CC BY
37
УДК 574.577
Ключевые слова: фенольные соединения, флаваны, флаванолы, локализация, диоскорея кавказская, микроклоны
Key words: phenolic compounds, flavanes, flavanols, localization, Dioscorea caucasia Lypsky, microclones
3Зайцева С.М., 1Доан Т.Т., Калашникова Е.А., 2Киракосян Р.Н.
О ВЛИЯНИИ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА СПОСОБНОСТЬ МИКРОКЛОНОВ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТЕНИЯ DIOSCOREA CAUCASIA LYPSKY К ОБРАЗОВАНИЮ И ЛОКАЛИЗАЦИИ ПОЛИФЕНОЛОВ
GROWTH REGULATORS' INFLUENCE AT THE ABILITY OF MEDICINAL PLANT DIOSCOREA CAUCASIA LYPSKY MICROCLONES TO POLYPHENOLS
FORMATION AND LOCALIZATION
'Вьетнамский национальный аграрный университет Адрес: Республика Вьетнам, г. Ханой
Vietnam National University of Agriculture Address: Republic of Vietnam, Hanoi 2ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К. А. Тимирязева» Адрес: 127550, Россия, Москва, Тимирязевская ул., д. 49 Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural Academy, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Address: 127550, Russia, Moscow, Timiryazevskaya st., 49 3ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии-МВА имени К.И. Скрябина» Адрес: 109472, Россия, Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named after K.I. Skryabin, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Address: 109472, Russia, Moscow, Academician Skryabin st., 23
Зайцева Светлана Михайловна, к. б. н., доцент каф. кормления и кормопроизводства.
E-mail: Smzaytseva@yandex.ru
Zaytseva Svetlana M., PhD of Biological Sciences, Associate Professor of the Feeding and Feed Production.
E-mail: Smzaytseva@yandex.ru Доан Тху Тхуи, к. б. н., доцент агрономического факультета. E-mail: doanthuycgct@gmail.com Doan Thu T., PhD of Biological Sciences Associate Professor of Agronomic Faculty. E-mail: doanthuycgct@gmail.com Калашникова Елена Анатольевна, д. б. н., профессор каф. генетики, селекции и биотехнологии.
E-mail: Kalash0407@mail.ru Kalashnikova Elena A., Doctor of Biological Sciences, Professor of the Genetics, Breeding and Biotechnology Dept.
E-mail: Kalash0407@mail.ru Киракосян Рима Нориковна, к. б. н., доцент каф. генетики, селекции и биотехнологии. E-mail: Mia4129@mail.ru Kirakosyan Rima N., PhD of Biological Sciences, Associate Professor of the Genetics, Breeding and Biotechnology Dept. E-mail Mia4129@mail.ru
Аннотация. Изучали образование и локализацию растворимых фенольных соединений в лекарственных растениях рода Диоскорея. Интактные растения Dioscorea caucasia Lypsky и индуцированные на их основе микроклоны обладают высокой способностью к биосинтезу разнообразных фенольных соединений. Было отмечено, что по мере вегетации растений образование биофлавоноидов увеличивается, достигая максимальных значений у многолетних корневищных тканей. Органоспецифичность к накоплению полифенолов, характерная для интактного растения, сохраняется и в условиях in vitro, но в менее выраженной степени. Для диоскореи наибольшей стимулирующей активностью к индуцированию образования микроклонов обладал синтетический препарат с цитокиновой активностью «Дропп», с увеличением концентрации препаратов в питательной среде увеличивался коэффициент размножения и биосинтез полифенолов в микроклонах. Полифенолы в растениях диоскореи локализовались в эпидермальных, паренхимных и проводящих тканях (в клеточных стенках, межклетниках и эпибластах).
Summary. Soluble phenolic compounds formation and localization in genus Dioscorea medicinal plants were studied. Intact plants Dioscorea caucasia and their induced microclones have a high capacity for biosynthesis of various phenolic compounds. It was noted that as plants grow, bioflavonoids formation increases, reaching the maximum values in perennial rhizome tissues. Intact plants characteristic organospecificity to polyphenols accumulation can persist in vitro, but not so hight. Biochemical data are confirmed by histochemical studies. A synthetic drug "Drop" with cytokine activity had
the most stimulating activity to induce microclones formation at Dioscorea, the multiplication factor and polyphenols biosynthesis in microclones increased with increasing of drugs concentration in the nutrient medium. Polyphenols in Dioscorea plants were localized in epidermal, parenchymal and conductive tissues (in cell wall, intercellular cells and epiblasts).
Введение
Сохранение биоразнообразия растений и создание генетических банков in vitro является одним из перспективных направлений биотехнологии, в частности - метод клонального микроразмножения. Данный метод позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество растений-регенератов, генетически идентичных исходному виду или форме, при недостатке исходного материала. Кроме того, растительные культуры in vitro используются в биотехнологии не только в качестве модельного объекта для изучения вторичного метаболизма, но и в качестве источника ценных биологически активных веществ для фармацевтической промышленности. В строго контролируемых условиях in vitro при модификации питательных сред и внешних условий возможно добиться определенной целевой направленности в продуцировании растительными культурами определенных продуктов вторичного метаболизма [7]. Экспериментально установлено, что не только клеточные культуры, но и микроклоны сохраняют характерную для интактных растений способность к синтезу вторичных соединений, в том числе и фенольной природы. Данное физиологическое свойство является базовой основой для использования культур в условиях in vitro и микроклонов как продуцентов ценных биологически активных веществ, применяемых в фармакологии.
Одной из перспективных культур для изучения вторичного метаболизма как в интакт-ном растении, так и в контролируемых условиях in vitro является диоскорея. Особенности вторичного метаболизма и способность к образованию веществ фенольной природы обуславливает широкое терапевтическое действие экстрактивных веществ диоско-реи. Растение обладает противоопухолевым действием, снижает содержание холестерина в крови, а также усиливает устойчивость к действию стрессовых абиотических и биотических факторов окружающей сре-
40
ды, а также обладает иммуномодулирую-щим и дерматотоническим свойством [1].
В медицине, в том числе и ветеринарной, используют препарат «Полиспонин» и «Диоспонин» для терапии и профилактики атеросклероза сосудов головного мозга и сердечно-сосудистой системы в сочетании с гипертонической болезнью. Препараты на основе диоскореи способны уменьшать ги-перхолестеринемию и отложение липидов в артериальных сосудах, увеличивать соотношение лецитин/холестерин, понижать артериальное давление, улучшать функцию сердца, расширять периферические сосуды, замедлять пульс, углублять дыхание, улучшать проведение импульсов к сердцу по блуждающему нерву и обладают холи-номиметическими свойствами. Существуют сведения, что диоскорея также используется при лечении ревматоидных артритов и подагры.
Широкое применение полифенолов в фармакологии в качестве биологически активных веществ основано на их способности к окислению с образованием хинных форм, что обуславливает их гепатопротекторные, нейрорегуляторные, капилляроукрепляю-щие, желчегонные и противоопухолевые свойства. Однако данных об образовании фенольных соединений в растениях рода Dioscorea немного, а сложность физиологических и биохимических процессов, происходящих в растениях диоскорея, в том числе и в условиях in vitro, остается еще недостаточно изученной.
В связи с тем, что в литературе практически отсутствуют данные об образовании и локализации фенольных соединений не только в интактных растениях рода Dioscorea, но и в микроклонах, целью нашего исследования являлось изучение образования и локализации этих веществ в растительных клетках диоскореи, культивируемых в условиях in vivo и in vitro в качестве потенциальных источников лекарственных препаратов, применяемых и для ветеринарной медицины.
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018
Материалы и методы
Объектом исследования служили растения диоскореи кавказской (Dioscorea caucasia Lypsky), произрастающие в природных условиях и пересаженные на участок редких и исчезающих растений Главного ботанического сада РАН (Москва). В качестве эксплантов использовали боковые и верхушечные почки, листовые пластинки, многолетние клубни и семена.
Стерилизацию растительных эксплантов проводили по схеме:
1) обработка КМп04 20 минут;
2) промывка дистиллированной водой;
3) стерилизация в 0,1 % растворе сулемы 7 мин;
4) промывка стерильной дистиллированной водой.
Для индукции образования пазушных побегов, адвентивных почек и микроклубней первичные экспланты культивировали на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга, а также различные вещества с цитокининовой и аук -синовой активностью. В качестве цитоки-нинов изучали влияние БАП, 21р, кинетина в концентрациях от 0,5 до 1,0 мг/л, а также препараты «Дропп» (0,01-1,0 мг/л) и «Цито-деф» (0,01-1,0 мг/л). Из веществ с ауксино-вой активностью изучали влияние НУК (0,51,0 мг/л), ИМК (1-7 мг/л) и ИУК (1-7 мг/л).
Экспланты культивировали при температуре 24 оС, в 16-часовом фотопериоде, при освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 3 тыс. лк.
Для укоренения микропобегов использовали модифицированную среду Мурасиге и Скуга, содержащую / нормы макросолей, 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, а также ИУК в концентрации 1 мг/л. Адаптацию растений проводили в контейнерах, содержащих про-автоклавированный субстрат.
Для извлечения фенольных соединений растительный материал измельчали, а затем подвергали экстракции горячим 96% этанолом. В экстрактах спектрофотометрическим методом определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений (с реактивом Фолина-Дениса), флаванов (с ванилиновым реактивом) и флавонолов (с хлористым
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018
алюминием). Калибровочные кривые для определения суммарного содержания растворимых фенольных соединений и флава-нов строили по (-)-эпикатехину, для определения флавонолов - по рутину [6].
Для гистохимического анализа в качестве объектов исследования использовали листья, побеги, корни и клубни интактных растений, а также микропобеги и микроклубни диоско-реи. Растительный материал резали при помощи микротома-криостата, толщина среза составляла 25 мкм.
Локализацию фенольных соединений определяли гистохимическими методами: на сумму фенольных соединений материал окрашивали 0,08 % раствором реактива «Fast Blue», для изучения локализации флаванов (катехинов и проантоцианидинов) использовали реакцию с ванилиновым реактивом в парах соляной кислоты, а для лигнина -окрашивание флорглюцином в серной кислоте. С целью сохранения внутриклеточного распределения фенольных соединений все реакции проводили в неполярных растворителях. Препараты просматривали с помощью светового микроскопа [10].
Результаты и обсуждение
Поскольку диоскорея относится к ценным исчезающим видам и имеет ограниченный ареал распространения в природе, большое практическое значение приобретает изучение их фенольного метаболизма как возможного источника биологически активных веществ и лекарственных препаратов не только в интактных растениях, но и в условиях in vitro.
Одной из основных задач исследований было выяснение особенностей накопления соединений фенольной природы (суммы растворимых фенольных соединений, флаванов и флавонолов) в различных органах интакт-ных растений диоскореи.
Все растения способны к биосинтезу полифенолов, причем некоторые соединения простого строения (фенилпропаноиды) имеют практически всеобщее распространение [5]. Исследователями отмечалось, что наиболее интенсивно их биосинтез происходит в молодых, активно вегетирующих органах.
4Г
В нашем случае показано, что исследуемые растения обладают высокой способностью к синтезу полифенолов, наибольшее их содержание отмечалось в корневищах. Аналогичные закономерности были отмечены не только для флаванов - высокореакционных низкомолекулярных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, но и для флавонолов, которые в зеленых тканях растений являются наиболее распространенными полифенолами.
Было установлено, что максимальное количество полифенолов накапливается в многолетних корневищах, где их содержание более чем в два раза превышает содержание таковых в молодых (рис. 1). Выявленное отличие в накоплении фенольных соединений в разных органах растений диоскореи еще раз свидетельствует о биохимической органоспе-цифичности, отмеченной в литературе [9].
Большое практическое значение приобретает получение культуры диоскореи кавказской in vitro не только как возможного источника биологически активных веществ и лекарственных препаратов, но и с целью сохранения исходных форм в природных условиях. Известно, что формообразовательные процессы в условиях in vitro происходят при наличии в составе питательной среды биологически активных веществ, таких как регуляторы роста, аминокислоты, растительные экстракты и др. [2]. К синтетическим регуляторам роста относятся препараты с цитокининовой активностью - «Дропп» и «Цитодеф». Исследования показали, что гормональный состав питательной среды приводил к изменению морфологических и физиологических процессов, которые проявлялись в формировании каллусной ткани
в основании первичного экспланта с одновременной регенерацией растений, индукцией развития меристем и в формировании микроклубней de novo. Микроклоны характеризовались интенсивным ростом, формированием мощной надземной биомассы.
Экспериментально установлено, что для диоскореи из всех изучаемых цитокининов наибольшей стимулирующей активностью к индуцированию образования микроклубней и побегов обладал препарат «Дропп», с увеличением концентрации которого в питательной среде (с 0,5 до 1,0 мг/л во всех вариантах) коэффициент размножения увеличивался. Однако, при этом формировались мелкие клубни и небольшие по размеру побеги, что подтверждается данными других исследователей. Все это еще раз свидетельствует, что гормональный состав питательной среды оказывает существенное влияние на процесс формирования микроклубней, и даже при концентрации препаратов «Цитодеф» и «Дропп» менее 0,01 мг/л в питательной среде отмечается положительное влияние на рост побегов и формирование микроклубней на протяжении длительного культивирования in vitro (рис. 2, 3).
На последнем этапе клонального микроразмножения целесообразно включать в состав питательной среды ИУК или ИМК в концентрациях (1-5) мг/л с целью увеличения коэффициента размножения и укоренения микропобегов.
Исследования, направленные на определение содержания биофлаваноидов у микроклонов диоскореи, показали, что их содержание было больше в микроклубнях, как и у интактных растений. Полученные данные согласуются и данными других исследовате-
Рис. 1. Содержание растворимых фенольных соединений в корневищах интактных растений диоскореи.
Рис. 2. Влияние препаратов Дропп и Цитодеф на морфометрические показатели микроклонов растений диоскореи.
42
лей, показавших, что культуры in vitro сохраняют идентичную тенденцию к образованию и накоплению полифенолов, характерных для интактных тканей. Однако способность к синтезу вторичных соединений в микроклонах была ниже, чем у исходных тканей. В наших исследованиях было показано, что содержание биофлавоноидов в микроклонах диоскореи было ниже по сравнению с исходными тканями интактных растений (рис. 4). Вероятно, это связано с тем, что в процессе культивирования микропобегов в условиях in vitro наблюдается выделение полифенолов в питательную среду, что может приводить к их ингибирующему действию на ткани культивируемых эксплантов. Кроме того, ранее многими авторами было показано, что присутствие в составе питательной среды различных регуляторов роста оказывает определенное влияние на способность культур in vitro к синтезу полифенолов [3]. В наших экспериментах было установлено, что существенное увеличение биосинтеза полифенолов наблюдается в микроклонах,
полученных на питательных средах, содержащих препарат «Дропп» в концентрации 0,01 мг/л. Именно в этих вариантах микроклоны характеризовались интенсивным ростом и формированием мощной надземной биомассы, в последнем случае - адвентивных корней. Это согласуется с данными других исследователей, показавших, что клеточные культуры сохраняют способность к синтезу вторичных соединений, характерных для ин-тактных тканей, однако учитываемый показатель в микроклонах ниже, чем у исходных тканей [8].
Специфические гистохимические реакции позволили обнаружить эти вторичные вещества в эпидермальных, паренхимных и проводящих тканях, где они локализовались в клеточных стенках, межклетниках и в специализированных фенолзапасающих эпибластах. В стебле большая часть растворимых фенольных соединений локализовалась в эпидермальных клетках, где они встречались как в клеточных стенках, так и в вакуолях. В содержимом всех клеток эпидер-
-
■ ■
0.01Д-Г1НУК 0.01Цг1НУК liflHYh
и Сумма растворимы* фенольных соединении Флаваны
а
Рис. 4. Содержание растворимых фенольных соединений в микроклубнях (а) и микрокорнях (б) диоскореи in vitro.
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018 43
Рис. 5. Локализация фенольных соединений: а - в корневищных клубнях диоскореи; б - в побеге диоскореи; в - е локализация фенольных соединений в микроклоне диоскореи, ж - микроклон диоскореи. (а,б,г - реакция на флаваны (с ванилиновым реактивом), в, д, е - реакция на сумму растворимых фенольных соединений (с реактивом 'ТаБШШе")).
мы флаваны присутствовали в виде аморфного вещества (рис. 5). У части паренхимных клеток полифенолы располагались в вакуолях, реже - в клеточных стенках. На начальных этапах формирования почки отмечалось повсеместное их присутствие. Позже полифенолы единично встречались в некоторых клетках сформировавшейся почки и образовывали ряд клеток, как бы отделяющий ее от паренхимной ткани побега. Такое пограничное распределение различных классов полифенолов неоднократно наблюдалось и на других растительных объектах [4]. Ряд клеток с растворимыми фенольными соединениями располагался в первичной коре стебля, а также во флоэме и ксилеме. Корневищные клубни диоскореи накапливали растворимые фенольные соединения в покровных и запасающих тканях. Очень яркая реакция на флаваны отмечалась в эпидермальных клетках, как в самих клубнях, так и в столонах.
Было показано единичное накопление полифенолов в первичной коре и повсеместное -в клетках центрального цилиндра корневищ, где преобладали флаваны. В листьях полифенолы локализовались в клетках эпидермы, мезофилла и в клеточных стенках механических тканей. Флаваны обнаружены в эпидерме замыкающих клеток устьиц и в вакуолях некоторых клеток мезофилла (рис 5. а, б). Следует отметить, что реакция на флаваны преобладала и совпадала с окрашиванием на сумму растворимых фенольных соединений, что согласуется и с биохимическими данными, где мажорными компонентами феноль-ного комплекса являлись именно флаваны.
При проведении гистохимических исследований локализации растворимых феноль-ных соединений в микроклонах прослеживалась идентичность таковой в интактных растениях. Однако интенсивность окрашивания была несколько ниже, что согласуется
44
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018
с данными по количественному содержанию полифенолов в микроклонах. Растворимые фенольные соединения локализованы в клетках эпидермальной, паренхимной и проводящей тканей. В замыкающих клетках устьиц так же, как и в интактных растениях, отмечается гистохимическая реакция на флаваны, но степень ее выраженности менее интенсивна. В отличие от интактного растения, в клетках мезофилла встречаются обособленные эпибласты с гранулированными включениями (рис. 5 в). Единичные фенолзапасающие клетки обнаружены в сердцевине стебля. В корневищных клубнях, образованных на микроклонах ди-оскореи в условиях in vitro, фенольные соединения также обнаружены в эпидер-мальных тканях (в клеточных стенках), а также в клетках паренхимы и в некоторых клетках первичной коры и центрального цилиндра корневищ. Отмечалось формирование группы клеток с полифенолами, которые были приурочены к проводящим тканям (рис. 5 е). Реакция на флаваны (с ванилиновым реактивом) совпадала с окрашиванием на сумму растворимых фе-нольных соединений (реакция с «Fast Blue»), что согласуется и с биохимическими данными, где мажорными компонентами фенольного комплекса являлись именно флаваны.
Заключение
На основе изложенного выше можно заключить, что растения диоскореи обладают высокой способностью к биосинтезу большого числа разнообразных фенольных соединений как простого строения, так и их полимерных форм, что несомненно имеет важное практическое значение как потенциальный источник ценных биологически активных веществ для фарминдустрии, причем в образовании биофлавоноидов наблюдается органоспецифичность, и способность к их накоплению по мере вегетации увеличивается, достигая максимальных значений у многолетних корневищных тканей. Данная тенденция в образовании полифенолов, характерная для интактного растения, сохраняется и в условиях in vitro,
но в менее выраженной степени. Биохимические данные находят подтверждение при гистохимических исследованиях. Данная локализация полифенолов в диоскорее скорее всего определяется их физиологическими функциями. Если наличие полифенолов в надземной части диоскореи играет роль медиаторов в физиологических и биохимических процессах, а также определяет защиту от механических воздействий и патогенов, то растворимые фенольные соединения, находящиеся в корневищах, скорее всего играют роль запасных и физиологически активных веществ.
Список литературы
1. Алексеева Г.М. Фармакогнозия. Под ред. Г.П. Яковлева / Г.М. Алексеева, Г. А. Белодубровская, К.Ф. Блинова [и др.]. Санкт-Петербург: СпецЛит, 2013.
2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.
3. Действие кенетина на дифференциацию и образование фенольных соединений в каллусной культуре чайного растения / М. Н. Запрометов, В.Ю. Стрекова, Г.А. Субботина, Н.В. Загоскина // Физиология растений. 1986. Т. 33. № 2. С. 356-364.
4. Дубравина Г.А., Зайцева С.М., Загоскина Н.В. Изменения в образовании и локализации фенольных соединений при дедифференциации тканей тиса ягодного и тиса канадского в условиях in vitro // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 755-762.
5. Запрометов М. Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения. LVI Тимирязевские чтения. М.: Наука, 1996. 45 с.
6. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования // Биохимические методы в физиологии растений. Наука, 1971. С. 185-197.
7. Носов, А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений / Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. Под редакцией Р.Г. Бутенко. М. Наука. 1991.
8. Bhaising S.R., Maheshwari V.L. Plant tissue culture -a potential source of medicinal compounds // J. Scientific and Industrial research. 1998. Vol. 57. P. 703-708.
9. Chattopadhyay S.K., Kulshrestha M., Tripathi V. Studies on the Himalayan yew Taxus wallichiana: Part VII - The taxoids and phenolic constituents of the roots of Taxus wallichiana (1999. Vol. 38b, P. 701) // Indian journal of chemistry section B-organic chemistry including medical chemistry. 2000. Vol. 39. I. 7. P. 562-566.
10. Soukupova J. Histochemical and Biochemical Approaches to the Study of Phenolic Compounds and Peroxidases in Needles of Norway Spruce (Picea abies) / J. Soukupova, M. Cvikrova, J. Albrechtova [et al.] // New Phytol. 2000. Vol. 146. P. 403-414.
45
