CC BY
49
Применение фотографической детекции в иммуноферментном определении р-субъединицы хориогонадотропина человека
Аронбаев Д. М., Васина С. М.
Предлагается система фотографической регистрации результатов иммуноферментного определения р-субъединицы хориогонадотропина человека в биологических жидкостях с использованием коммерческих наборов ЗАО «ДИАплюс» для ранней диагностики беременности и контроля за ее протеканием. Показана возможность использования этой системы, позволяющей определять до 0,6 нг/мл пероксидазы — ферментной метки, для вариантов тест-наборов «бета-ХГч-ЭкспрессИФА» и «бета-ХГчИФА» для определения хориогонадтропина в моче и сыворотке крови, соответственно.
Полученные результаты находятся в соответствии с результатами, получаемыми радиоиммунологическим методом. Сравнительный анализ определения р-ЧХГ в сыворотке крови иммуноферментным методом с использованием спектрофотометрической и фотографической регистрацией показывает удовлетворительную корреляцию : R2 = 0,9363.
The system of photographic registration of results im-munoenzyme definitions p-HCG in biological liquids with use of commercial sets of Joint-Stock Company «DIAplus» for early diagnostics of pregnancy and the control over its course is offered. Possibility of use of this system is shown, allowing to define to 0,6 ng/ml HRP - a enzyme label, for variants of test sets «beta-HCG -EkspresslEA» and «beta-HCG -IEA» for definition HCG in urine and blood whey, accordingly.
The received results are according to the results received by radioimmunologic method. The comparative analysis of definition p-HCG in blood whey by immunoenzyme method with use spektrophotometric and photographic registration shows satisfactory correlation: R2 = 0,9363.
Необходимость определения хорионического гона-дотродина человека (ЧХГ) в биологических жидкостях обусловлена высокой информативностью биохимического теста при диагностике ранних сроков беременности, прогнозирования её исхода при угрожающих выкидышах, трофобластических и других злокачественных новообразованиях [1,2]
ЧХГ — гликопротеин с молекулярной массой ~ 40000 дальтон, состоит из двух субъединиц: а- цепи и p-цепи. Он образуется в ткани хориона, а именно в синцитиальных клетках плаценты и его синтез быстро увеличивается после имплантации эмбриона [3]. В норме ЧХГ обнаруживается в сыворотке крови и моче беременных женщин уже через 6-10 дней после оплодотворения, его содержание нарастает до конца первого триместра беременности, а затем падает. Поэтому его изменение в биологических жидкостях - сыворотке крови, плазме, моче женщин, служит надежным детектором беременности.
Пониженный уровень ЧХГ наблюдается при задержке или прекращении развития плода. Также снижение средних значений концентрации ЧХГ может быть при внематочной беременности, при хромосомных нарушениях у плода [4].
Гиперсекреция ЧХГ отмечается при многоплодной беременности, при внутриматочной инфекции, при пузырном заносе, при некоторых пороках развития плода.
Установлено, что повышение уровня р-ЧХГ у мужчин и небеременных женщин является признаком развития злокачественных новообразований. Такое повышение наблюдается при опухолях трофобластного или герминального происхождения (раке яичек и яичников, хориокарциноме, хориоаденоме), а также при раке молочной железы. Наиболее высокая концентрация отмечается при хориокарциноме [5].
В связи с этим количественное определение р-ЧХГ необходимо как для ранней диагностики беременности, так и наблюдения за беременными групп высокого риска, выявления и мониторинга злокачественных опухолей, секретирующих р-ЧХГ: трофобластом, хо-риокарцином яичника или плаценты, хориоаденом и некоторых видов рака молочной железы.
Для количественного определения ЧХГ разработаны различные варианты иммунохимических методов связывания [6-8,16] . Однако наиболее перспективным из них является иммуноферментный метод, основанный на использовании антител и антигенов, меченных ферментом [6,9] Иммуноферментный метод анализа нашел свое применение в различных областях медицины, однако, как правило, иммуноферментный анализ базируется на спектрофотометрических системах регистрации ферментативной активности конъюгата, связавшегося с твердой фазой иммуносорбента.[10,17].
Эти системы дороги, сложны и не всегда экономически оправданы в небольших клинико-диагностических лабораториях.
Целью работы является апробирование системы фотографического детектирования в твердофазном иммуноферментном анализе р-субъединицы ЧХГ с использованием коммерческих наборов совместного российско-швейцарского ЗАО «ДИАплюс». Материалы и методы
В работе были использованы иммуноферментные диагностикумы для определения р - субъединицы хорионического гонадотропина человека в вариантах «экспресс» для качественного обнаружения р-ЧХГ в моче и для количественного определения р-ЧХГ в плазме и сыворотке крови: «бета-ХГч-ЭкспрессИФА» и «бета-ХГчИФА», соответственно.
Твердофазный иммуноферментный метод определения р-ЧХГ основан на принципе «сэндвича» [9]. Шарики иммуносорбента покрытые антителами к р — ЧХГ инкубировали вместе с анализируемой пробой и раствором конъюгата пероксидазы и антител к р-ЧХГ [10].
Остаточную пероксидазную активность определяли фотографическим способом с использованием фотоматериала в качестве «сухого» реагента [11,12]. Для этого применяли позитивные фотопластины отечественного и импортного производства и черно-белую позитивную пленку МЗ-ЗЛ («Тасма»). Субстратная смесь содержала стандартный раствор фенидон-гидрохинонового про-
явителя и 0,01 М раствор перекиси водорода Интенсивность почернения пятен на фотоматериале определяли с помощью микрофотометра МФ-2.
Спектрофотометрическую регистрацию результатов ИФА проводили с использованием спектрофотометра СФ-46 (ЛОМО) с кварцевой кюветой 1=10,0 мм при Л= 492 нм. При этом субстратом служила смесь 3,3',5,5' - тетраметилбензидина в диметилсульфоксиде и перекиси водорода в 0,1М цитратном буфере, рН 5,5 Результаты и обсуждение
На рисунке приведена принципиальная схема одностадийного «сэндвич»-метода твердофазного имму-ноферментного анализа.
Иммобилизованные Анализируемый
на иммуносорбенте образец и конъюгат Иммобилизованные
моноклональные моноклональных антител иммунокомплексы Субстратная
антитела с пероксидазой с мечеными антителами реакция
Рисунок 1. Схема проведения одностадийного «сэндвич»-метода ИФА
Таким образом косвенное определение ЧХГ в анализируемой пробе построено на определении перок-сидазной активности иммобилизовавшегося конъюгата моноклональных антител с пероксидазой.
Нижняя граница определяемых количеств фермента-маркера (пероксидазы), обусловливающая чувствительность детекции в иммуноферментном методе анализа, зависит от ряда факторов: параметров каталитической константы ферментативной реакции, времени инкубации, состояния поверхности фотографического материала.
Так, нижняя граница определяемое концентрации пероксидазы может быть рассчитана до формуле [13]:
N
Снижн._ 1 • У
к
катал
где N — минимально детектируемый уровень продукта реакции в единице объема в единицу времени;
к — каталитическая константа фермента;
кат т г ’
Y—коэффициент, отражающий стехиометрию реакции. Минимальная концентрация гидрохинона в проявляющем растворе, которая может вызвать изменения на поверхности фотоэмульсионного слоя сенсибилизированного квантами света галогенидсеребряного слоя фотоматериала составляет 10-4 — 10-3 М. При величине к равной 8 00-104 с-1 [14] С = 1,25-10-11 - 1,25-10-10 М.
кат г Л нижн. ’ ’
В таблице 1 представлены фотограмма градуировочной шкалы на пероксидазу с указанием концентрации пероксидазы в нг/мл и соответствующие им интенсивностям почернений на фотоматериале Б в единицах шкалы микрофотометра МФ-2. На рисунке 2 приведена калибровочная кривая в полулогарифмических координатах для определения концентрации пероксидазы. Время ферментативной реакции состав-
Всероссийский журнал научных публикаций, октябрь 2011
7
ляло 20 минут, а время контакта фермент-субстратной смеси с поверхностью сенсибилизированного фото-эмульсионного слоя — 2 минуты.
Рисунок 2. Калибровочный график для определения пероксидазы (HRP) в полулогарифмических координатах.
Разработанный способ апробирован в ИФА качественного экспресс определения ß — ЧХГ в моче беременных женщин. На рис. 3 приведена фотограмма результатов диагностики беременности по образцам мочи беременной и небеременной женщин.
Рисунок 3. Фотограммы качественного экспресс определения ß-ЧХГ в моче беременной (1) и небеременной (2) женщины.
В отличие от образцов мочи, не содержащих хорио-гонадотропин, при анализе мочи беременных женщин фотограммы имеют значительно меньшую интенсивность почернений, что позволяет надежно и с документальной точностью тестировать беременность.
Для определения ß-ЧХГ в сыворотке крови была разработана следующая методика: в пробирки разли-
вали до 0,02 мл стандартных растворов ЧХГ (0; 10; 25; 50; 100; 200 мМЕ/мл), добавляли по 0,25 мл конъюгата (анти-р-ЧХГ- пероксидаза), помещали в каждую пробирку по одному шарику, покрытому антителами к ЧХГ, встряхивали и инкубировали при 37° С в течение одного часа. После инкубации из пробирок удаляли раствор, промывали шарики дистиллированной водой три раза, тщательно удаляли воду. Затем, в каждую пробирку добавляли 0,25 мл раствора фенидон-ги-дрохинонового проявителя, предварительно разбавленного дистиллированной водой в соотношении 1:2 и 0,25 мл 3-10-2 М пероксида водорода; выдерживали при комнатной температуре 30 минут и раскапывали с помощью пипеточного микродозатора на поверхность фотоматериала. Через 1,5-2 минуты фотоматериал ополаскивали водой и фиксировали изображение обычным способом. При проведении анализа вместо стандартного раствора р — ЧХГ вводили анализируемую пробу.
В ходе работы было обследовано 23 практически здоровых беременных женщин с различными сроками беременности. Из них в возрасте до 20 лет - 6 человек, до 30 - 14 человек и свыше 30 лет - 3 человека. В том числе перворожавших - 3 человек, повторнорожавших - 12 человек и многорожавших ( более 5 раз ) - 3 человека.
Результаты исследования представлены в таблице 2.
Корреляционный анализ двух методов определения в — ЧХГ в сыворотке крови беременных женщин показывает удовлетворительную сходимость результатов анализа. Коэффициент корреляции Я2 = 0,9363. Уравнение линейной регрессии имеет вид у = - 0,0539 + 1,2738 х ( рис.4 ).
С«нктроф0№1*с!1рмчккая jL'lOtUHl
Рисунок 4. Корреляционная зависимость иммуноферментного определения ЧХГ со спектрофотометрической и фотографической детекцией.
На основании проведенных исследований была построена диаграмма зависимости концентрации р-ЧХГ в сыворотке крови от срока беременности при нормальной ее протекании (рис. 5).
Как видно из диаграммы, значения концентраций р-ЧХГ находится в широком диапазоне. Однако наибольшие значения концентрации р-ЧХГ наблюдаются
Таблица 1. Результаты измерения интенсивности почернений на фотоматриале при различных концентрациях пероксидазы
Концентрация пероксидазы HRP, нг/мл Фотограмма Интенсивность почернений, S ед.
280,0 36 ± 4
140,0 55 ± 3
70,0 71 ± 2
35,0 • 93 ± 3
17,5 • 103 ± 4
9,0 • 118 ± 6
4,5 • 128 ± 6
2,2 т 131± 6
1,1 т 134 ± 8
0,6 • 138 ± 8
Фон ф 141 ± 8
Плотность вуали • 23 ±3
Таблица 2. Результаты определения р-ЧХГ в сыворотке крови здоровых беременных женщин
№/№ Возраст Триместр Срок беременности, недель Уровень ЧХГ, мМЕ/мл
Спектрофотометри ческая регистрация Фотографическая регистрация
1. 22 I триместр 7-8 18,5 20
2. 25 8-9 20,0 25
3. 24 9-10 24,5 26
4. 21 9-10 22,5 32
5. 19 10-11 42,5 58
6. 19 12-13 21,5 30
7. 26 12-13 32,5 35
8. 27 12-13 34,6 46
9. 20 13-14 34,0 50
10. 26 13-14 30,5 40
11. 18 13-14 32,5 37
Среднее значение 28,5 36,3
12. 18 II триместр 17-18 25,0 30
13. 24 17-18 29,0 30
14. 38 17-18 28,5 38
15. 34 18-19 33,4 45
16. 26 19-20 10,0 10
17. 26 23-24 13,5 20
18. 21 23-24 12,5 20
Среднее значение 21,7 27,5
19. 36 III триместр 32 3,0 5
20. 20 33-34 3,8 6
21. 23 35-36 18,5 22
22. 29 35-36 16,8 20
23 28 36 6,0 8
Среднее значение 9,6 12,2
мМ Е/мл
6U -н
и --------------------------
I ]] III
Триместр
Рисунок 5. Диаграмма зависимости концентрации р-ЧХГ в сыворотке крови от срока беременности
на 10 — 14 неделях беременности с последующим снижением его уровня во втором и третьем триместрах нормального протекания беременности.
Полученные данные хорошо соотносятся с результатами радиоиммунологических исследований и отражают физиологию внутриутробного развития плода [ 15,16 ].
Выводы
Проведенные исследования показывают, что разработанный метод иммуноферментного определения ß-ЧХГ в биологических жидкостях с использованием фотографической регистрацией результатов ИФА обладает достаточной чувствительностью, простотой в постановке, может быть использован для раннего выявления беременности, а также для прогнозирования ее исхода, а система ИФА с фотографической детекцией расширяет аналитические возможности тест-методов в клинической диагностике.
Список использованных источников
1. Красильников С.Э., Юкляева Н.В., Юркина Э.А., Наров Ю.Э., Роньжин Г.Г. Хорионический гонадотропин человека в диагностике и мониторинге трофобластических болезней // В научно-метод. сборнике Диагностическая значимость выявления маркеров фетоплацентарного комплекса в контроле развития беременности и онкозавболеваний. // Кольцово, ЗАО «Вектор-Бест», 2005. С.45-47.
2. Юркина Э.А., Офицеров В.И., Самуков В.В., Дедкова Л.М., Мизенко Г.А., Решетников С.С., Фролова С.Б., Калашников В.В., Сабиров А.Н., Рис. В.И. Иммуноферментный метод определения хорионического гонадотропина человека
с использованием поликлональных антител // В научно-метод.сборнике Диагностическая значимость выявления маркеров фетоплацентарного комплекса в контроле развития беременности и онкозавболеваний. // Кольцово, ЗАО «Вектор-Бест», 2005. С.3-7.
3. Справочник «Медицинская лабораторная диагностика» / под ред. А.И. Карпищенко, С-Петербург, «Интермедика». 1997. С. 180.
4. Kreig A., Wenk R. // Clinical Diagnosis and Management / Ed. J.B. Henry. — Philadelphia, 1984. — P 493-499.
5. Гриневич Ю.А., Каменец Л.Я. «Основы клинической иммунологии опухолей». Киев, «Здоровье», 1986, с. 159.
6. Аронбаев Д.М. Разработка принципов амперометрической детекции в твердофазном иммуноферментном анализе. Автореф. дисс...канд. хим.наук. М.:, 1987, 24с.
Всероссийский журнал научных публикаций, октябрь 2011
g
7. Гравимун 2. Иммунологический тест на наличие беременности in vitro //VEB. SÄCHSISCHES SERUMWERK.- Dresden.
8. Иммунохимический анализ / Под ред. М.А. Зильбера.
М.- 1968. - 280 с.
9. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Т.Нго, Г.Ленхоффа. - М.:1988.-342 с
10. бета-HCG -ИФА «ДИАплюс». Тест для ранней диагностики беременности//ПИК НПО «Медбиоэкономика».
11. А.с. 1439506 СССР. Способ определения оксидоредуктаз-ной активности ферментов и иммуноферментных конъюгатов / Д.М. Аронбаев, В.И. Криворучко, М.В. Симонова, С.Д. Варфоломеев// Бюлл.изобр. 1988, №43.
12. Аронбаев Д.М., Варфоломеев С.Д., Криворучко В.И., Симонова М.В. Применение фотоматериалов в качестве «сухого реагента» для определения пероксидазной активности биопрепаратов // Мед.техника. 1990, №1.- С.39-40.
13. Дзантиев Б.Б. Разработка физико-химических основ иммуноферментного анализа иммуноглобулинов. Автореф. дисс. ...канд.хим.наук.-М.:1979. 22 с.
14. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применение. М.:, МГУ. 1981, 66 с.
15. Ткачева Г.А., Балаболкин М.И., Ларичева И.П. Радио-иммунологические методы исследования. Справочник. М.:. 1983. - 146 с.
16. Таранов А.Г. Лабораторная диагностика. Иммунофер-ментные и радиоиммунологические методы анализа. Новосибирск, 1995. С. 96-97.
17. Оборудование для иммуноферментного анализа (ИФА). Каталог оборудования. М.: Изд-во Группа компаний «Био-ХимМак». Раздел 46. С.466.
Информация об авторах
• Аронбаев Д. М., кандидат химических наук, доцент кафедры неорганической химии факультета естественных наук СамГУ, Самарканд
• Васина С. М., кандидат химических наук, доцент кафедры физической и коллоидной химии факультета естественных наук СамГУ, Самарканд
