CC BY
49
УДК 574.577
Ключевые слова: фенольные соединения, флаваны, флаванолы, локализация, тис, семена
Key words: phenolic compounds, flavanes, flavanols, localization, Taxus, seeds
Зайцева С.М.
ОБРАЗОВАНИЕ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ БИОФЛАВАНОИДОВ В СЕМЕНАХ РАСТЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ, НА ПРИМЕРЕ ТИСА ЯГОДНОГО (TAXUS BACCATA L) И ТИСА КАНАДСКОГО (TAXUS CANADENSIS MARSH)
FORMATION AND LOCALIZATION OF BIOFLAVONOIDS INSIDE MEDICINAL PLANTS SEEDS BY THE EXAMPLE OF THE YEW BERRY (TAXUS BACCATA L.) AND CANADIAN YEW
(TAXUS CANADENSIS MARSH)
ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии-МВА имени К.И. Скрябина» Адрес: 109472, Россия, Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23
Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named after K.I. Skryabin, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Address: 109472, Russia, Moscow, Academician Skryabin st., 23
Зайцева Светлана Михайловна, к. б. н., доцент каф. кормления и кормопроизводства.
E-mail: [email protected]
Zaytseva Svetlana M., PhD of Biological Sciences, Associate Professor of the Feeding and Feed Production.
E-mail: [email protected]
Аннотация. Изучены особенности образования и локализации вторичных соединений, обладающих высокой биологической активностью, в семенах растений рода Taxus. Было показано, что семена тиса так же, как и вегетативные органы, обладают высокой способностью к биосинтезу большого числа фенольных соединений как простого строения, так и их полимерных форм. Образование полифенолов в семенах тиса ягодного было в 2,5 раза выше, чем в семенах тиса канадского. У тиса канадского флаваны являются доминирующими компонентами фенольного комплекса. При качественном исследовании фенольных соединений семян тиса было показано присутствие фенолкар-боновых кислот, флаванов и флавонолов. Основная часть полифенолов локализована в эндосперме, прилегающем к зародышу (в клеточных стенках), в эпибластах базальной части семядолей и в подвеске зародыша. Summary. High biologically active secondary compounds formation and localization features with in Taxus genus' seeds were studied. It was shown that Taxus seeds as well as vegetative organs have a high ability to biosynthesis of large number of phenolic compounds as simple structure and their polymer forms. Polyphenols formation inside yew berry seeds was 2,5 times higher than canadian yew seeds. Flavanes are dominant components at canadian yew's phenolic complex. The qualitative study of yew seeds phenolic compounds shown the presence of phenolcarbonic acids, flavans and flavonols attended. The main part of polyphenols is localized in the endosperm next to the embryo (in cell walls), in cotyledon basal part epiblasts and in the hypocotyl.
Введение
Более четверти всех лекарственных средств в фарминдустрии производится на основе компонентов растительного происхождения, где терапевтическая ценность определяется спектром их биологически активных веществ. В качестве источника лекарственного сырья служат не только дикорастущие, но и культивируемые растения. Показано, что более 12-ти тысяч веществ растительного происхождения обладают фармакологической активностью, которая способна вызывать множественный физиологический
32
эффект, в том числе и фатальный, на различные системы организма и его органы [1]. Издавна отмечалось ядовитое действующее начало всех частей тиса (Taxus) на животных, проявляющееся в поражении слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, ослаблении работы сердца и органов дыхания. Смерть животных наступала скоротечно от угнетения дыхания. В некоторых случаях животные погибали уже в течение первого часа после поедания тиса. Наиболее чувствительными к ядовитым компонентам тиса являются лошади (смертность достигает
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018
94 %), где разовая смертельная доза листьев тиса составляет (150-400) грамм. Менее чувствительными являются жвачные животные.
При этом отмечено, что повторное поедание нетоксичных количеств тиса может обуславливать привыкание и устойчивость к его ядовитым компонентам. Вследствие этого в некоторых местностях тис считается не только безвредным, но и применяется в кормопроизводстве как молокогонное и откормочное средство.
Такой множественный эффект связан с особенностями метаболизма растительного организма, когда помимо реакций первичного обмена растениям свойственно образование веществ вторичного происхождения, среди большого разнообразия которых наиболее распространенными являются фенольные соединения. Фенольные соединения являются активными метаболитами и участвуют в процессах фотосинтеза, дыхания, трансдук-ции энергии, аллелопатии, а также защиты клеток от патогенов и разных стрессовых факторов. Биосинтез и накопление вторичных соединений, в том числе и фенольной природы, отличается пластичностью и зависит от видовой принадлежности растений, органов и стадии онтогенеза [3].
В последние годы большое внимание исследователей уделяется изучению реликтовых растений рода Taxus, обладающих уникальной способностью к биосинтезу так-сола и его изоформ - веществ, проявляющих высокую биологическую активность при терапии онкологических заболеваний [9]. Фармакологические особенности таксола проявляются в способности блокировать анафазу митотического деления, связываясь с цитоскелетом раковой клетки.
Установлено, что производные таксола представляют собой дитерпеноиды, в составе которых присутствует З-(К-метиламино)-3-фенилпропаноиловая структура, являющаяся производным веществом фенольной природы. Установлена структура более 20-ти соединений этого класса. Их биосинтез так же, как и биосинтез фенольных соединений, происходит при участии фенилаланина, что еще раз свидетельствует о тесной взаимосвязи между биосинтезом изопреноидов
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018
и фенольных соединений, как это отмечалось в литературе [5].
Способность полифенолов к окислению с образованием хинных форм обуславливает их широкое применение в фармакологии в качестве биологически активных веществ, обладающих гепатопротекторными и нейро-регуляторными, капилляроукрепляющими, желчегонными и противоопухолевыми свойствами.
Однако данные об образовании фенольных соединений в растениях рода Taxus крайне немногочисленны. Так, в коре стеблей T. wallichiana обнаружили (+)-катехин и фе-нилпропаноид 2-(3,4-метилендиоксифенил)-пранан-1,3-диол. В хвое видов T. cuspidata идентифицировали такие флавоноиды, как сциадоритисин, гинкгетин, изорамнетин и кверцетин. Несмотря на то, что растения тиса характеризуются высокой способностью к синтезу фенольных соединений, разные представители рода Taxus отличаются между собой по способности к образованию этих веществ [2, 7]. Ряд физиологических и биохимических процессов, происходящих в растениях рода Taxus остаются еще недостаточно изучены.
В связи с тем, что в литературе данные об образовании фенольных соединений в растениях рода Taxus крайне немногочисленны, целью нашего исследования являлось изучение образования и локализации этих веществ в генеративных органах двух представителей данного семейства (T. Baccata и T. Canadensis) как потенциальных источников лекарственных препаратов, применяемых в том числе и для ветеринарной медицины.
Материалы и методы
Объектом исследований являлись семена тиса ягодного (Taxus baccata L.) и тиса канадского (Taxus Canadensis Marsh.), собранные в сентябре с произрастающих в Московском регионе растений.
Для извлечения фенольных соединений семена измельчали, а затем подвергали экстракции горячим 96 % этанолом. В экстрактах спектрофотометрическим методом определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений (с реактивом
33
Фолина-Дениса), флаванов (с ванилиновым реактивом) и флавонолов (с хлористым алюминием). Калибровочные кривые для определения суммарного содержания растворимых фенольных соединений и флаванов строили по (-)-эпикатехину, для определения флавонолов - по рутину [4].
Для предварительного изучения состава фе-нольных соединений спиртовые экстракты растительного материала упаривали досуха. Остаток растворяли в небольшом объеме этанола и полученный раствор подвергали одномерной хроматографии в тонком слое (0,25 мм) микро-кристалической целлюлозы (растворитель -н-бутанол+СН3СООН+вода, 40:12:28). Идентификацию веществ проводили на основании данных специфической флуоресценции в УФ-свете (длина волны 254 и 365 нм), по значениям Rf сравнительно с метчиками-стандартами, а также по качественным реакциям с рядом специфических реагентов: смесью хлорного железа и калия железосинеродистого (на все классы фе-нольных соединений), ванилиновым реактивом (на флаваны), хлористым алюминием (на фла-воноиды) и диазотированным пара-нитроанили-ном (на фенолкарбоновые кислоты) [6].
Для гистохимического анализа в качестве объектов исследования использовали семена и вычлененные зародыши тиса ягодного и тиса канадского. Растительный материал резали при помощи микротома-криостата, толщина среза составляла 25 мкм.
Локализацию фенольных соединений определяли гистохимическими методами: на сумму фенольных соединений материал окрашивали 0,08 % раствором реактива «Fast Blue», для изучения локализации флаванов (катехинов и проантоцианидинов) использовали реакцию с ванилиновым реактивом в парах соляной кислоты, а для лигнина - окрашивание флорглюцином в серной кислоте. С целью сохранения внутриклеточного распределения фенольных соединений все реакции проводили в неполярных растворителях [10]. Препараты просматривали с помощью светового микроскопа Ergavall («Karl Ziess»).
Результаты и обсуждение
Растения рода Taxus относятся к реликтовым, медленно растущим видам, име-
34
ющим ограниченный и труднодоступный ареал распространения в различных эколого-географических и флористических областях. В природе они произрастают в узкоспециализированных условиях, в макро и микроэкологических нишах. Естественное воспроизводство в природе тиса затруднено, поскольку семена характеризуются комбинированным покоем, обусловленным глубоким физиологическим покоем, недоразвитием зародыша и твердосемянностью, что требует сложной предпосевной подготовки для проращивания. В средней полосе России эти виды как правило произрастают только в ботанических садах/парках, а также в частных коллекциях (рис. 1, 2 А).
Тис ягодный и тис канадский значительно отличаются по своим морфологическим и физиологическим характеристикам. Т. ЪасеМа -двудомное дерево, достигающее 25-метровой высоты, живущее более 3000 лет. Хвоя мягкая, блестящая, темно-зеленая. Для Т. Ъасса1а характерно образование многовековых рощ на территории Западной Европы, на Кавказе и в Малой Азии. T.Canadensis -кустарник высотой (1-2) м, произрастающий в подлеске темнохвойных лесов из тсуги, ели и туи Северной Америки. Окраска хвои у него более светлая (желто-зеленая), зимой приобретающая терракотовый оттенок. Для тиса канадского характерна наибольшая из всех видов тиса зимостойкость и теневыносливость.
Установлено, что все растения в тех или иных количествах синтезируют полифенолы, а некоторые соединения простого строения (фенилпропаноиды) имеют практически всеобщее распространение [3]. Как правило, наиболее интенсивно их биосинтез происходит в молодых, активно вегетирующих органах. Ранее нами было показано значительное содержание полифенолов в побегах тиса. Определение суммарного содержания растворимых фенольных соединений выявило и довольно высокий уровень их накопления в семенах (рис. 3 А). Следует также отметить, что наибольшая биосинтетическая способность характерна для семян тиса ягодного, превышающая таковую у семян тиса канадского почти в 2,5 раза.
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018
Рис. 1. Растения тиса ягодного T. Baccata (А) и тиса канадского T. Canadensis (Б).
семенах тиса ягодного и тиса канадского (А).
Доля флаванов (ФЛ), флаванолов (ФЛН) и других растворимых фенольных соединений (РФС) от суммарного содержания растворимых фенольных соединений в семенах тиса ягодного (Б) и тиса канадского (В).
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018 35
Рис. 4. Хроматограммы спиртовых экстрактов семян тиса ягодного (1) и тиса канадского (2). Фенолкар-боновые кислоты - № 1,2,3 из них №1 п-кумаровая кислота, №2 - оксибензойная. Флавонолы № 4,9, из них №4 - рутин. Флаваны - №5,6,7,8,10,11,12,13, из них №5 - (+)-катехин, №6 - (-) эпикатехин, №10-13 - проантоцианидины.
Известно, что для растений тиса характерно образование флаванов - высокореакционных низкомолекулярных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами. Определение содержания флаванов в спиртовых экстрактах семян тиса свидетельствует о близкой биосинтетической способности тиса ягодного и тиса канадского (рис. 1). Кроме того, у тиса канадского флаваны являются доминирующими компонентами - на их долю приходится более 70 % от суммы растворимых фенольных соединений.
Помимо флаванов, в семенах тиса синтезируются и флавонолы, являющиеся одними из наиболее распространенных в надземных тканях растений полифенолами. При этом способность к их образованию была на 40 % выше у семян тиса ягодного по сравнению с тисом канадским. О высокой способности тканей растений к накоплению флавонолов неоднократно сообщалось в литературе [3].
Использование метчиков-стандартов, а также качественных реакций на различные группы фенольных соединений позволило предварительно идентифицировать некоторые из веществ, присутствующих в спиртовых экстрактах семян тиса. К ним относятся вещества флавановой природы, представле-ные простыми формами катехинов - (+)-ка-техином и (-)-эпикатехином, а также проан-тоцианидинами (олигомерные производные (+)-катехина и (-)-эпикатехина). Образование (+)-катехина отмечалось и у тиса остроконечного [9] (Не^еЛ, 1960; Ыигапака,
1 \ м» 'I ! .«Ум
В
Рис. 5. Локализация фенольных соединений в зародыше тиса ягодного (А, Б - флаваны в базальной части семядолей и области подвеска, В - клетки-вместилища с мелкограннулированными фенольными соединениями).
36
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018
1999). Среди флавонолов были рутин, на-рингенин, а также гликозиды кемпферола и кверцетина. Фенилпропаноиды представлены п-кумаровой, оксибензойной, гентизи-новой, ванилиновой, феруловой, хлорогено-вой и кофейной кислотами, а также другими производными, которые требуют дальнейшей идентификации (рис. 4).
Таким образом, фенольный комплекс генеративных органов тиса, представленный как фенилпропаноидами, так и флавоноида-ми, наиболее разнообразен у тиса ягодного. При этом спектр фенольного комплекса семян тиса менее разнообразен, чем таковой у вегетативных органов. Вероятно, это связано с тем, что метаболизм семени направлен преимущественно на биосинтез запасных веществ, необходимых для сохранения жизнеспособности зародыша во время покоя, ко -торый у семян тиса продолжается от 1,5 до 3-х лет.
Выяснение локализации полифенолов является неотъемлемой частью изучения фенольного метаболизма растений. Хотя полифенолы присутствуют во всех органах и тканях растений, они могут иметь различную локализацию, обусловленную их функциями.
Семена тиса округлые, поверхность гладкая, с маслянистым блеском. В зависимости от стадии развития окраска меняется: от зеленой у молодых до темно-бурой у зрелых семян. Мясистый красный присемянник в виде ягоды придаёт им декоративный вид. Семя тиса характеризуется хорошо развитой мезотестой (склеротестой), толстостенной эпидермой с очень толстым слоем кутикулы. Эндосперм тиса обильный, составляет основную массу семени и представлен крупными, плотно сомкнутыми, одинаковыми по размерам клетками без межклетников. Зародыш в зрелом семени бесхлорофильный, прямой, с недоразвитыми двумя прямыми семядолями, гипокотелем и корешком, по сравнению с эндоспермом его размеры очень малы (0,3*3,5 мм). Располагается от микропельной части эндосперма по центральной продольной оси семени. Апекс побега, заключенный между двумя семядолями, не дифференцирован и представлен группой меристемных клеток (рис. 2).
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018
Фенольные соединения в растительных тканях, в том числе и в тканях тиса, локализуются в специализированных клетках-вместилищах в виде гранулированного и аморфного материала, в клеточных стенках и реже - в межклетниках.
Исследование локализации фенольных соединений в семени тиса показало, что в наружной эпидерме и кутикуле присутствует лигнин, но основная часть полифенолов обнаружена в эндосперме, прилегающем к зародышу, где они находились в клеточных стенках (рис. 5 А). Выше при качественном исследовании фенольных соединений семени было показано, что в нем присутствуют фенолкарбоновые кислоты, флаваны и фла-вонолы. Флавоноиды в растительных клетках в основном находятся в гликозидированной форме, то есть могут являться своеобразной формой запасания сахаров.
В зародыше тиса наблюдались группы клеток-вместилищ (эпибласты) с полифенолами в базальной части семядолей, где растворимые фенольные вещества локализованы в них в виде мелкогранулированных включений (рис. 5 В). Данные части семядолей также содержали и флаваны в виде аморфного вещества. Группы клеток с фла-ванами располагались не только в базальной части зародыша, но и в подвеске (рис. 5 Б). Следует отметить, что окрашивание на суммарное содержание фенольных соединений в большинстве случаев совпадало с окрашиванием на флаваны, что подтверждено биохимическими исследованиями, показывающими доминирование последних в фе-нольном комплексе семян тиса.
Заключение
На основе изложенного выше можно заключить, что семена тиса так же, как и вегетативные органы, обладают способностью к биосинтезу большого числа фенольных соединений как простого строения, так и их полимерных форм. Данная локализация полифенолов в семени и зародыше тиса скорее всего определяется их функциями. Если наличие лигнина в семенной кожуре придает ей твердосемянность, то есть защиту от механических воздействий и патогенов,
37
то растворимые фенольные соединения, находящиеся внутри семени, скорее всего играют роль запасных и физиологически активных веществ.
Список литературы
1. Алексеева Г.М. Фармакогнозия. Под ред. Г.П. Яковлева / Г.М. Алексеева, Г. А. Белодубровская, К.Ф. Блинова [и др.]. Санкт-Петербург: СпецЛит, 2013.
2. Дубравина Г.А., Зайцева С.М., Загоскина Н.В. Изменения в образовании и локализации фенольных соединений при дифференциации тканей тиса ягодного и тиса канадского в условиях in vitro // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 755-762.
3. Запрометов М. Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения. LVI Тимирязевские чтения. М.: Наука. 1996. 45 с
4. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования // Биохимические методы в физиологии растений / Под ред. Павлиновой О. А. М.: Наука, 1971. С. 185-197.
5. Пасешникенко В. А. Регуляция терпеноидного биосинтеза в растениях и его связи с биосинтезом фе-нольных соединений // Физиология растений. 1995. Т. 42. № 5. С. 787-804.
6. Пашинина Л.Т. Методические указания к практикуму по качественному и количественному анализу природных полифенолов и углеводов // Каз.ГУ, 1979. С. 16-24.
7. Chattopadhyay S.K., Kulshrestha M., Tripathi V. Studies on the Himalayan yew Taxus wallichiana: Part VII - The taxoids and phenolic constituents of the roots of Taxus wallichiana (1999. Vol. 38b, P. 701) // Indian journal of chemistry section B-organic chemistry including medical chemistry. 2000. Vol. 39. I. 7. P. 562-566.
8. Pradier O., Rave frank M. Effect of paclitaxel in combination with radiation on human head and neck-cancer cells (zmk-1), cervical squamous-cell carcinoma (Caski), and breast adenocarcinoma cells (MCF-7) // Journal of cancer research and clinical oncology. 1999. Vol. 125. I. 1. P. 20-27.
9. Myranaka T., Kurose K. Utilization of extractives from Taxus Tree antifungal activities of flavonoids, Taxinine and its derivatives against Cochliobolus-Miyabeanus and Alternaria-Kikuchiana // Mokuzai Gakkaishi. 1999. Vol. 45. I. 1. P. 42-55.
10. Soukupova J. Histochemical and Biochemical Approaches to the Study of Phenolic Compounds and Peroxidases in Needles of Norway Spruce (Picea abies) / J. Soukupova, M. Cvikrova, J. Albrechtova [et al.] // New Phytol. 2000. V. 146. P. 403-414.
