ ИММУНОДИАГНОСТИКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОТОГРАФИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА
Аронбаев Дмитрий Маркиэлович
доцент, химический факультет, Самаркандский государственный университет, 140104, Узбекистан, г. Самарканд, Университетский бульвар, 15
E-mail: [email protected]
Васина Светлана Михайловна
доцент, химический факультет, Самаркандский государственный университет, 140104, Узбекистан, г. Самарканд, Университетский бульвар, 15
E-mail: [email protected]
THE NEW METHOD DEVELOPMENT OF NON-INSTRUMENTAL IMMUNODIAGNOSIS USING PHOTOGRAPHIC DETECTION OF THE ANALYSIS RESULTS
Dmitry Aronbaev
associate Professor, Department of Chemistry, Samarkand State University, 140104, Uzbekistan, Samarkand, University Boulevard, 15
Svetlana Vasina
associate Professor, Department of Chemistry, Samarkand State University, 140104, Uzbekistan, Samarkand, University Boulevard, 15
АННОТАЦИЯ
Рассмотрены варианты иммуноферментного анализа с использованием фотографической регистрации. Изучена возможность использования галогенид-серебряной поверхности фотоматериала в качестве «сухого» реагента для определения активности пероксидазы по каталитической реакции окисления гидрохинона перекисью водорода в присутствии фермента. При нанесении фермент-субстратной смеси на поверхность сенсибилизированного квантами света фотоматериала интенсивность почернения получаемых пятен находится в обратной зависимости от пероксидазной активности исследуемого препарата. При денситометрировании почернений предел обнаружения пероксидазы составляет ~1 нг/мл. С целью оптимизации условий для детектирования пероксидазной метки в иммуноферментном анализе изучен процесс проявления скрытого изображения на фотоматериале. Способ определения пероксидазы прост в исполнении, не требует дефицитных реактивов и может быть использован в иммунофер-ментных тест-методах для качественного и полуколичественного экспресс-определения ряда биологически активных веществ. Приводятся возможные схемы липосомного иммуноанализа с применением везикул, «нагруженных» маркером, поддающегося фотографической детекции.
ABSTRACT
The variants of enzyme multiplied immunoassay using the photographic registration are considered. The possibility of using a silver halide of the photographic material surface as a "dry" reagent is studied to determine a peroxidase activity according to catalytic oxidation reaction of hydroquinone by hydrogen peroxide in the presence of the enzyme. When applying the enzyme-substrate mixture on the surface of a sensitized photographic material by light rays, the blackening intensity of received spots is in inverse proportion to the peroxidase activity of the investigated drug. Under densitometry of blackening, the peroxidase detection limit is about 1 ng / ml. In order to optimize conditions for detection of the peroxidase label in the immunoassay, the process of the latent image manifestation on the photographic material is studied. A method for determining peroxidase is simple-to-perform, does not require missing reagents and can be used in enzyme immunoassay methods for the qualitative and semi-quantitative express determination of a number of biologically active substances. The possible schemes of liposome immunoassay using vesicles "loaded" with the marker and subject to the photographic detection are provided.
Библиографическое описание: Аронбаев Д.М., Васина С.М. Разработка новых методов бесприборной иммунодиагностики с использованием фотографической детекции результатов анализа // Universum: Химия и биология: электрон. научн. журн. 2017. № 1(31). URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/4120
АД UNIVERSUM:
№ 1 (31)_ЛД химия и биология_январь. 2017 г.
Ключевые слова: антигенное загрязнение окружающей среды, иммунотестирование, иммунопероксидаз-ный анализ, фотографические преобразователи информации, бесприборная иммунодиагностика, липосомный анализ, тенденции развития.
Keywords: antigenic pollution, immunotest, immunoperoxidase analysis, photographic data converters, without devices immunodiagnostics, liposome analysis, development trends.
Введение
Загрязнение окружающей среды веществами, обладающими антигенным воздействием на живой организм, ставят перед исследователями задачу разработки простых и специфических методов их определения, предназначенных, в первую очередь, для выявления и исследований загрязнений на уровне первой медико-санитарной помощи в полевых условиях [29]. Если большинство серологических тестов уже нашли свое применение в клинической и эпидемиологической диагностике, то иммунодиагностические методы исследования, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител, только начинают использоваться в санитарно-гигиенической практике [12, 13, 18].
Это объясняется как самой спецификой проведения анализа, обусловленной большим разнообразием задач по иммунодиагностике и индикации биологических объектов, так и отсутствием необходимых тест-реагентов для проведения иммунотестирования. При этом индикация антигенного загрязнения окружающей среды не может быть решена с помощью какого-либо одного универсального метода и требует целый набор разнообразных тестов, поскольку параллельное исследование с использованием нескольких независимых методик значительно повышает достоверность полученных результатов [22].
В связи с этим проблема создания комплекса методов для обеспечения иммунохимического тестирования в слабооснащенных медицинских учреждениях или во внелабораторных условиях стоит весьма актуально.
Целью настоящего исследования является анализ возможностей методов иммунодиагностики с применением фотографической регистрации результатов анализа и выявление тенденций развития бесприборных методов, основанных на специфическом взаимодействии антиген-антитело.
Материалы и методы
В работе использовали препараты пероксидазы хрена фирмы '^еалаТ' (Венгрия) с RZ = 0,6. При изучении механизма и кинетики пероксидазных реакций использовали пероксидазу НПО «Биолар» с RZ = 2,93,2 активностью 820 ед/мг.
Для определения точной концентрации перокси-дазы измеряли оптическую плотность водного раствора пероксидазы при Х403 нм и с учетом коэффициента молярного поглощения рассчитывали концентрацию пероксидазы по эмпирической формуле: С = 0,44 • А, где А - оптическая плотность раствора. Растворы с меньшей концентрацией пероксидазы готовили ежедневно разбавлением исходного раствора пе-роксидазы. Перекись водорода, ос.ч. использовали без дополнительной очистки.
Для приготовления буферных растворов применяли фиксаналы соответствующих веществ.
Иммуноферментные диагностикумы и реактивы для проведения иммуноферментного анализа были предоставлены в наше распоряжение лабораторией ИФА института биохимии им А.Н. Баха РАН и совместным Российско-Швейцарским предприятием 'ТОАплюс".
Концентрацию белка и пероксидазы в иммунопе-роксидазных конъюгатов контролировали спектро-фотометрически при Х230 нм и ^403нм.
Перед проведением анализа предварительно проверяли иммунологическую активность используемых препаратов методом двойной диффузии в геле [12]. В качестве носителей для иммобилизации антител использовали микроплаты для иммунологичес-кеих реакций с 96 лунками фирм "Dynatech", "Соокткшйй"" и «Медбиополимер» и пластиковые одноразовые пробирки. В работе использовали 0,05% и 0,2% растворы неионогенных детергентов: Тритон Х-100, Твин-80 и Твин-20, приготовленные на фос-фатно-буферной смеси (0,01 М фосфатный буфер рН7,4 и 0,15 М №СТ).
Растворы гидрохинона готовили растворением в теплой дистиллированой воде кристаллов дважды возогнанного гидрохинона.
Дистиллированная вода, используемая в работе, имела удельную электропроводность не более 0,2 мкСименс/см.
Липосомы получали многократной экструзией фосфатно-буферного раствора дипальмитоил-фосфа-тидилхолина (ДПФХ) через поликарбонатные мембранные фильтры с диаметром пор 100 нм и обращения фаз. «Нагрузку» везикул липосом маркером (пе-роксидазой или гидрохиноном) осуществляли методом озвучивания при 22 кГц в течение 40 минут. Комплемент-зависимый лизис липосом проводили в присутствии комплемента морской свинки («Имму-нопрепарат», Уфа) [9].
В работе использовали кварцевую, стеклянную и фторопластовую посуду, которую предварительно очищали концентрированной соляной и азотной кислотами (х.ч.) и тщательно промывали большими количествами деионизованной воды. Для приготовления эталонных растворов использовали мерную посуду 1 и 2 классов точности.
Отбор малых объемов жидкости (10-200 мкЛ) производили с помощью автоматических микродозаторов "Varipipette" (Польша) с погрешностью не более 2%.
Оптическую плотность растворов измеряли во времени на спектрофотометрах СФ-46 (ЛОМО, Санкт-Петербург) с использованием кварцевой кюветы с /=10,0 мм. Фотометрическая точность приборов составляла ±1% от величины оптической шкалы. Точность установки длины волны не менее ±0,3-0,4 нм.
В работе были использованы различные фотоматериалы отечественного и импортного производства (фотопленки, фотопластины, фотобумага). Оптическую плотность почернений на фотоматериалах оценивали визуально и с использованием микрофотометра МФ-2.
Интегральную засветку фотоматериала определяли с помощью люксметра Ю-116, путем расчета величины равной произведению освещенности, выраженной в люксах, на время экспозиции в секундах. Обработку фотоматериалов проводили обычным способом, описанным в руководствах по фотоделу [19].
Результаты и обсуждение Иммунохимическим методам тестирования посвящено большое число обзоров, монографий и других публикаций, в которых рассматриваются многообразные способы постановки и проведения анализов [7, 16, 24].
Формулирование требований, предъявляемых к упрощенным иммунотестам, показывает, что идеальный диагностический тест должен быть чувствительным, специфичным, воспроизводимым, экспрессным, простым и недорогим [29].
Анализ процедуры выполнения ряда простых им-мунодиагностических тестов показывает, что в настоящее время наиболее простыми являются пря-
мая агглютинация микроорганизмов и непрямая агглютинация частиц, покрытых, антигенами [12, 18]. Методы, основанные на использовании различных маркеров, позволяющих детектировать иммунохими-ческие взаимодействия, являются основными диагностическими тестами, поддающимися метрологической аттестации и стандартизации. При этом твердофазный иммуноферментный метод (ИФА) анализа, на наш взгляд, остается единственным из них, который может быть модифицирован для использования во внелабораторных условиях [20, 26].
Твердофазный ИФА, известный как ELISA, предусматривает использование твердой фазы - им-муносорбента, в качестве которого выступают 96-лучночные планшеты.
Известны различные варианты проведения твердофазного ИВА [10, 23], принципы которых приведены в таблице 1.
Как следует из таблицы, различные схемы проведения ИФА включают иммунохимическое взаимодействие антигена и специфических антител в присутствии конъюгатов - специально синтезированных антител/антигенов - фермент-маркеров, с последующим определением остаточной активности фермента (в большинстве случаев пероксидазы из хрен) связавшегося с твердой фазой иммуносорбента [14, 31, 33].
Таблица 1.
Варианты и принципы проведения твердофазного ИФА
Прямой ИФА На первом этапе реакции исследуемый образец фиксируют на твердой фазе. Затем к нему добавляют конъюгат. После удаления непрореагировавших компонентов реакции проводится ферментативная реакция, интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию исследуемых антигенов в образце и вообще говорит об их наличии в исследуемом материале.
Непрямой ИФА На твердой фазе иммобилизуют антиген, после инкубации исследуемого материала и удаления несвязавшихся компонентов добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам человека класса IgG, которые взаимодействуют с Fc-фрагментом к IgG. После проведения субстрат-ферментативной реакции проводят учет полученных результатов. При наличии антител уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных образцов.
Конкурентный метод К антигену, иммобилизованному на твердой фазе одновременно добавляют исследуемый материал и конъюгат. При проведении реакции меченые и исследуемые антитела конкурируют за активные центры антигена, иммобилизованного на твердой фазе. После завершения инкубации и удаления не прореагировавших компонентов проводится ферментативная реакция, результаты которой обратно пропорциональны количеству антител в исследуемом образце.
"Сэндвич"-ме-тод На твердой фазе адсорбированы антитела к исследуемому антигену. После инкубации исследуемого материала и образования комплекса «антитело — антиген» проводится удаление не-связавшихся компонентов, добавляется конъюгат, т.е. антитела к искомому антигену, меченые ферментом. По завершении инкубации, с последующим удалением непрореагировавшего ко-ньюгата промывкой, образуется комплекс, в котором антиген как бы заключен между двумя слоями антител. Наличие меченных ферментом антител определяется при помощи соответствующего субстрата.
Примерами детекции фермента-маркера могут являться визуальная регистрация результатов анализа путем сравнения с окрашенными эталонами [21,25], использование портативных фотометрических [32, 33] и электрохимических анализаторов [3] и некоторые другие.
Для бесприборной регистрации результатов твердофазного иммуноферментного анализа нами предлагается использовать фотографические преобразователи информации [1, 4, 5].
При этом фотоматериал можно использовать двояко: по прямому назначению, т.е. для регистрации квантов света и в качестве "сухого реагента", позволяющего детектировать изменение концентраций веществ, воздействующих на фотоэмульсионный слой, содержащий галогенид серебра, в ходе ферментативной решении.
Первый путь успешно реализован в иммунолю-минесцентном анализе [32,35] для чего остаточную
активность пероксидазы, связавшейся с иммуносор-бентом, определяли по индикаторной реакции перок-сидазного окисления производных люминола перекисью водорода:
HRP
LH2 + H2O2
L + 2 H2O + hv
где LH2 и L - восстановленные и окисленные формы люминола, соответственно; HRP - пероксидаза из хрена.
В результате реакции наблюдается свечение X ~ 490 нм, хорошо различаемое в темноте невооруженным глазом. При исходных концентрациях перекиси водорода 10-3 - 4 10-4 М и люцеферина 10-4 М, при которых наблюдалась максимальная скорость реакции, свечение развивалось уже на 2-3 минуте после начала реакции. В качестве детектора использовалась "сухая" фотопластинка фирмы "Polaroid" с чувствительностью 20000 ед ASA. В ходе анализа, подготовленный для регистрации иммуноферментных реакций планшет с 96-ю лунками помещали в камеру фотоап-
парата "Polaroid" с предварительно вставленной фотопластинкой таким образом, чтобы светочувствительная поверхность фотопластинки была обращена к открытой поверхности планшета-иммуносорбента. Фотоматериал экспонировали 3-4 минуты, затем "сухая" пластинка извлекалась и полученное на ней изображение сопоставлялось с градуировочной шкалой [7, 8].
Второй путь использования фотоматериала в качестве "сухого" реагента основан на том, что многие каталитические процессы с участием оксидоредук-таз, в частности пероксидазы, сопровождаются изменением концентрации веществ, способных вступать в окислительно-восстановительные реакции с галоге-нидами серебра в экспонированном квантами света фотоэмульсионном слое [1, 27, 28].
В таблице 2 приведены вещества, участвующие в каталитических окислительно-восстановительных реакциях и одновременно являющихся проявляющими агентами в растворах, используемых в фотоделе [9].
Таблица 2.
Вещества, используемые в фотографии, которые могут являться субстратами в пероксидазном анализе
HaiCVl ÖK4SSH НС Структурная HpAU Ензуалънв епрЕпялле^сзл
формула k] 10J lea- SdHH. кокиттраш HfiP. нгло
Гн^разшзиэн Ф soo 2 12
Резсршш иэ^^ян 20 40-50
р — Крезол ф 42 00 1000 20 SO
Пирогаллол "тУ SOO 30 95
Фенол Ó <>00 20 20-30
о-Фекгаашгашн Н;Н 23000 - 6 25
Асхорбинвв» кислота tlCK,_^он O^fr^CHOH ¿HpH 200 26 20 190
Метод CK¡ NH ■ í HjSO, 0 OH 15 SO
Ггшпим ^^ÍBÜI - - 10 190
Фенилеы Он ó ■ ■ 10 90
—>
Как следует из количественных данных, приведенных в таблице, гидрохинон имеет невысокие ка-
талитические параметры, но обладает лучшим проявляющим действием. Поэтому, взяв его в качестве субстратной реакции для определения активности
пероксидазы, целесообразно рассмотреть физико-химические процессы с участием ферментативной и фотохимической реакций.
То есть в процессе ферментативного окисления гидрохинона перекисью водорода его концентрация в растворе убывает, пропорционально активности пе-роксидазы, и после нанесения капли раствора на поверхность сенсибилизированного фотоматериала интенсивность почернения будет меньше, чем при нанесении на него раствора с исходной концентрацией гидрохинона.
Химия процесса проявления Видимое фотографическое изображение образуется в результате усиления скрытого изображения в процессе проявления фотоматериала. Коэффициент усиления этого процесса достигает 106 - 109 [17].
+ 2AgBr
На этой стадии одна молекула гидрохинона восстанавливает два атома серебра, окисляясь до хи-нона. Образующийся хинон реагирует с сульфитом
Развитие теоретических представлений о механизме образования скрытого изображения в значительной мере способствовали работы Чибисова и Митчелла [30].
В основу теории получения скрытого изображения положена гипотеза образования свободного серебра, но в виде включенных в микрокристаллы зародышей, вызывающих рост светочувствительности.
Схематически этот процесс может быть представлен следующим образом: квант света, попадая на кристалл галогенида серебра, выбивает электрон из иона галогенида. Электрон движется внутри кристаллической решетки до тех пор, пока не попадет на центр светочувствительности. На центре светочувствительности образуется атом серебра, что увеличивает степень дефекта участка кристалла, что, в свою очередь увеличивает вероятность захвата последующего электрона, выбиваемого другим квантом света [11].
nAg+ + ш- ^ nAg0
Реакция проявления гидрохиноном бромида серебра может быть представлена следующим образом:
. 2Ag + 2НВг +
О
натрия, давая натриевую соль моносульфогидрохи-нона:
ОН
,8О3Ыа
+ №2803 + Н20 =
+ №0Н
ОН
Моносульфогидрохинон в свою очередь способен восстановить еще два атома серебра, окисляясь до моносульфохинона:
ОН
,8О3№
+ 2AgBr
,8О3№
2Ag + 2НВг +
О
О
О
О
ОН
О
Моносульфохинон, реагируя с сульфитом натрия, образует дисульфогидрохинон:
ОН
ОН
,8О3Ыа
,8О3№
+ №2803 + Н20 = ЫаО38'
+ №0Н
ОН
ОН
На этом процесс заканчивается, так как дисуль-фогидрохинон уже не в состоянии восстановить бромид серебра до серебра.
Образующаяся в результате этих превращений бромистоводородная кислота нейтрализуется щелочью, содержащейся в растворе:
ОН
4AgBr +
Л
4НВг + 4№0Н = 4МаВг + 4Н2О
Тогда суммарный процесс может быть представлен следующим стехиометрическим уравнением:
ОН
,8О3№
+ 2№2803 + 2№0Н = 4Ag + 4№Вг + 2Н20 +
МаО38'
ОН
ОН
Таким образом, становится очевидным, что одна молекула проявителя - гидрохинона в присутствии сульфита натрия способна восстановить четыре атома серебра.
В ходе ферментативной реакции гидрохинон расходуется и, следовательно, во вторую, фотохимическую реакцию его вступит меньше
ОН
+ 2AgBr
ОН
. 2Ag + 2НВг +
О
О
После проявления пятна, интенсивность почернения которого обратно-пропорциональна активности пероксидазы, фотоматериал промывают и фиксируют обычным способом:
№28203 + 2А£Вг ^ Ag2S2Oз + 2 МаВг
Фотометрируя пятна можно определить активность пероксидазы в исследуемом образце.
Исследование кинетики ферментативного окисления гидрохинона показало, что при концентрации перекиси водорода более 10-3 М наблюдается инги-бирование процесса, и порядок реакции по перекиси водорода -1, при концентрации Н2О2 менее 10-3 М порядок реакции близок к 0, что объясняется конкурентным окислением растворенным кислородом.
Порядок реакции по гидрохинону равен 1 во всем изученном диапазоне концентраций (10-4-5 10-2 М)
[2]. С той целью, чтобы предотвратить окисление гидрохинона растворенным кислородом в реакционную смесь вводили сульфит натрия. Таким образом, мы получили реакционную смесь, по составу близкую проявляющей смеси, используемой в фотографическом деле. Поэтому дальнейшие исследования проводились с использованием фенидон-гидрохино-нового проявителя.
Для проведения анализа в лунки с иммобилизованным иммунопероксидазным комплексом вводили 100 мкл 3 10-3 М Н2О2 и 100 мкл раствора фенидон-гидрохинонового проявителя разбавленного дистиллированной водой в соотношении 1:5. Через 20 минут по 20 мкл смеси с помощью многоканального пипе-точного микродозатора наносили на поверхность сенсибилизированного квантами света фотоматериала. По мере появления темных пятен (1,5-2 мин) фо-
томатериал промывали и закрепляли раствором, содержащим тиосульфат натрия. Интенсивность почернения пятен коррелирует с актвиностью перокси-дазы.
На рис.1 (см. таблицу 3) приведена градуировоч-ная шкала для определения концентрации перокси-
дазы. Минимально определяемая визуально концентрация пероксидазы около 2 нг/мл. С помощью мик-рофотометрирования возможно обнаружение 0,6 нг/мл.
В таблице 3 приведены значения интенсивности почернений пятен, полученных с помощью микрофотометра МФ-2.
Таблица 3.
Результаты измерения интенсивности почернений на фотоматериале при различных концентрациях
пероксидазы
Концентрация пероксидазы HRP, нг/мл Фотограмма Интенсивность почернений, S ед.
280,0 36 ± 4
140,0 55 ± 3
70,0 • 71 ± 2
35,0 ф 93 ± 3
17,5 ф 103 ± 4
9,0 ф 118 ± 6
4,5 128 ± 6
2,2 131± 6
1,1 * 134 ± 8
0,6 • 138 ± 8
Фон • 141 ± 8
Плотность вуали * 23 ± 3
Рисунок 1. Калибровочный график для определения пероксидазы (HRP) в полулогарифмических координатах
Разработанный метод детекции пероксидазы был нами апробирован на некоторых биологических объектах. В качестве контрольного метода использовали спектрофотометрический метод определения пероксидазы с использованием хромогенных субстратов: 5-аминосалициловой кислоты (5-АС) и TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) из коммерческих диагностических наборов совместного российско-швейцарского предприятия «DIA-плюс».
В процессе исследований была определена пе-роксидазная активность биологических жидкостей: слюна, сыворотка крови, в экстрактах растений (редис, помидоры, картофель, корни и листья хрена, огуречная кожура), в иммунопероксидазных конъ-югатах (L-аспарагиназа - HRP, антитела к хориого-надотропина человека (ЧХГ), антитела против IgG-HRP [4].
Для определения пероксидазы в слюне и экстрактах растений, отобранные образцы подвергали центрифугированию на холоду в течение 25-40 минут при 12000 об/мин. Затем из центрифужных пробирок отбирали раствор и разводили его дистиллированной водой в зависимости от ожидаемой концентрации пе-роксидазы в 50-100 раз (иммуноферментные конъ-югаты разводили в 500-1000 раз).
Определение пероксидазной активности биопрепарата проводили как описано в предыдущем параграфе при построении градуировочной шкалы на пе-роксидазу, беря вместо модельного раствора перок-сидазы анализируемый раствор.
В таблице 4 представлены результаты определения пероксидазной активности в различных биопрепаратах.
В ходе исследований была рассмотрена возможность определения загрязнения окружающей среды ядохимикатами, некоторые из которых относятся к гаптенам, по ингибированию пероксидазы в реакции гидрохинон-перекись водорода. Было установлено, что пестициды, относящиеся к фосфорорганической группе: БИ-58, бутифос уже в разведении 1:2000 ин-гибирует пероксидазу с начальной активностью, соответствующей 25-30 нг/мл пероксидазы. Это при условии отработки методики взятия и отбора пробы позволяет определять остаточное количество ядохимикатов в смывах листьев и плодов растений, подвергнутых обработке пестицидами.
Полученные результаты позволяют допустить, что такой способ фотографической детекции и диагностические тест-системы на его основе могут быть использованы в иммуноферментном анализе. Из приведенных результатов следует, что наибольшее изменение оптической шкалы на пероксидазу наблюдается в диапазоне концентраций пероксидазы 2004,5 нг/мл, т.е. 510-9 - 10-10 М.
Учитывая стехиометрию взаимодействия меченого и немеченного антигенов с антителами в схеме конкурентного ИФА можно предположить надежное тестирование антигена в диапазоне 10-9-10-10 М. [10]. Этот диапазон соответствует большому числу используемых иммунотестов, например, для определения ]£в, гонадотропных гормонов, антител к лепре, эхинококку, лейшманиозу, малярии, вирусам сель-ско-хозяйственных культур, которые можно рассматривать как антигенные загрязнители окружающей среды [15].
Таблица 4.
Результаты определения пероксидазной активности некоторых биопрепаратов (Р=0,95; n = 5)
Активность HRP, мкг/мл
Биопрепарат Фотографический метод Спектрофотометрический метод
Хср. Sr 5 - АС ТМБ
Слюна здоровых 1,2 0,21 1,42 ± 0,07 0,90 ± 0,01
доноров
Слюна больных
инфарктом миокарда
Сыворотка крови 0,9 0,22 1,16 ± 0,22 1,28±0,14
Сыворотка крови
больных инфарктом 1,32 0,22 1,48 ± 0,16 1,56 ± 0,14
миокарда
Иммуноферментные конъюгаты:
Ь-аспарагиназа-HRP 100 - 160 - - -
антитела к ЧХГ -HRP 130 - 200 - - -
антитела к IgG человека-HRP 22,7 - 40,5 - - -
Сок растений:
алоэ 0,2 - 0,5 0,21 0,4 - 1,0 0,3 - 0,8
виноградный 0,1 0,05 0,2 -
огуречный 1,6 - 4,2 - - 3,8 - 5,4
картофеля 1,1 0,135 1,6 1,4
томатный 1,2 - 6,0 0,35 - 2,4-8,6
Экстракты:
хрена 4,6 - 12 - 8,0 - 12 8,4 -10,0
кожуры огурцов 1,5 - 2,04 - 1,3 - 1,8 1,0-1,2
тыква 0,3 - 0,29 0,15
баклажан 1,25 - 1,16 0,94
укроп 1,17 - 2,1 1,6
кинза 0,16 - 0,44 0,48
Следует отметить, что модификация этого способа определения пероксидазной активности может привести к созданию диагностических полосок для качественного определения ряда биологически-активных веществ [6].
К недостаткам гетерогенного ИФА, в первую очередь, следует отнести длительность его проведения, что, в свою очередь, затрудняет его использование в экспресс мониторинге загрязнения окружающей среды. Техника же гомогенного иммуноанализа сложна и требует разделения прореагировавших с антителами меченного и немеченного антигенов. В связи с этим нами рассмотрена возможность определения антигенов ИФА-методом с помощью маркеров, включенных в липосомы.
Липосомный иммуноанализ можно подразделить на две группы: не зависящие от комплемента и зависящие от комплемента [34].
В этих методах антитела (антигены) ковалентно связывают с полярным липидом, например с фосфа-тидилэтаноламином. Затем этот конъюгат вводят в состав мембраны при получении липосом, содержащих молекулы фермента. Когда специфические антитела против лиганда образуют иммунологический комплекс с лигандом на поверхности липосомы,
наблюдается лизис, усиливаемый системой комплемента. Принцип метода проиллюстрирован на рисунке. 2.
Как видно из рисунка, свободный антиген конкурирует со связанными за антитела. Лизис липосом происходит в результате активации комплемента антителами, присоединившимися к их поверхности. При этом происходит высвобождение маркера, в нашем случае, гидрохинона или пероксидазы, которую определяют вышеописанным способом.
Иммуноанализ на основе комплемента обладает 3-мя основными недостатками [34]:
1. При получении липосом нужно строго нормировать содержание препарата, придающего им чувствительность к лизису. При этом наблюдается самопроизвольный лизис.
2. Для лизиса липосом необходимо сравнительно большие количества дорогостоящего комплемента.
3. Активация комплемента наблюдается через сравнительно большое время, приблизительно 20 минут, что отражается на экспрессности анализа в целом.
Эти недостатки могут быть устранены, если использовать липосомный иммуноанализ на основе цитолизина [320]. Схема этого иммуноанализа представлена на рисунке. 3.
Рисунок 2. Схема иммуноанализа с использованием липосом, содержащих маркер и системы комплемента. Свободный антиген Агсвоб. конкурирует со связанным Агсвяз. за антитела Ат. Лизис липосом происходит в результате активации комплемента антителами, присоединившимися к их поверхности
Рисунок 3. Схема иммуноанализа с помощью маркера, включенного в липосомы, без использования системы комплемента. Свободный антиген конкурирует с конъюгатом (определяемое вещество -цитолизин) за связывание с антителами. При образовании комплекса с антителами конъюгат теряет
способность разрушать липосомы
Свободный антиген конкурирует с конъюгатом (антиген-цитолизин) за связывание с антителами. При образовании комплекса с антителами происходит ингибирование конъюгата и он теряет способность разрушать липосомы.
Важное преимущество этого метода состоит в том, что одни и те же липосомы можно использовать с разными конъюгатами, в частности, цитолизин-гап-тен.
Для реализации предложенной нами системы фотографической детекции водное пространство липосом нагружается или непосредственно гидрохиноном, либо же пероксидазой хрена.
Возможности описанного здесь метода в настоящее время ограничены в виду того, что в продаже еще нет наборов для анализа с помощью липосом,
нагруженных ферментами. Это объясняется, малодоступностью исходных веществ и сложностями крупномасштабного производства устойчивых к самопроизвольному лизису липосом. Тем не менее, очевидно, что отмеченные трудности могут быть преодолены и метод получит распространение в практической медицине и экологии.
Повышение чувствительности и селективности иммунометрических методов контроля антигенных загрязнений может быть осуществлено благодаря применению моноклональных антител. При появлении банка клонов и их рассылки становится реальным получить моноклональные антитела в необходимых количествах практически в любой лаборатории и провести стандартизацию иммунодиагностических тестов. Система фотодетекции позволит применить
№ 1 (31)
иммунодиагностические тесты для оценки антигенного загрязнения окружающей среды с целью разработки мероприятий по ее оздоровлению.
Выводы
Проведенные исследования привели к следующим выводам:
1. Определение пероксидазной метки с помощью фотографических преобразователей информации, используемых в качестве «сухого» реагента с предварительной сенсибилизацией квантами света, отличается хорошей чувствительностью, специфичностью
январь, 2017 г.
и простотой и может быть положено в основу регистрации результатов иммуноферментного анализа биологически активных веществ.
2. Формат использования твердофазного ИФА и липосомного иммуноанализа в определении антигенного загрязнения окружающей среды с фотографической детекцией способствует расширению аналитических возможностей бесприборных тест-методов иммунодиагностики.
Список литературы:
1. А.с. СССР N° 1439506. Способ определения оксидоредуктазной активности ферментов и иммуноферментных конъюгатов / Д.М. Аронбаев, В.И. Криворучко, М.В. Симонова, Н.И. Аронбаева, С.Д. Варфоломеев // Б.И. -1988. - №43.
2. Аронбаев Д.М. Кинетика пероксидазного окисления гидрохинона перекисью водорода // Молодой ученый. -2015. - № 15(95). - ч. 1. - С.36-45.
3. Аронбаев Д.М. Разработка принципов амперометрической детекции в твердофазном иммуноферментном анализе // Автореф. дисс...канд. хим.наук. - М.: 1987, 24с.
4. Аронбаев Д.М. Фотографические преобразователи информации в био- и иммуноанализе (монография) / Lambert Academic publishing (LAP), 2015. - 62 с.
5. Аронбаев Д.М., Варфоломеев С.Д., Криворучко В.И., Симонова М.В. Применение фотоматериалов в качестве «сухого реагента» для определения пероксидазной активности биопрепаратов // Мед.техника. 1990. -№1.- С.39-40.
6. Аронбаев Д.М., Насимов А.М., Аронбаев С.Д., Кабулов Б.А. Тест- системы для индикации реакций, катализируемых пероксидазой // Тез.докл II съезд Аналитика России 23-27 сентября 2013 г. Москва. - С.153.
7. Власенко С.Б., Гаврилова Е.М. Научные основы и перспективы применения в иммунохимических методах анализа хеми- и биолюминесцентных реакций // Ж. Всесоюз. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1989. -С.24 -29.
8. Гаврилова Е.М. Люминесцентный иммуноанализ // Биотехнология. Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР. М., 1987.- С.6-55.
9. Гендриксон О.Д. Изучение количественных закономерностей взаимодействия антител с низкомолекулярными антигенами, иммобилизованными на поверхности липосом // Автореф. дисс.....канд. хим. наук. - М.:
2003, 25 с.
10. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. -М.: Высш. школа, 1991. - С. 3-8, 202-203.
11. Журба Ю.И., Шпольский М. Фотографические процессы и материалы. Изд.-е второе. - М.: Высшая школа, 1988. - 176 с.
12. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Под ред. Т.В. Перадзе, Б.П. Халонена. Совм. изд.-е СССР-Финляндия. - М.: Медицина, 1985. - 302 с.
13. Иммунологические методы исследования / Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. - М.: Мир, 1988. - 528 с.
14. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Т.Нго, Г.Ленхоффа. - М.: Мир, 1988. - 466 с.
15. Иммуноферментный анализ и его применение в инфекционной патологии. / Под ред. В.И. Покровского, Е.П. Голубинского. - М.:, 1986.
16. Иммунохимический анализ./ Под. ред. Л.А. Зильбера. -М.: Медицина, 1968. - С.52.
17. Картужанский А.Л., Красный-Адмони Л.В. Химия и физика фотографических процессов. - Л.: Химия, 1983. -С.40.
18. Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. — Медицинское информационное агентство, 2009.
19. Красный-Адмони Л.В. Малосеребряные фотографические материалы и процессы их обработки. - Л. : Химия, 1986. - 168 с.
20. Литчфилд У. Дж., Фрейстат Дж.У. Иммуноанализ с помощью ферментов, заключенных в липосомы. В кн.: Иммуноферментный анализ. - М.: Мир, 1988. - С.122-129.
21. Пат. РФ 2325644. Способ проведения клинического и биохимического анализа биологических жидкостей. / Венгеров Ю.Ю., Барский В.Е., Волощук С.Г., Егоров Е.Е., Туголуков А.Е., Кутвицкий В.А., Мартынкина Л.П., Зайко В.В., Черных В.С., Старовойтова Т.А., Стериополо Н.А., Калачева О.С. // Бюл. 2008, №15 от 27.05.2008
22. Полтавченко А.Г. Бесприборная иммунодиагностика инфекционных заболеваний на основе высокодисперсных корпускулярных маркеров./ Автореф.. ..доктора биологических наук. - Кольцово, 2008. 49 с.
23. Самойленков П.В. Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике. - М.: РГМУ, 2009.
24. Справочник «Медицинская лабораторная диагностика» / Под ред. А.И. Карпищенко. - С-Пб.: «Интермедика», 1997. - 180 с.
25. Старовойтова Т.А. Видеоцифровая регистрация для иммунологических и биохимических исследований в практике клинической лабораторной диагностики // Автореф. дис. ... д-ра мед. наук . -М.: ГОУ «РГМУ» Росздрава, 2010. — 36 с.
26. Терешкина Н.Е., Терехова И.В., Сырова Н.А., Девдариани З.Л., Ляшова О.Ю., Григорьева Г.В., Лобовикова О.А., Шульгина И.В., Иваненко И.Л., Захарова Н.Б., Г.А.Безрукова Г.А., Спирин В.Ф. Конструирование и медицинские испытания моноклональной дот-иммуноферментной тест-системы для детекции туляремий-ного микроба «ДИАТул-М» // Проблемы особо опасных инфекций, вып. 2, 2013. - С.42-45.
27. Угарова Н. Н. Применение ферментов в химическом анализе //Введение в прикладную энзимологию. Учебное пособие / Под ред. И.В. Березина, К. Мартинека. - М.: МГУ, 1982. - 384 с.
28. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применение. - М.: МГУ, 1981. -66 с.
29. Упрощенная иммунодиагностика: выводы и рекомендация совещания ВОЗ. Материалы совещания рабочей группы консультативного комитета ВОЗ по медицинским исследованиям. - Женева, 1983.
30. Чибисов К.В., Шеберстов В.И., Слуцкин А.А. Фотография в прошлом, настоящем и будущем. - М.: Наука, 1988. - 174 с.
31. Avrameas S., Goilbert B. Enzyme-immunoassay for the measurement of antigen using peroxidase conjugates // Bio-chemie.-1972.-V.51, #3. - P.837-842.
32. Bunce R.A., Thorpe G.H.G., Gibbson J.E.C., Killeen P.R., Ogden G., Krichka L.J., Whitehead T.P. Camera lumi-nometer for use with luminescent assays // Analyst. - 1985. - v.110. - P. 657-663.
33. Gan S.D., Patel K.R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay // J. Invest Dermatol. - 2013 sep. - Vol. 133 (9). - P. 12.
34. Monroe D. Liposome imunoassay. Immunoassay technol. Vol.2. - Berlin: N.-Y., 1986. - 187 p.
35. Pat. EP 0437013 A2 Luminescent assays / D.F. Smith, R.O. Mccann, 1989.
