CC BY
60
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10052 УДК 574.577
Ключевые слова: фенольные соединения, флаваны, флаванолы, диоскорея ниппонская, микроклоны.
Key words: phenolic compounds, flavanes, flavanols, Dioscorea nipponica, microclones.
Калашникова Е.А., 2Зайцева С.М., 3Доан Тху Тхуи, 'Киракосян Р.Н.
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОКЛОНОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ DIOSCOREA NIPPONICA MAKINO С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
DEVELOPMENT OF A METHOD FOR OBTAINING MICROCLONES OF MEDICAL PLANTS DIOSCOREA NIPPONICA MAKINO WITH A HIGH CONTENTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES
'Российский Государственный аграрный университет МСХА имени К.А. Тимирязева.
127550 Российская Федерация, г. Москва, ул. Тимирязевская дом 49
Russian State agrarian University-MTAA named after K. A. Timiryazev.
127550Russian Federation, Moscow, Timiryazevskaya street, 49 2Московская Государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии МВА имени К. И. Скрябина. 109472, Российская Федерация, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23 Moscow state Academy of veterinary medicine and biotechnology named after K. I. Skryabin.
109472, Russian Federation, Moscow, Akademika Skryabina str., d. 23 3Вьетнамский национальный аграрный университет. Республика Вьетнам, г. Ханой Vietnam National University of Agriculture. Republic of Vietnam, Hanoi, Trau Quy - Gia Lam
Калашникова Елена Анатольевна, д. б. н., профессор кафедры генетики, селекции и биотехнологии.
E-mail: [email protected]
Kalashnikova Elena Anatoljevna, Doctor in Biological Sciences, Professor, Genetics, Breeding and Biotechnology
Dept. E-mail: [email protected] Киракосян Рима Нориковна, к. б. н., доцент кафедры генетики, селекции и биотехнологии.
E-mail: [email protected] Kirakosyan Rima Norikovna, PhD in Biological Sciences, Associate Professor, Genetics, Breeding and Biotechnology Dept. E-mail [email protected] Зайцева Светлана Михайловна, к. б. н., доцент кафедры кормления и кормопроизводства.
E-mail: [email protected] Zaytseva Svetlana Mikhajlovna, PhD in Biological Sciences, Associate Professor, Feeding and Fodder Production Dept. E-mail: [email protected] Доан Тху Тхуи, к. б. н., доцент факультета агрономии. E-mail: [email protected] Doan Thu Thuy, PhD in Biological Sciences, Associate Professor, Faculty of Agronomy. E-mail: [email protected].
Аннотация. В статье приводятся данные по получению микроклонов лекарственных растений диоскореи нип-понской. Микроклональную культуру инициировали из семян и сегментов различных органов интактных растений. Установлено, что полученные микроклоны обладают высокой способностью к биосинтезу разнообразных растворимых фенольных соединений, что подтверждено биохимическими методами исследований. В дальнейшем высокопродуктивные микрорастения успешно прошли адаптацию к нестерильным условиям выращивания. Summary. The article presents data on the production of microclones of medicinal plants of Nippon Dioscorea. Microclonal culture was initiatedfrom seeds and segments ofvarious organs of intact plants. It is established that the obtained microclones have a high ability to biosynthesis of various soluble phenolic compounds, which is confirmed by biochemical methods of research. In the future, highly productive micro plants have successfully adapted to non-sterile growing conditions.
Введение ные исходному интактному растению, числен-
Сохранение биоразнообразия растений и ность которого мала или находится на грани
создание генетических банков in vitro является полного исчезновения. Кроме того, сохранение
одним из перспективных направлений биотех- редких растительных ресурсов в банке in vitro
нологии. Благодаря клональному микроразмно- дает возможность изучать растения-регенеран-
жению возможно получать в кратчайшие сроки ты в качестве источников вторичных метаболи-
растения-регенеранты, генетически идентич- тов, которые являются ценными биологически
активными веществами для фармацевтической промышленности. Экспериментально установлено, что не только каллусные культуры, но и микроклоны сохраняют способность к синтезу вторичных соединений, в том числе и феноль-ной природы, которые характерны для интакт-ных растений [8, 12]. Данное физиологическое свойство является базовой основой для использования клеточных культур in vitro и микроклонов при проведении исследований в качестве модельных объектов.
Одной из перспективных культур для изучения вторичного метаболизма, как в интактном растении in vivo, так и в культуре in vitro является диоскорея ниппонская (Dioscorea nipponica Makino). Особенности вторичного метаболизма и способность к образованию веществ феноль-ной природы, обуславливает широкое терапевтическое действие экстрактивных веществ дио-скореи. Растение обладает противоопухолевым действием, снижает содержание холестерина в крови, а также усиливает устойчивость к действию стрессовых абиотических и биотических факторов окружающей среды, обладает имму-номодулирующим и дерматотоническим свойством [9].
Широкое применение полифенолов в фармакологии в качестве биологически активных веществ основано на их способности к окислению с образованием хинных форм, что определяет их гепатопротекторные, нейрорегуляторные, ка-пилляроукрепляющие, желчегонные и противоопухолевые свойства [1]. Однако данных об образовании фенольных соединений в растениях рода Dioscorea немного, а сложность физиоло-го-биохимических процессов, происходящих в растениях диоскореи, в том числе и в условиях in vitro, остается еще недостаточно изученной.
Кроме того, вторичные метаболиты растений могут оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее влияние на морфофизиоло-гические процессы культур в условиях in vitro. Исследователями отмечалось, что на этапе введения первичных эксплантов ценных высокопродуктивных лекарственных растений в культуру in vitro, содержащиеся в них вещества фенольной природы, часто приводят к ингиби-рованию ростовых процессов [4].
Таким образом, одним из перспективных направлений в биотехнологии лекарственных растений является стабильное получение микроклонов с высоким содержанием биологически
активных вторичных метаболитов. При одновременном решении задач по сохранению и восполнению биоразнообразия ограниченных природных ресурсов, полученные микроклоны могут служить в качестве потенциальных источников лекарственных препаратов, применяемых и для ветеринарной медицины, что и явилось целью наших исследований.
Методы и материалы
Объектом исследования служили растения диоскореи ниппонской фт^согеа трротса Макто), произрастающие в природных условиях и пересаженные на участок редких и исчезающих растений Главного ботанического сада РАН (Москва). В качестве эксплантов использовали боковые и верхушечные почки, листовые пластинки, многолетние клубни и семена.
Стерилизацию растительных эксплантов проводили по схеме: 1) обработка КМп04 -20 минут; 2) промывка дистиллированной водой; 3) стерилизация в 0,1% растворе сулемы - 7 мин; 4) промывка стерильной дистиллированной водой.
Для индукции образования пазушных побегов, адвентивных почек и микроклубней первичные экспланты культивировали на питательной среде, содержащей минеральные соли, по прописи Мурасига и Скуга, а также различные вещества с цитокининовой и ауксиновой активностью. В качестве цитокининов изучали влияние БАП, 2iр, кинетина в концентрациях от 0,5 до 1,0 мг/л, а также препараты Дропп и Цитодеф в концентрациях 0,01-1,0 мг/л. Из веществ с ауксиновой активностью изучали влияние НУК (0,5-1,0 мг/л), ИМК (1-7 мг/л) и ИУК (1-7 мг/л).
Экспланты выращивали в условиях световой комнаты, где поддерживалась температура 240С, 16-часовой фотопериод и освещение белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 3 тыс. лк.
Для укоренения микропобегов использовали модифицированную среду Мурасиге и Скуга, содержащую / нормы макросолей, 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, а также ИУК в концентрации 1 мг/л. Адаптацию растений проводили в контейнерах, содержащих проавтоклавированный субстрат.
Для извлечения фенольных соединений растительный материал измельчали, а затем подвергали экстракции горячим 96%-ным этанолом. В экстрактах спектрофотометрическим методом
определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений (с реактивом Фолина-Дениса), флаванов (с ванилиновым реактивом) и флавонолов (с хлористым алюминием). Калибровочные кривые для определения суммарного содержания растворимых фенольных соединений и флаванов строили по (-)-эпикатехину, для определения флавонолов - по рутину [6].
Исследования проводили в 5-ти биологических и 3-х аналитических повторностях. Статистическая обработка экспериментальных данных выполнена на основе методов математической статистики. На графиках представлены средние арифметические значения с доверительными интервалами на 5%-ом уровне значимости.
Результаты и обсуждение
Поскольку диоскорея ниппонская относится к ценным исчезающим видам и в природе имеет ограниченный ареал распространения, то большое практическое значение приобретают работы по клональному микроразмножению, а также по изучению фенольного метаболизма этих растений in vitro и in vivo.
На первых этапах исследований необходимо установить особенности накопления соединений фенольной природы, в частности, суммы растворимых фенольных соединений, флаванов и флавонолов, в различных органах интактных растений диоскореи.
В наших исследованиях установлено, что изучаемые первичные экспланты (побеги, однолетние корневища, многолетние корневища), изолированные с интактных растений, обладают высокой способностью к синтезу полифенолов, где наибольшее их содержание отмечалось в корневищах (Рис. 1). Аналогичные закономерности характерны и для флаванов, высокореакционных низкомолекулярных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами. Что касается флавонолов, то их содержание было отмечено только в побегах, так как их биосинтез приурочен к хлоропластам [7]. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей, а также с ранее полученными нами данными при работе с диоскореей кавказской (Dioscorea caucasia Lypsky) [3].
Таким образом, установленные нами различия в накоплении фенольных соединений в разных органах интактных растений диоскореи ниппонской, еще раз подтверждает, что биосин-
I..
||
■ Сумма содержания фенольных соединений мг/г сухой массы
■ Флаваны мг/г сухой массы
■ Флаоанолы мг/г сухой массы
Рис. 1. Содержание растворимых фенольных соединений в интактных растениях диоскореи ниппонской.
Рис. 2. Внешний вид каллусных культур диоскореи ниппонской, полученные из семян (А-В).
Рис. 3. Микроклоны диоскореи ниппонской (А), формирование микроклубней в пазухе листа (Б) и адаптированные растения к нестерильным условиям выращивания (В).
тез продуктов вторичного метаболизма характеризуется органоспецифичностью [3].
В настоящее время для диоскореи ниппонской большое практическое значение приобретает разработка технологий ее клонирования и получения каллусных и суспензионных культур in vitro. Это связано не только с целью сохранения исходных форм в природных условиях, но и возможностью их использования в качестве источников биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Известно, что формообразовательные процессы в условиях in vitro происходят при наличии в составе питательной среды биологически активных веществ, таких как регуляторы роста, аминокислот, растительных экстрактов и др. [10]. Помимо гормонального состава питательной среды процесс каллусогенеза и морфогенеза зависит от типа первичного экспланта. Так, в нашей работе каллусную ткань индуцировали из изолированных зародышей. Она характеризовалась плотной консистенцией, имела белый или светло-желтый цвет и обла-
дала высокой пролиферативной активностью. Наблюдалось формирование микроклубней, из которых в дальнейшем развивались растения-регенеранты (Рис. 2. А, Б, В).
С увеличением концентрации цитокининов в питательной среде коэффициент размножения увеличивался. Однако при этом формировались мелкие клубни и небольшие по размеру побеги. В дальнейшем полученные микропобеги переносили на среду для укоренения. В качестве ауксинов в состав питательной среды добавляли ИУК или ИМК в концентрации 1-5 мг/л. В этих условиях культивирования полученные микроклоны характеризовались интенсивным ростом и формированием мощной надземной биомассы. Причем наиболее благоприятным ауксином для микроразмножения являлась ИМК. В дальнейшем микрорастения успешно прошли адаптацию к нестерильным условиям выращивания (Рис. 3).
На последнем этапе исследований необходимо установить зависимость содержания биофлаваноидов от типа исследуемой ткани. Так содержание биофлаваноидов было больше в микроклубнях, по сравнению с побегами микроклонов. Полученные данные полностью согласуются с результатами нашей работы с интактными растениями in vivo, однако следует отметить, что способность к синтезу вторичных соединений в микроклонах была ниже, чем у исходных тканей [2].
Вероятно, это связано с тем, что в процессе культивирования микропобегов в условиях in vitro наблюдается выделение полифенолов в питательную среду, что может приводить к их ингибирующему действию на ткани культивируемых эксплантов.
На основе изложенного выше можно судить об успешном решении вопроса микроклональ-ного размножения диоскореи ниппонской, позволяющим получать большое количество продуктивных растений регенерантов в условиях in vitro с последующей адаптацией к нестерильным условиям произрастания. Как видно, не только интактные растения диоскореи нип-понской, но и полученные на их основе расте-ния-регенеранты обладают высокой способностью к биосинтезу разнообразных фенольных соединений, как простого строения, так и их полимерных форм, что несомненно имеет важное практическое значение как потенциальный источник ценных биологически активных веществ для фарминдустрии. Причем в образо-
вании биофлаваноидов наблюдается органо-специфичность, которая, в менее выраженной степени, сохраняется и в условиях in vitro. Отмеченная органоспецифичость в накоплении полифенолов в диоскорее, скорее всего, определяется их физиологическими функциями, в качестве медиаторов в физиолого-биохимических процессах, а также запасных и физиологически активных веществ [7, 11].
Список литературы
1. Алексеева Г. М. Фармакогнозия. Лекарственное сырье растительного и животного происхождения. Под редакцией Г.П. Яковлева. / Г. М. Алексеева, Г. А. Белодубровская, К. Ф. Блинова, М. Ю. Гончаров, Е. В. Жохова. СПб.: СпецЛит, 2013.
2. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. / Р. Г. Бутенко. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.
3. Доан Тху Тхуи. Фенольные соединения растений Диоскореи кавказской (Dioscorea caucasica Lipsky), особенности их образования и локализации / Доан Тху Тхуи, Е. А. Калашникова, С. М. Зайцева, Р. Н. Киракосян // Естественные и технические науки. 2018. №2. С. 24-27.
4. Дубравина Г. А. Изменения в образовании и локализации фенольных соединений при дедифференциации тканей тисса ягодного и тисса канадского в условиях in vitro / Г. А. Дубравина, С. М. Зайцева, Н.В. Загоскина // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 755-762.
5. Запрометов М. Н. Способность изолированных хлоропластов из листьев фасоли осуществлять биосинтез фенольных соединений / М. Н. Запрометов, Т. Н. Николаева // Физиология растений. 2003. Т. 50. № 5. С. 699-702.
6. Запрометов М. Н. Фенольные соединения и методы их исследования // Биохимические методы в физиологии растений. Наука, 1971. С. 185-197.
7. Калашникова Е. А. Изучение биологической активности экстрактов, полученных из микроклонов лекарственных растений различных таксономических групп в условиях in vitro / Е. А. Калашникова, С. М. Зайцева, Доан Тху Тхуи, Р. Н. Киракосян. // Ветеринария, зоотехния и биотехнология № 2. 2018. С. 50-58.
8. Носов А. М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений / А. М. Носов // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. Под редакцией Р. Г. Бутенко. М.: Наука, 1991.
9. Тюкавкина Н. А. Биофлавоноиды. М.: Издательский дом «Русский врач», 2002. 56 с.
10. Chattopadhyay S. K. Studies on the Himalayan yew Taxus wallichiana- part VII- The taxoids and phenolic constituents of the roots of Taxus wallichiana / S. K. Chattopadhyay // Indian Journal of Chemistry Section B - Organic Chemistry Including Medical Chemistry. 2000. Vol. 39. I. 7. P. 562-566.
11. Dixon R. Stress-induced phenylpropanoid metabolism / R. Dixon, N. Paiva // The Plant cell. 1995. Vol. 7. P. 1085-1097.
12. Takeda H. Expression and function of cell wall-bound cationic peroxidase in Asparagus somatic embryogenesis / Takeda H., Kotake T. // Plant physiology preview, 2003, Vol. 131, P. 1765-1774.
