CC BY
68
УДК 574.577
Ключевые слова: локализация, фенольные соединения, флаваны, флаванолы, диоскорея кавказская, тис ягодный, кирказон, бересклет
Key words: localization, phenolic compounds, flavanes, flavanols, Dioscorea caucasia Lypsky, Taxus baccata L., Dioscorea caucasia L., Euonymus nana Bieb., Aristolochia manshuriensis Kom.
Зайцева С.М.1, Доан Т.Т.2, Калашникова Е.А.3, Киракосян Р.Н.3
ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В КЛЕТКАХ И ТКАНЯХ РАСТЕНИЙ РАЗНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП
PHENOLIC COMPOUNDS LOCALIZATION IN CELLS AND TISSUES OF DIFFERENT TAXOMONIC GROUP PLANTS
'ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина» Адрес: 109472, Россия, Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23
Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named after K.I. Skryabin, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education Address: 109472, Russia, Moscow, Academician Skryabin st., 23 2Вьетнамский национальный аграрный университет Адрес: Республика Вьетнам, г. Ханой Vietnam National University of Agriculture Address: Republic of Vietnam, Hanoi 3ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет -МСХА имени К.А. Тимирязева» Адрес: 127550, Россия, Москва, Тимирязевская ул., д. 49 Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural Academy, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education Address: 127550, Russia, Moscow, Timiryazevskaya st., 49
Зайцева Светлана Михайловна, к. б. н., доцент каф. кормления и кормопроизводства.
E-mail: Smzaytseva@yandex.ru
Zaytseva Svetlana M., PhD of Biological Sciences, Associate Professor of the Feeding and Feed Production Dept.
E-mail: Smzaytseva@yandex.ru Доан Тху Тхуи, к. б. н., доцент агрономического факультета. E-mail: doanthuycgct@gmail.com Doan Thu T., PhD of Biological Sciences, Associate Professor of Agronomic Faculty. E-mail: doanthuycgct@gmail.com Калашникова Елена Анатольевна, д. б. н., профессор каф. генетики, селекции и биотехнологии.
E-mail: Kalash0407@mail.ru Kalashnikova Elena A., Doctor of Biological Sciences, Professor of the Genetics, Breeding and Biotechnology Dept.
E-mail: Kalash0407@mail.ru Киракосян Рима Нориковна, к. б. н., доцент каф. генетики, селекции и биотехнологии. E-mail: Mia4129@mail.ru Kirakosyan Rima N., PhD of Biological Sciences, Associate Professor of the Genetics, Breeding and Biotechnology Dept.
E-mail Mia4129@mail.ru
Аннотация. Изучали внутриклеточную и тканевую локализацию растворимых фенольных соединений в лекарственных растениях тиса, диоскореи, кирказона и бересклета, обладающих высокой способностью к биосинтезу разнообразных фенольных соединений. Полифенолы в этих растениях локализовались в эпидермальных, парен-химных и проводящих тканях (в клеточных стенках, межклетниках и эпибластах), а также в клетках экзогенных выделительных тканей бересклета, в железистых волосках. Эпибласты имеют большую центральную вакуоль, в полости которой содержаться фенольные соединения в виде гранулированных включений. Полифенолы локализовались в микровакуолях цитоплазмы, в межклетниках и клеточных стенках.
Summary. Soluble phenolic compounds of intracellular and tissue localization in medicinal plants Taxus baccata L., Dioscorea caucasia L., Euonymus nana Bieb., Aristolochia manshuriensis Kom. which possess high ability to various phenolic compounds biosynthesis was studied. Polyphenols in these plants were localized in epidermal, parenchymal and conductive tissues (in cell walls, intercellular spaces and epiblasts), as well as in Aristolochia manshuriensis Kom. cells in exogenous excretory tissues and in glandular hairs. Epiblasts have a large central vacuole in the cavity of which contains phenolic compounds in the form of granular inclusions. Polyphenols were localized in cytoplasm, intercellular and cell walls microvacuoles.
Введение
На протяжении многих веков представители разных народов отмечали и использовали целебные свойства растений. Фитотерапия до сих пор является неотъемлемой частью современной медицинской практики, а фармакогнозия - одной из основных фармацевтических наук, изучающей растительное сырье для научной медицины, в том числе и ветеринарной. Особенности метаболизма растительного организма и способность к образованию биологически активных соединений, обуславливает широкое терапевтическое действие их экстрактивных веществ [1].
Растениям помимо реакций первичного обмена свойственна способность к синтезу разнообразных веществ так называемого вторичного происхождения, спектр которых чрезвычайно разнообразен. Он насчитывает несколько десятков тысяч индивидуальных соединений, к числу наиболее распространённых и относятся фенольные соединения (биофлаваноиды). Широкое применение полифенолов в фармакологии в качестве биологически активных веществ основано на их способности к окислению с образованием хинных форм, что определяет их гепатопро-текторные, нейрорегуляторные, капилляро-укрепляющие, желчегонные, противоопухолевые и другие свойства.
В медицинской практике препараты на основе диоскореи «Полиспонин» и «Диоспо-нин» применяются для терапии и профилактики атеросклероза сосудов головного мозга и сердечно-сосудистой системы в сочетании с гипертонической болезнью. Реликтовые растения рода Taxus обладают уникальной способностью к биосинтезу таксола и его изоформ - веществ, проявляющих высокую активность при терапии онкологических заболеваний. Фармокинетические особенности таксола проявляются в способности блокировать анафазу митотического деления, связываясь с цитоскелетом раковой клетки. Кирказон применяется при заболеваниях желудочно-кишечного тракта как средство, стимулирующее аппетит и секрецию пищеварительных желез, а также обладает им-муномодулирующим действием. Бересклет обладает противомикробным, иммуномоду-
лирующим, противовоспалительным, спазмолитическим и желчегонным действиями.
Несмотря на значительные отличия мор-фофизиологических характеристик этих ценных растений, их объединяет высокая биосинтетическая способность к образованию фенольных соединений - биофлавано-идов. Кроме того, фенольные соединения являются активными метаболитами в растительном организме и участвуют в процессах фотосинтеза, дыхания, трансдукции энергии, аллелопатии, а также защиты клеток от патогенов и разных стрессовых факторов. Биосинтез и накопление вторичных соединений, в том числе и фенольной природы, отличается пластичностью и зависит от видовой принадлежности растений, его органа и стадии онтогенеза [5].
Однако не следует забывать и о ядовитых свойствах растений, способных причинить значительный экономический ущерб не только путем потери продуктов животноводства, но и от непосредственной гибели животных. С давних пор отмечалось ядовитое действующее начало всех частей тиса (Taxus) на животных, проявляющееся в поражении слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, ослаблении работы сердца и угнетении дыхания. В некоторых случаях животные (преимущественно лошади) погибали уже в течение первого часа после поедания тиса. Наличие в кирказоне аристоло-хиевой кислоты, сильнейшего капиллярного яда, обуславливает нарушение кровообращения, поражение центральной нервной системы и дегенерацию печени. В случае попадания кирказона в основной корм возможны случаи массового отравления животных. Отравление бересклетом сопровождается коликами, расстройством ЖКТ, дезориентацией и судорогами. Токсикология ядовитых растений тесно переплетается с биологическими науками - ботаникой, физиологией и биохимией растений, а также с ветеринарными дисциплинами, прежде всего с кормлением сельскохозяйственных животных.
Таким образом, изучение вторичного метаболизма растений имеет важное значение не только для фармакогнозии, но и для токсикологии с целью обеспечения эффективно-
го и безопасного кормопроизводства. Кроме того, точное определение локализации полифенолов в тканях растений, используемых в качестве исходного экспланта при введении ценных видов растений в культуру in vitro, несомненно повышает вероятность получения высокопродуктивных линий. Исследователями неоднократно отмечалось влияние фенольных соединений в исходных эксплантах на процесс введения растений в культуру in vitro с целью воспроизводства генетически идентичных исходному виду клеточных культур и растений-регенератов, являющихся источником уникальных биологически активных веществ для фармацевтической промышленности [6, 7]. Однако данных об образовании и локализации, в том числе и внутриклеточной, фенольных соединений в растениях, обладающих лекарственными свойствами, немного.
В связи с тем, что в литературе практически отсутствуют данные об образовании и локализации фенольных соединений в лекарственных растениях различных таксономических групп (Dioscorea, Taxus, Aristolochieae, Euonymus), целью нашего исследования являлось изучение локализации этих веществ в различных тканях и клетках вышеуказанных растений в качестве потенциальных источников лекарственных препаратов, применяемых и для ветеринарной медицины.
Материалы и методы
Объектом исследования послужили растения тиса ягодного (Taxus baccata L.), диоско-реи кавказской (Dioscorea caucasia L.), бересклета карликового (Euonymus nana Bieb.) и кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Kom.), произрастающие в природных условиях и пересаженные на участок редких и исчезающих растений Главного ботанического сада РАН (Москва).
Для гистохимического анализа в качестве объектов исследования использовали листья, побеги, корни и клубни указанных растений. Растительный материал резали при помощи микротома-криостата, толщина среза составляла 25 мкм.
Локализацию фенольных соединений определяли гистохимическими методами:
на сумму фенольных соединений материал окрашивали 0,08 % раствором реактива «Fast Blue», для изучения локализации флаванов (катехинов и проантоцианидинов) использовали реакцию с ванилиновым реактивом в парах соляной кислоты, а для лигнина -окрашивание флорглюцином в серной кислоте. С целью сохранения внутриклеточного распределения фенольных соединений все реакции проводили в неполярных растворителях. Препараты просматривали с помощью светового микроскопа [9].
Для электронномикроскопических исследований материал фиксировали глютаровым альдегидом (2,5 %) в натрий-фосфатном буфере (рН 6,8). Фиксацию материала проводили в течение 3-х часов при комнатной температуре с последующей обработкой 1 % раствором четырехокиси осмия в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 6,8), обезвоживанием водными растворами этанола (с возрастающей концентрацией последнего от 10 до 96%), затем ацетоном и, в завершение, заключением в эпон. Ультрамикротомные срезы подкрашивали водным раствором ацетата уранила и цитратом свинца. Просматривали на микроскопе JEM - 100B (Jeol, Япония).
Результаты и обсуждение
Поскольку растения тиса, диоскореи, кирказона, а также бересклета относятся к ценным исчезающим видам и имеют ограниченный ареал распространения в природе, большое практическое значение приобретает изучение их фенольного метаболизма как возможного источника биологически активных веществ и лекарственных препаратов.
Выяснение локализации полифенолов является неотъемлемой частью изучения фе-нольного метаболизма растений. Все растения без исключения способны к биосинтезу веществ фенольной природы, а некоторые соединения простого строения (фенилпро-паноиды) имеют практически всеобщее распространение. Хотя полифенолы и присутствуют во всех органах и тканях растений, они могут иметь различную локализацию, обусловленную их функциями.
Одной из основных задач исследований было выяснение особенностей накопления и ло-
и к л
Рис.1 Локализация растворимых фенольных соединений в тисе ягодном (А-Д): А - корень, Б, В - стебель, Г, Д - хвоя; в диоскорее кавказской (Е-З); Е - лист, Ж - корневищный клубень, З - стебель; в листе кирказона (И) и железистых волосках бересклета (К-Л). (А, В, Е, Ж,Л - реакция на флаваны с ванилиновым реактивом, Б,Г,Д,З,И,К - реакция на сумму фенольных соединений с «Fast Blue»).
кализации в различных органах этих растений полифенолов (суммы растворимых фенольных соединений, флаванов и флавонолов, а также фенольного полимера лигнина). Так как фла-ваны, в свою очередь, являются наиболее реакционно-способными веществами фенольной природы и играют роль низкомолекулярных антиоксидантов, защищающих клетки от последствий стрессового воздействия, выяснение локализации и этого класса полифенолов для нас было особенно актуально.
Ранее нами было показано, что исследуемые растения обладают высокой способностью к синтезу полифенолов различного строения [2, 3].
При исследовании локализации фенольных соединений в растениях тиса специфические гистохимические реакции позволили обнаружить их в клетках и тканях всех органов растения (рис. 1 А-Д). В клетках перицикла и протофлоэмы, а также в прото- и метаксилеме полифенолы локализованы в клеточных стенках и вакуолях. Следует отметить, что реакция на флаваны (с ванилиновым реактивом) практически совпадала с окрашиванием на растворимые фенольные соединения (реакция с «Fast Blue»). Лигнин откладывался в клеточных стенках эпиблемы, филлодермы и в сосудах ксилемы (рис. 1А). В стебле фенольные соединения присутствуют в толще кутикулы, эпидермальных клетках, паренхиме листовой подушки, перидерме, и в формирующейся почке они представлены в клеточных стенках и микровакуолях цитоплазмы. Полифенолы присутствуют в клеточных стенках флоэмы, ксилемы и первичного кольца лубяных волокон. Флаваны также присутствовали в клетках стебля, но степень их окрашивания была менее выражена, чем на сумму растворимых фенольных соединений (рис. 1В). Лигнин локализован в клеточных стенках эпидермы и сосудах ксилемы. В хвое тиса растворимые фенольные соединения обнаружены в кутикуле, клетках эпидермы и в замыкающих клетках устьиц. Высокое накопление полифенолов, преимущественно флавонои-дов, отмечалось в вакуолях эпидермальных клеток, что, по-видимому, связано с их защитным действием от УФ-лучей, которое препятствует их проникновению во внутренние ткани. Клетки столбчатого мезофилла, при-
легающие к эпидерме, содержат их в виде мелкогранулированных включений, а в губчатом мезофилле (в вакуолях) полифенолы представлены в виде аморфного и гранулированного материала (рис. 1Д). Показано присутствие полифенолов в клетках паренхимной обкладки пучка, клеточных стенках сосудов ксилемы и во флоэме, а также в трансфузионной ткани и клеточных стенках альбуминовых клеток. Лигнин был в замыкающих клетках устьиц и смолохо-дах, иногда в нижнем слое кутикулы, а также в сосудах ксилемы (рис. 1Г). Такая локализация лигнина в растительных тканях характерна для многих растений [10].
Следует отметить, что для растений рода Taxus характерно образование большого числа специализированных фенол-запасающих клеток (эпибласты). Данные, полученные методом электронной микроскопии, свидетельствуют о том, что основная масса этих фенол-запасаю-щих клеток имеет большую центральную вакуоль, в полости которой сосредоточены фе-нольные соединения в виде гранулированных включений различной степени агрегирован-ности. Наряду с этим в тисе было отмечено образование и таких клеток, где полифенолы находились в микровакуолях цитоплазмы, прилегающих к центральной вакуоли. Кроме того, в ряде случаев они были обнаружены в межклетниках и клеточных стенках (рис. 2).
В диоскорее фенольные соединения локализованы в эпидермальных, паренхимных и проводящих тканях, где они содержались в клеточных стенках, межклетниках и эпи-бластах. Флаваны обнаружены в эпидерме, замыкающих клетках устьиц и мезофилле. Преимущественно флаваны локализовались в вакуолях в виде аморфного вещества (рис. 1 Е, Ж). На начальных этапах формирования почки так же, как и у тиса ягодного, отмечалось повсеместное присутствие полифенолов, представленных веществами флавановой природы. Однако, в последствии полифенолы уже единично встречались в некоторых клетках сформировавшейся почки и образовывали ряд клеток, как бы отделяющий ее от паренхимной ткани побега. Такое пограничное распределение различных классов полифенолов неоднократно наблюдалось и на других растительных объектах [3]. Ряд клеток с растворимыми
фенольными соединениями располагались в первичной коре стебля, а также во флоэме и ксилеме. Корневищные клубни диоскореи накапливали растворимые фенольные соединения, представленные преимущественно фла-ванами, в покровных и запасающих тканях. Очень яркая реакция на флаваны отмечалась в эпидермальных клетках - как в самих клубнях, так и в столонах. Было показано единичное накопление полифенолов в первичной коре и повсеместное - в клетках центрального цилиндра корневищ, где преобладали флаваны.
В кирказоне и бересклете отмечена характерная для большинства фенол-накапливающих растений локализация растворимых фенольных соединений, где они повсеместно отмечаются в эпидермальных клетках, паренхиме и механических тканях. Доминирующая часть фенол-за-пасающих клеток содержала полифенолы в вакуолях, реже - в клеточных стенках. В листьях растворимые фенольные соединения были локализованы в клетках эпидермы и мезофилла, которые содержали их в виде включений различной степени агрегации. Флаваны обнаружены в эпидерме, замыкающих клетках устьиц и вакуолях некоторых клеток мезофилла. Кроме того, выявлена локализация растворимых фенольных соединений в клетках экзогенных выделительных тканей бересклета. Железистые волоски бересклета содержали полифенолы в вакуолях в виде аморфного вещества (рис. 1 К, Л). Такая локализация полифенолов в выделительных тканях уже и визуально подтверждает факт их наличия в составе эфирных масел бересклета, обуславливающих терапевтические свойства этого растения.
Заключение
На основе изложенного выше можно заключить, что исследованные растения обладают высокой способностью к биосинтезу большего числа разнообразных фенольных соединений как простого строения, так и их полимерных форм, что несомненно имеет важное практическое значение как потенциальный источник ценных биологически активных веществ для фарминдустрии. Причем выявленное отличие в накоплении растворимых фенольных соединений у разных видов и органов растений еще раз свидетельствует о биохимической видо- и орга-носпецифичности, неоднократно отмеченной
в литературе [8]. Преимущественная локализация полифенолов флавановой природы в корнях растений согласуется и с биохимическими данными, свидетельствующими о том, что флаваны являются доминирующей группой фенольных соединений в корнях растений, что не раз сообщалось в литературе. Такая явная органоспецифичность в локализации полифенолов имеет важные физиологические аспекты. Скорее всего, это связано с тем, что
В
Рис. 2 Внутриклеточная локализация фенольных соединений в тисе ягодном: А - в центральной вакуоли, Б - в микровакуолях и В - в клеточной стенке и межклетниках.
в корнях исследованных растений не происходит образования флавонолов - наиболее распространенной группы фенольных соединений, биосинтез которых присущ только зеленым частям растений [4]. Если наличие полифенолов в надземной части растений играет роль медиаторов в физиолого-биохимических процессах, а также определяет защиту от механических воздействий и патогенов, то растворимые фенольные соединения, находящиеся в корнях и корневищах, скорее всего, играют роль запасных и физиологически активных веществ.
Список литературы
1. Алексеева Г.М. Фармакогнозия. Под ред. Г.П. Яковлева / Г.М. Алексеева, Г. А. Белодубровская, К.Ф. Блинова [и др.]. Санкт-Петербург: СпецЛит, 2013.
2. Доан Т.Т., Зайцева С.М., Калашникова Е.А. Влияние синтических регуляторов роста на микрокло-нальное размножение растений (Dioscorea nipponica Makino, Dioscorea caucasia Lypsky) и биосинтез фенольных соединений // Естественные и технические науки. 2018. № 3. С. 46.
3. Дубравина Г.А., Зайцева С.М., Загоскина Н.В. Изменения в образовании и локализации фенольных соединений при дедифференциации тканей тиса ягод-
ного и тиса канадского в условиях in vitro // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 755-762.
4. Запрометов М.Н., Николаева Т.Н. Способность изолированных хлоропластов из листьев фасоли осуществлять биосинтез фенольных соединений //Физиология растений. 2003. Т. 50. № 5. С. 699-702.
5. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения. LVI Тимирязевские чтения. М.: Наука, 1996. 45 с.
6. Носов А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений / Биология культивируемых клеток и биотехнология растений ; под ред. Р.Г. Бутенко. М. Наука. 1991.
7. Bhaising S.R., Maheshwari V.L. Plant tissue culture - a potential source of medicinal compounds // J. Scientific and Industrial research. 1998. V 57. P. 703-708.
8. Chougui N. Oil composition and characterization of phenolic compounds of Opuntia ficus-indica seeds / N. Chougui, A. Tamendjati, W. Hamidj [et al.] // Food Chemistry. 2013. № 139. P. 796-803.
9. Soukupova J. Histochemical and Biochemical Approaches to the Study of Phenolic Compounds and Peroxidases in Needles of Norway Spruce (Picea abies) / J. Soukupova, M. Cvikrova, J. Albrechtova [et al.] // New Phytol. 2000. V. 146. P. 403-414.
10. Zengqi Li. The synthesis and storage of phenolic compounds in the root and rhizome of Echinacea purpurea / Zengqi Li, Tiexin Tang, Shejian Liang [et al.] // American journal of Plant Sciences. 2012. V. 3. P. 551-558.
| КАК ОФОРМИТЬ ПОДПИСКУ НА ЖУРНАЛ? |
= А. Через подписной каталог |
| Индекс в каталоге «Газеты. Журналы» Агентства «Роспечать» - 33184 |
| Б. Через редакцию журнала |
| Банковские реквизиты для оплаты подписки =
= по безналичному расчету для юридических лиц: |
| ЧОУДПО «Институт Ветеринарной Биологии» |
| ИНН 7802196720 КПП 781301001 |
| Р/с 40703810400000000022 в АО «Горбанк», г. Санкт-Петербург |
I К/с 30101810200000000814 БИК 044030814 {
= В поле «Назначение платежа» указать: |
«Предоплата за подписку на журнал «Актуальные вопросы
I ветеринарной биологии» на 2017 г. согласно инф. письму б/н |
= от 03.09.16 г. НДС не облагается. Адрес подписки: ...» |
= Стоимость редакционной подписки на 2017 год: |
| 2000 рублей. |
Е Адрес редакции: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, 3-Б. =
I Т./ф. (812) 232-55-92, т. 927-55-92. |
I E-mail: virclin@mail.ru; www.invetbio.spb.ru |
^/IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIM
