CC BY
43
MOLEKULYARNAYA DIAGNOSIS OF GENETIC POLYMORPHISM OF GENES CANDIDATES MILK PRODUCTIVITY ON PRIMERED PLEMZAVOD "DAWN" KUKMOR REGION OF THE REPUBLIC OF TATARSTAN
Yulmetyev Y. R., Shakirov W. K., Akhmetov So M Summary
An overview of promising genetic markers productivity of animals shows the feasibility of a wider introduction of DNA markers in animal practice. The advantage of DNA markers is that you can determine the genotype of the animal regardless of sex, age and physiological state of individuals that can significantly improve the efficiency of breeding efforts and, consequently, the output of livestock products.
УДК 619:616.98:578.833.31
РАЗРАБОТКА АНТИГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО КОНЪЮГАТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
МЕТОДОМ ИФА
Юсупова Г.Р. - д.б.н., доцент, *Юсупов Р.Х. - д.в.н., профессор, зав. отделом Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана *Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности,
г.Казань, тел.: (843) 273-96-56
Ключевые слова: классическая чума свиней, иммуноферментный анализ, антитела, антиген.
Key words: classic swine fever, immune and enzyme analysis, antibody, antigen.
Классическая чума свиней (КЧС) -это высококонтагиозное вирусное заболевание, которое является предметом особого контроля государственных и ветеринарных служб во всем мире [5, 6, 2]. Диагностика КЧС осуществляется на основании выявления антигена и антител. Для определения вирусоспецифических антител существуют различные варианты непрямого и прямого сэндвич ИФА, которые используют антивидовые антитела, меченые ферментом. Но эти методы многостадийны, имеется узковидовая зависимость, требуется значительное время (18-20 часов) для анализа и из-за повышенного фона оптической плотности двойных антител снижается
чувствительность метода [3, 1, 7, 8].
Целью нашей работы являлась усовершенствование тест-системы на основе ИФА для выявления вирусоспецифических антител в сыворотке крови свиней с использованием безопасного в инфекционном отношении аттенуированной вирусовакцины ЛК-ВНИИВВиМ.
Материалы и методы. Для
получения специфического антигенного конъюгата использовали вирусвакцину против чумы свиней ЛК-ВНИИвВиМ из штамма «К» (ТУ46-21-796-78) и фермент периоксидазы из корней хрена производства Великобритании.
Для конъюгирования антигена вируса КЧС с ферментом проводили активирование углеводных остатков фермента пероксидазы до альдегидных форм периодатным методом по M.Wilson, P. Nakane (1978). К раствору активированного фермента (20 мг/мл) добавляли различные концентрации от 10 до 50 мг белка культурального вакцинного вируса КЧС. Для оптимальной конъюгации и восстановления иминовой связи добавляли боргидрит натрия. Все условия, необходимые для оптимального
соотношения фермента и вирусного белка в конъюгате найдены опытным путем.
Испытание полученного конъюгата фермента с антигеном вируса КЧС проводили прямым ИФА в модификации Г.Ф. Ильясовой и др. (2003), в основе
которого лежит прямая иммобилизация антител на полистириловых планшетах (без предварительного адсорбции антигена) и выявление их с помощью антигенного пероксидазного конъюгата вместо антивидового меченного пероксидазой глобулина.
Титром диагностического конъюгата считали то максимальное его разведение которое еще выявляло специфические антитела в наивысшем разведении сыворотки. Визуально результат учитывали по разнице окраски субстрата в лунках, содержащих специфические антитела к вирусу КЧС, в сравнении с окраской субстрата в лунках с отрицательными (гетерологичными) сыворотками.
При инструментальном учете результат реакции считали положительным, если отношение оптической плотности субстрата со специфическими сыворотками к вирусу КЧС к оптической плотности субстрата с отрицательными составляет 2,1 и больше.
Результаты исследований.
Полученными данными показана принципиальная возможность
конъюгирования специфического антигена вируса КЧС с ферментом пероксидазой. Конъюгированный ферментом антиген
вируса КЧС выявлял антитела как у крыс, так и у свиней, вакцинированных против КЧС.
В дальнейшем наряду с определением рабочего разведения (активности) антигена, меченного фермента, проводились испытания его специфичности при исследованиях сыворотки крови разных видов животных, полученных к разным возбудителям. Постановку ИФА проводили прямым ИФА, учет - инструментально, как описано выше.
Использование универсального
диагностикума - меченого нами фермантом антигена, именуемого «Антигенный пероксидазный конъюгат» позволяло выявить антитела с высоким коэффициентом специфичности,
достигающим 3,4 и 7,0, тогда как при исследовании гетерологичных антител к возбудителям бешенства, лихорадки Ку этот коэффициент не превышает 1,2.
Для сравнительной оценки ИФА в приведенной выше модификации с тремя другимивариантами метода были использованы прямой, непрямой «сэндвич» ИФА и модифицированный прямой «сэндвич» ИФА. Результаты исследований представлены в табл.1.
Различные варианты ИФА Антитела к возбудителю КЧС Антитела (контрольные) к вирусу бешенства
крыс свиней мышей овец
1. Прямой ИФА в описанном модификации (прямая иммобилизация испытуемых сывороток + меченый ферментом антиген) Время анализа 2 ч. 1:640 1:3200 - -
2. Непрямой «сэндвич» ИФА (иммобилизация антигена + испыт.сыв. + антивидовые меченые антитела) Время анализа 18-20 ч. При наличии антивидовых антител к ^О каждого вида
1:160 1:80 - -
3. Прямой «сэндвич» ИФА (иммобилизация антигена + испыт. Сыв. + меченый ферментом антиген) Время анализа 18-20 ч. 1:160 1:160 - -
4. Модифицированный прямой «сэндвич» ИФА (иммобилизация антивидовых антител + испыт. Сыв. + меченый ферментом антител) Время анализа 18-20 ч. При наличии антивидовых антител к ^О каждого вида
1:160 1:160 - -
Таблица 1 - Результаты сравнительного испытания различных модификаций ИФА
Как видно из таблицы, все представленные и испытанные варианты ИФА позволяли выявлять прививочные антитела в сыворотке крови вакцинированных против КЧС животных. При этом отмечено, что изготовленный нами антигенный пероксидазный конъюгат обладает универсальностью, то есть с применением этого конъюгата можно выявлять антитела у всех видов вакцинированных животных, не прибегая к антивидовым сывороткам. При этом упрощается постановка реакции, сокращается стадийность и время анализа с 20 до 2 часов. Наряду с этим в сравнительных исследованиях меченый антиген оказался наиболее активным по сравнению с вторичными антителами в 2-4 раза, что позволило применять тест-систему прямого ИФА как перспективное средство иммунодиагностики.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бъядовская, Р.П. Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики классической чумы свиней с исследованием рекомбинатного белка Е2 /О.П. Бъядовская, С.В. Безбородова, А.А. Луговской, В.Г. Андреев //Труды Международной научно-практической конф., посвященной 45-летию ВНИИВВиМ. -Покров. -2003. -Ч.П. -С.471-486.
2. Иванов, А.В. Классическая чума свиней /А.В. Иванов, Р.Х. Юсупов //В монографии «Инфекционные болезни свиней (Этиология, эпизоотология, диагностика, профилактика) -М.-ФГНУ «Росинформагротех». -2006. -С.8-17.
3. Ильясова, Г.Ф. Оценка диагностической эффективности ТФ - ИФА на основе меченного антигена вируса болезни Ауески (псевдобешенство) /Г.Ф. Ильясова, А.П. Цибулькин, В.С. Угрюмова,
Д.Н. Латфуллин, Г.Х. Ильясова //Труды Международной научно-практической конф., посвященной 45-летию ВНИИВВиМ. -Покров. -2003. -Ч.П. -С.467-471.
4. Куриннов, В.В. Средство и методы дифференциальной лабораторной диагностики классической чумы свиней /В.В. Куриннов //Вестник РАСХН, 1999. -№3. -С.55-59.
5. Куриннов, В.В. Сравнительное исследование напряженности иммунитета против классической чумы свиней промышленных комплексов /В.В. Куриннов //Ветеринарная газета. -2003. -№10. - С.7.
6. Непоклонов, Е.А. Разработка препаратов нового поколения для диагностики и профилактики классической чумы свиней /Е.А. Непоклонов //Тез. докл. Всеросс. научн. -произв. конф. -Ставрополь, 2000. -С.57-60.
7. Юсупова, Г.Р. Разработка метода иммуноферментного анализа для обнаружения специфических антител к вирусу классической чумы свиней /Г.Р. Юсупова //Ветеринарный врач. - Казань, 2009. -№1. -С.28-30.
8. Юсупова, Г.Р. Изготовление и испытание иммуноферментных и иммунофлуоресцентных конъюгатов для выявления антигена вируса КЧС методами ИФА и МФА в патологическом материале /Г.Р. Юсупова, Г.Ф. Кабиров, Р.Х. Юсупов, Г.Х. Ильясова //Ученые записки Казанской госакадемии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. -2012. -Т.209. -С.352-356.
9. Wilson, M.B. Recent development in the periodate method of conjugating peroxidase (HRPO) to antibodies /M.B. Wilson, P.K. Nakane //Immunofluorescence and related straining technigues. -North-Holland. Biomedikal Presse. -1978. -P215-244.
РАЗРАБОТКА АНТИГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО КОНЪЮГАТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ МЕТОДОМ
ИФА
Юсупова Г.Р., Юсупов Р.Х.
Резюме
Использование конъюгата на основе метки антигена вируса КЧС с ферментом пероксидазы позволяет модифицировать и упростить технику прямого ИФА для быстрого скрининга эффективности вакцинации. При этом чувствительность метода повышается в 2 -4 раза при сокращении времени анализа с 18 часов до 2-3 часов.
Усовершенствованный метод иммуноферментного анализа является высокоэффективной тест-системой для оценки вакцинопрофилактики КЧС.
WORKING OUT OF ANTIGENIC IMMUNO-ENZYMIC CONJUGATE IN ORDER TO DETECT ANTIBODIES TO CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS BY ELISA METHOD
Yusupova G.R., Yusupov R.Kh.
Summary
The use of the conjugatebased onCSF virus antigen label with the peroxidaseenzyme allows to modify and to simplify the direct ELISA technique for rapid screening of vaccinationeffectiveness. The sensitivity of the method increases to 2-4 times when reducing analysis time from 18 hours to 2-3 hours.
An improved method for immuno-enzymicassay is a highly effective test- system for evaluation of CSFvaccine prevention.
УДК: 614.95+636.5.033
ЗООГИГИЕНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ
АКТИВИРОВАННОЙ ВОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ДЛЯ ФЕРМЕНТИРОВАНИЯ КОРМОВ, В БАЛАНСОВЫХ ОПЫТАХ
*Ямаев Э.И. - соискатель; Софронов В.Г. - д.в.н., профессор, зав. кафедрой;
Данилова Н.И. - д.б.н., доцент *ООО «ИнвестАгро» Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана
тел.: (843) 273-97-75
Ключевые слова: активированная вода, высокотемпературная ферментация, полиферментный препарат, цыплята-бройлеры, переваримость и усвояемость питательных веществ кормов.
Key words: the activated water, a high-temperature fermentation, weed a fermentable preparation, broilers, digestibility and comprehensibility of nutrients of forages.
Использование ферментных
препаратов в птицеводстве достаточно широко, что связано с необходимостью внесения в состав зерновых кормов с достаточно большим количеством антипитательных веществ, нарушающих процессы пищеварения, снижающих и повышающих затраты кормов, а также несовершенством ферментной системы органов пищеварения у птиц, поскольку в их организме отсутствуют
соответствующие ферменты [11]. Однако, в настоящее время, в этой отрасли животноводства используются в основном импортные ферментные препараты, в связи с чем, использование отечественных разработок имеет большое значение. Кроме того, перед нами стояла задача изучить возможность использования
полиферментного препарата в сочетании с активированной водой.
Материалы и методы. Опыт по изучению биологического действия
полиферментного препарата «НИСТ», используемого в сочетании с активированной водой был проведен на птицефабрике «Ак Барс Пестрецы», с использованием цыплят-бройлеров кросса «ISA», разделенных на четыре группы, в каждой из которых было отобрано по 100 цыплят суточного возраста, одинаковой живой массой 45 г. Опытные и контрольные группы формировались по принципу аналогов с учетом живой массы и физиологического состояния
Цыплятам третьей и четвертой опытных групп в качестве питьевой воды и для разведения комбикорма задавали активированную воду, в то время как в первой и второй контрольным группам для этих целей применяли обычную водопроводную воду. Корм для второй и четвертой группы, готовили следующим образом: в емкость наливали соответственно водопроводную или активированную горячую (50-60°С) воду в
