CC BY
114BIOLOGICAL SCIENCES
FEATURES OF MICROCLONAL REPRODUCTION OF MEDICINAL PLANTS OF THE GENUS DIOSCOREA WITH HIGH BIOFLAVANOID FORMATION IN VITRO
Kalashnikova E.
Doctor in Biological Sciences, Professor, Department of genetics, breeding and biotechnology Moscow state agricultural University MTAA named after K. A. Timiryazev
Zaytseva S.
Associate Professor, PhD in Biological Sciences Moscow state Academy of veterinary medicine and biotechnology named after K. I. Skryabin
Doan Thu Thuy
Associate Professor, PhD in Biological Sciences Vietnam National University of Agriculture
Kirakosyan R.
Associate Professor, PhD in Biological Sciences, Department of genetics, breeding and biotechnology
Moscow state agricultural University MTAA named after K. A. Timiryazev
ОСОБЕННОСТИ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ РОДА DIOSCOREA С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ БИОФЛАВАНОИДОВ В УСЛОВИЯХ IN
VITRO
Калашникова Е.А.
д.б.н. профессор кафедры генетики, селекции и биотехнологии Государственного аграрного университета МСХА имени К.А. Тимирязева
Зайцева С.М.
к.б.н. доцент кафедры кормления и кормопроизводства Московской Государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии МВА имени К.И. Скрябина
Доан Тху Тхуи к.б.н. доцент агрономического факультета Вьетнамский национальный аграрный университет
Киракосян Р.Н.
к.б.н., доцент кафедры генетики, селекции и биотехнологии Государственного аграрного университета МСХА имени К.А. Тимирязева
Abstract
The formation and localization of soluble phenolic compounds (bioflavonoids) in medicinal plants of the genus Dioscorea were studied. Intact plants Dioscorea nipponica Makino and induced on their basis microclones have a high ability to biosynthesis of various phenolic compounds. Organospecificity to the accumulation of polyphenols, characteristic of the intact plant, is maintained in vitro, but to a less pronounced extent. For Yam the most stimulating activity to induce the formation of microclonal possessed a synthetic drug with cytokine activity - Droрp, with the increase of the concentration of drugs in the nutrient medium increased the multiplication factor and the biosynthesis of polyphenols in microclone. Biochemical data are confirmed by histochemical studies. Bioflavonoids in plants of Dioscorea were localized in epidermal, parenchymal and conducting tissues (in cell walls, intercellular spaces and epiblasts).
Аннотация
Изучали образование и локализацию растворимых фенольных соединений (биофлаваноиды) в лекарственных растениях рода Диоскореи. Интактные растения Dioscorea nipponica Makino и индуцированные на их основе микроклоны обладают высокой способностью к биосинтезу разнообразных фенольных соединений. Отмеченная органоспецифичность к накоплению полифенолов, характерная для интактного растения, сохраняется и в условиях in vitro, но в менее выраженной степени. Для диоскореи наибольшей стимулирующей активностью к индуцированию образования микроклонов обладал синтетический препарат с цитокиновой активностью - Дропп, с увеличением концентрации которого в питательной среде увеличивался и биосинтез полифенолов в микроклонах. Биохимические данные находят подтверждение при гистохимических исследованиях. Полифенолы в растениях диоскореи локализовались в эпидермальных, паренхимных и проводящих тканях (в клеточных стенках, межклетниках и эпибластах).
Keywords: phenolic compounds, flavanes, flavanols, localization, Microclonal reproduction, Dioscorea nipponica Makino.
Ключевые слова: фенольные соединения, флаваны, флаванолы, локализация, диоскорея ниппон-ская, микроклональное размножение.
Сохранение биоразнообразия растений и создание генетических банков in vitro является одним из перспективных направлений биотехнологии. Благодаря клональному микроразмножению возможно получать в кратчайшие сроки растения-ре-генранты генетически идентичные исходному ин-тактному растению, численность которого мала или находится на грани полного исчезновения, что позволяет сохранять ценные лекарственные растения в естественных ареалах произрастания. Кроме того, сохранение растительных ресурсов в банке in virto дает возможность изучать растения-реге-нранты в качестве источников вторичных метаболитов, которые являются ценными биологически активными веществами, широко применяемые в фармацевтической промышленности. Экспериментально установлено, что не только каллусные культуры, но и микроклоны сохраняют способность к синтезу вторичных соединений, в том числе и фе-нольной природы, которые характерны для интакт-ных растений [1, 2]. Данное физиологическое свойство является базовой основой для использования клеточных культур in vitro и микроклонов при проведении исследований в качестве модельных объектов.
Одной из перспективных и интересных культур для изучения вторичного метаболизма, как в интактном растении in vivo, так и в культуре in vitro является диоскорея ниппонская (Dioscorea nippon-ica Makino). Особенности вторичного метаболизма и способность к образованию веществ фенольной природы, обуславливает широкое терапевтическое действие экстрактивных веществ диоскореи. Растение обладает противоопухолевым действием, снижает содержание холестерина в крови, а также усиливает устойчивость к действию стрессовых абиотических и биотических факторов окружающей среды, обладает иммуномодулирующим и дермато-тоническим свойством [3].
В медицине, в том числе и ветеринарной используют препараты «Полиспонин» и «Диоспо-нин» для терапии и профилактики атеросклероза сосудов головного мозга и сердечно- сосудистой системы в сочетании с гипертонической болезнью. Препараты на основе диоскореи способны уменьшать гиперхолестеринемию и отложение липидов в артериальных сосудах; увеличивает соотношение лецитин/холестерин, понижают артериальное давление, улучшает функцию сердца, расширяет периферические сосуды, замедляет пульс, углубляет дыхание, улучшает проведение импульсов к сердцу по блуждающему нерву и обладают холиномиметиче-скими свойствами. Существуют сведения, что дио-скорея также используется при лечении ревматоидных артритов и подагры.
Широкое применение полифенолов в фармакологии в качестве биологически активных веществ основано на их способности к окислению с образованием хинных форм, что обуславливает их гепатопротекторные, нейрорегуляторные, капиля-роукрепляющие, желчегонные и противоопухолевые свойства [4]. Однако данных об образовании
фенольных соединений в растениях рода Dioscorea немного, а сложность физиолого-биохимических процессов, происходящих в растениях диоскореи, в том числе и в условиях in virto, остается еще недостаточно изученной.
Кроме того, исследователи сталкиваются с рядом трудностей при введении в культуру in virto растений с высоким содержанием полифеолов, а микроклональное размножение некоторых высокопродуктивных лекарственных растений не доступно. В связи с тем, что в литературе практически отсутствуют данные об образовании и локализации фенольных соединений в клетках и тканях не только интактных растений рода Dioscorea, но и в микроклонах, размноженных in vitro, то приоритетным направлением наших исследований являлось изучение этих процессов в растительных клетках микроклонов D. nipponica Makino, а также получение жизнеспособных высокопродуктивных растений-регенерантов.
Методы и материалы.
Объектом исследования служили растения диоскореи ниппонской (Dioscorea nipponica Makino) произрастающие в природных условиях и пересаженные на участок редких и исчезающих растений Главного ботанического сада РАН (Москва). В качестве эксплантов использовали боковые и верхушечные почки, листовые пластинки, многолетние клубни и семена.
Стерилизацию растительных эксплантов проводили по схеме: 1) обработка KMnO4 - 20 минут; 2) промывка дистиллированной водой; 3) стерилизация в 0,1% растворе сулемы - 7 мин; 4) промывка стерильной дистиллированной водой.
Для индукции образования пазушных побегов, адвентивных почек и микроклубней первичные экспланты культивировали на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Му-расига и Скуга, а также различные вещества с цито-кининовой и ауксиновой активностью. В качестве цитокининов изучали влияние БАП, 2iр, кинетина в концентрациях от 0,5 до 1,0 мг/л, а также препараты Дропп и Цитодеф в концентрациях 0,01-1,0 мг/л. Из веществ с ауксиновой активностью изучали влияние НУК (0,5-1,0 мг/л), ИМК (1-7 мг/л) и ИУК (1-7 мг/л).
Экспланты выращивали в условиях световой комнаты, где поддерживалась температура 240С, 16-ти часовой фотопериод и освещение белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 3 тыс. лк.
Для укоренения микропобегов использовали модифицированную среду Мурасиге и Скуга, содержащую 'У нормы макросолей, 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, а также ИУК в концентрации 1 мг/л. Адаптацию растений проводили в контейнерах, содержащих проавтоклавированный субстрат.
Для извлечения фенольных соединений растительный материал измельчали, а затем подвергали экстракции горячим 96%-ным этанолом. В экстрактах спектрофотометрическим методом определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений (с реактивом Фолина-Дениса), флаванов (с
ванилиновым реактивом) и флавонолов (с хлористым алюминием). Калибровочные кривые для определения суммарного содержания растворимых фенольных соединений и флаванов строили по (-)-эпикатехину, для определения флавонолов - по рутину [5]. В таблицах представлены средние арифметические значения из трех биологических параллельных и их стандартные отклонения.
Для гистохимического анализа в качестве объектов исследования использовали, листья, побеги, корни и клубни интактных растений, а также микропобеги и микроклубни полученные in vitro. Растительный материал резали при помощи мик-ротома-криостата, толщина среза составляла 25 мкм. Локализацию фенольных соединений определяли гистохимическими методами: на сумму фенольных соединений материал окрашивали 0,08% растром реактива Fast Blue, изучения локализации флаванов (катехины и проантоциани-дины) использовали реакцию с ванилиновым реактивом в парах соляной кислоты, а для лигнина -окрашивание флорглюцином в серной кислоте. С целью сохранения внутриклеточного распределения фенольных соединений, все реакции проводили в неполярных растворителях. Препараты просматривали с помощью светового микроскопа [6].
Исследования проводили в 5-ти биологических и 3-х аналитических повторностях. Статистическая обработка экспериментальных данных выполнена на основе методов математической статистики. На графиках представлены средние
арифметические значения с доверительными интервалами на 5%-ом уровне значимости.
Результаты и обсуждения.
Поскольку диоскорея ниппонская относится к ценным исчезающим видам и в природе имеет ограниченный ареал распространения, то большое практическое значение приобретают работы по клональному микроразмножению, а также по изучению фенольного метаболизма этих растений in vitro и in vivo.
На первых этапах исследований необходимо установить особенности накопления соединений фенольной природы, в частности, суммы растворимых фенольных соединений, флаванов и флавоно-лов, в различных органах интактных растений дио-скореи.
В наших исследованиях установлено, что изучаемые первичные экспланты (побеги, однолетние корневища, многолетние корневища), изолированные с интактных растений, обладают высокой способностью к синтезу биофлаваноидов, где наибольшее их содержание отмечалось в корневищах (Рис. 1). Аналогичные закономерности характерны и для флаванов, высокореакционных низкомолекулярных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами. Что касается флавонолов, то их содержание было отмечено только в побегах, так как их биосинтез приурочен к хлоропластам [7]. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей, а также с ранее полученными нашими данными по диоскореей кавказской (Dioscorea caucasia Lypsky) [8].
90 80
Z 70
и
<o 60 %
50
о
* 40 и
< 30
s 20 10 0
I.
побеги
многолетние корневища
■ Сумма содержания фенольных соединения мг/г сухой масы
■ Флаваны мг/г сухой массы
■ Флаванолы мг/г сухой массы
Рис. 1. Содержание растворимых фенольных соединений в интактных растениях диоскореи ниппонской
Таким образом, установленные нами различия в накоплении фенольных соединений в разных органах интактных растений диоскореи ниппонской, еще раз подтверждает, что биосинтез продуктов вторичного метаболизма характеризуется органо-специфичностью [9].
В настоящее время для диоскореи ниппонской большое практическое значение приобретает разработка технологий ее клонирования и получения каллусных и суспензионных культур in vitro. Это
связано не только с целью сохранения исходных форм в природных условиях, но и возможностью их использования в качестве источников биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Известно, что формообразовательные процессы в условиях in vitro происходят при наличии в составе питательной среды биологически активных веществ, таких как регуляторы роста, аминокислот, растительных экстрактов и др. [10]. Помимо гормо-
нального состава питательной среды процесс кал-лусогенеза и морфогенеза зависит от типа первичного экспланта. Так, в нашей работе каллусную ткань индуцировали из изолированных зародышей. Экспланты культивировали на питательной среде, содержащей минеральные соли по МС, 1 г/л гидро-лизат казеина, 1 г/л активированного угля, 0,2 мг/л НУК, а также 1 мг/л БАП. В этих условиях каллу-
сная ткань, полученная из изолированных зародышей, характеризовалась плотной консистенцией, имела белый или светло-желтый цвет и обладала высокой пролиферативной активностью. Причем последующий перенос ее на питательные среды, содержащие низкие концентрации гормонов (кинетин 0,1 мг/л) приводил к формированию микроклубней, из которых в дальнейшем развивались растения-ре-генеранты (Рис. 2 А, Б, В).
Рис 2. Внешний вид каллусных культур диоскореи нипонской, полученных из семян (А-В)
На следующем этапе исследований необходимо было установить наилучшие ауксины и цито-кинины, их концентрации и сочетания для индукции образования растений-регенерантов. Экспериментально установлено, что для диоскореи ниппонской из всех изучаемых цитокининов наибольшей стимулирующей активностью к индуцированию образования микроклубней и побегов обладал препарат Дропп, с увеличением концентрации которого в питательной среде коэффициент размножения увеличивался. Однако при этом формировались мелкие клубни и не большие по размеру побеги. В дальнейшем, полученные микропобеги переносили на среду для укоренения. В качестве ауксинов в состав питательной среды добавляли ИУК или ИМК в концентрации 1-5 мг/л. В этих условиях культивирования, полученные
микроклоны характеризовались интенсивным ростом и формированием мощной надземной биомассы. Причем, наиболее благоприятным ауксином для микроразмножения являлась ИМК, в то время как ИУК проявила слабый эффект на изучаемый процесс. В дальнейшем микрорастения успешно прошли адаптацию к нестерильным условиям выращивания (Рис. 3).
На последнем этапе исследований необходимо установить зависимость содержания биофла-ваноидов от типа исследуемой ткани. Так содержание биофлаваноидов было больше в микроклубнях, по сравнению с побегами микроклонов. Полученные данные полностью согласуются с результатами нашей работы с интактными растениями in vivo, однако следует отметить, что способность к синтезу вторичных соединений в микроклонах была ниже, чем у исходных тканей [11].
А. Ж Б. 1 В. I
Рис. 3. Микроклоны диоскореи ниппонсокой (А), формирование микроклубней в пазухе листа (Б) и адаптированные растения к нестерильным условиям выращивания (В)
Вероятно, это связано с тем, что в процессе культивирования микропобегов в условиях in vitro наблюдается выделение полифенолов в питательную среду, что может приводить к их ингибирую-
щему действию на ткани культивируемых эксплан-тов. Именно в этих вариантах микроклоны обладали высокой биосинтетической способностью к образованию полифенолов, а также характеризова-
лись интенсивным ростом, формированием мощной биомассы и адвентивных корней. Все это согласуется с данными других исследователей, показав-
ших, что клеточные культуры сохраняют способность к синтезу вторичных соединений, но в меньшей степени по сравнению с исходными формами [12].
60
3 50 и и
| 40
'I 30
х >
^ 20 I 10 0
0,01Д+ 1НУК
■ Сумма содержания фенольных соединения мг/г сухой масы
■ Флаваны мг/г сухой массы
■ Флаванолы мг/г сухой массы
Рис. 4 Содержание растворимых фенольных соединений в микроклубнях диоскореи ниппонсокой
Специфические гистохимические реакции позволили обнаружить у растений-регенерантов диоскореи ниппонсокой растворимые фенольные соединения, представленные флаванами и флаванои-дами в эпидермальных, паренхимных и проводящих тканях. Локализация полифенолов наблюдалась в клеточных стенках, межклетниках и в специализированных фенол запасающих эпибла-
стах, в виде аморфного вещества или граннулиро-ванных включений различной степени агрегации (Рис. 5). В микроклюбнях гистохимическая реакция на флаваны (с ванилиновым реактивом) совпадала с окрашиванием на сумму растворимых фенольных соединений (реакция с Fast Blue), что согласуется и с биохимическими данными, где мажорными компонентами фенольного комплекса являлись именно флаваны.
Рис 5. Локализация фенольных соединений в развивающейся микропочке на экспланте (А), в листке микроклона (Б) и микроклубнях диоскореи ниппонской (В).
При проведении гистохимических исследований локализации растворимых фенольных соединений в микроклонах прослеживалась тенденция, которая была характерна и для интактных растений. Однако интенсивность окрашивания была несколько ниже, что согласуется с данными по количественному содержанию полифенолов в микроклонах [13].
На основе изложенного выше, можно заключить что растения диоскореи ниппонской обладают высокой способностью к биосинтезу большего числа разнообразных фенольных соединений, как простого строения, так и их полимерных форм, что несомненно имеет важное практическое значение как потенциальный источник ценных биологически
активных веществ для Фарминдустрии. Причем в образовании биофлавоноидов наблюдается органо-специфичность, которая, в менее выраженной степени, сохраняется и в условиях in vitro. Данная локализация полифенолов в диоскорее, скорее всего, определяется их физиологическими функциями, в качестве медиаторов в физиолого-биохимических процессах, а также запасных и физиологически активных веществ [14,15]. Синтетические регуляторы роста с цитокининовой активностью (особенно препарат Дропп), оказывают яркое стимулирующее влияние не только на процесс клонального микроразмножения, но и на биосинтетическую активность в отношении веществ фенольной природы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Носов, А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений/ А.М.Носов// Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. Под редакцией Р.Г. Бутенко. М. Наука. - 1991.
2. Takeda H, Kotake T. Expression and function of cell wall-bound cationic peroxidase in Asparagus somatic embryogenesis // Plant physiology preview, 2003, Vol. 131, P. 1765-1774.
3. Алексеева Г.М., Белодубровская Г.А., Блинова К.Ф., Гончаров М.Ю., Жохова Е.В., // Фармакогнозия. Лекарственное сырье растительного и животного происхождения. Под редакцией Г.П. Яковлева Санкт-Петербург. СпецЛит 2013 г.
4. Тюкавкина Н.А. Биофлавоноиды. - М.: Издательский дом «Русский врач». 2002. 56 с.
5. Запрометов М. Н. Фенольные соединения и методы их исследования // Биохимические методы в физиологии растений. Наука, 1971. С. 185197.
6. Soukupova J., Cvikrova M., Albrechtova J..Histochemical and Biochemical Approaches to the Study of Phenolic Compounds and Peroxidases in Needles of Norway Spruce (Picea abies) // New Phytol. 2000. V. 146. P.403-414.
7. Запрометов М. Н. Николаева Т.Н. Способность изолированных хлоропластов из листьев фасоли осуществлять биосинтез фенольных соединений //Физиология растений. 2003. Т. 50. .№ 5. С. 699702.
8. Доан Тху Тхуи, Калашникова Е.А., Зайцева С.М., Киракосян Р.Н Фенольные соединения растений Диоскореи кавказской (Dioscona caucasica
Lipsky), особенности их образования и локализации. // Естественные и технические науки. 2018 №2 С.24-27
9. Chattopadhyay, S.K. Studies on the Himalayan yew Taxus wallichiana- part VII- The taxoids and phenolic constituents of the roots of Taxus wallichiana // Indian journal of chemistry section B- organic chemistry including medical chemistry. 2000. - Vol.39. - I.7. - P. 562-566.
10. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. / Р.Г. Бутенко - М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.
11. Калашникова Е.А., Зайцева С.М., Доан Тху Тхуи, Киракосян Р.Н. Изучение биологической активности экстрактов, полученных из микроклонов лекарственных растений различных таксономических групп в условиях in vitro // Ветеринария, зоотехния и биотехнология № 2, 2018. С.50-58
12. Bhaising, S.R. Plant tissue culture - a potential source of medicinal compounds / S.R. Bhaising, V.L. Maheshwari // J. Scientific and Industrial research. -1998. - V. 57. - P. 703-708.
13. Дубравина Г.А., Зайцева С.М., Загоскина Н.В. Изменения в образовании и локализации фе-нольных соединений при дедифференциации тканей тисса ягодного и тисса канадского в условиях in vitro // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 755762.
14. Dixon R., Paiva N., Stress-indused phynylpro-panoid metabolism // Plant cell, 1995, Vol. 7, P. 10851097.
15. Grandmaison J, Olah GM, Van Calsteren MR, Furlan V Characterization and localization of plant phenolics likely involved in the pathogen resistance expressed by endomycorrhizal roots. // My-corrhiza 1993 3:155-164
