CC BY
247
УДК 615.322
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ ПУСТЫРНИКА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
© Зиэп Т. Т. Нго, Е.В. Жохова
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, ул. Профессора Попова, 14, Санкт-Петербург, 197376 (Россия)
E-mail: caltha@mail.ru
Предложено проводить оценку качества травы пустырника пятилопастного (Leonurus quinquelobatus Gilib.j и травы пустырника японского (Leonurus japonicus Houtt.j по содержанию суммы флавоноидов с использованием метода дифференциальной спектрофотометрии. Изучены условия извлечения флавоноидов из сырья. Определена оптическая плотность окрашенного комплекса с алюминия хлоридом при длине волны 400 нм для травы пустырника пятилопастного и 410 нм для травы пустырника японского. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в траве L. quinquelobatus в разные фазы вегетации составило 1,01-1,37%. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве L. japonicus из разных мест произрастания составило 0,81-2,71%. Относительная ошибка предложенной методики - 1,51 и 1,54% соответственно.
Введение
Род пустырник (Leonurus L.) включает около 25 видов, произрастающих по всему миру: в Европе, Азии, Африке и Америке; 13 видов встречаются на территории России [1]. В Фармакопею XI издания [2] включена трава пустырника (производящие растения: пустырник сердечный - L. cardiaca L. и пустырник пятилопастный - L. quinquelobatus Gilib.), препараты которой применяются в качестве седативного средства. Изменение №5 к частной статье ГФ XI предусматривает оценку качества сырья травы пустырника по содержанию иридоидов в пересчете на Государственный стандартный образец (ГСО) гарпагида ацетата, который является недоступным для многих лабораторий.
Под тем же названием Herba Leonuri в Фармакопеи Вьетнама и Китая включена трава пустырника японского - L. japonicus Houtt., которая используется в составе многих гинекологических и утеротонических сборов, а метод количественного определения содержания действующих веществ в сырье и препаратах пустырника японского вообще отсутствует.
Химический состав сырья указанных видов пустырника разнообразен и представлен флавоноидами, алкалоидами, кумаринами, дубильными веществами, терпеновыми соединениями [3-6]. Среди этого комплекса биологически активных веществ особо выделяются флавоноиды как группа соединений, имеющая широкий спектр фармакологической активности.
Цель настоящего исследования - разработка методики количественного определения суммы флавонои-дов в траве пустырника пятилопастного и траве пустырника японского с использованием метода дифференциальной спектрофотометрии.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Объектами исследования послужили образцы сырья пустырника пятилопастного, культивируемого в Ленинградской области (питомник лекарственных растений СПХФА), а также образцы пустырника японского, произрастающего на территории Вьетнама, Китая и культивируемого в Ленинградской области. Траву заготавливали в разные фазы вегетации, срезая олиственные верхушки побегов длиной до 40 см и толщиной стебля не более 0,5 см. Сушку осуществляли воздушно-теневым способом, разложив сырье тонким слоем и периодически переворачивая. Затем сырье измельчали и просеивали через сито с диаметром отверстий 1, 2 и 5 мм. Влажность сырья определяли по методике ГФ XI [7]. Статистическую обработку результатов проводили по общепринятой методике [7].
Методом хроматографии в тонком слое сорбента с использованием пластин «Sorbfil-ПТСХ-П-А-УФ» в системе хлороформ-этилацетат-кислота уксусная (4 : 10 : 5) установили, что одним из основных компонентов суммы флавоноидов, присутствующих в траве пустырника пятилопастного, является цинарозид, а в траве пустырника японского - рутин. На регистрирующем спектрофотометре «Shimadzu» (Япония) - «UV 1240 mini» снимали спектры спиртовых извлечений из образцов сырья в диапазоне длин волн от 360 до 450 нм. Максимум поглощения окрашенного комплекса спиртового извлечения из травы пустырника пятилопастного с раствором алюминия хлорида наблюдался при длине волны 400±2 нм. Аналогичный максимум поглощения отмечен для комплекса ГСО цинарозида (лютеолин-7-глюкозид) с алюминия хлоридом (рис. 1). Максимум поглощения окрашенного комплекса спиртового извлечения из травы пустырника японского с раствором алюминия хлорида наблюдался при длине волны 410±2 нм. Аналогичный максимум поглощения отмечен для комплеса ГСО рутина с алюминия хлоридом (рис. 2). Это дает возможность использовать длину волны 400 нм в качестве аналитической для пустырника пятилопастного и 410 нм - для пустырника японского.
При разработке методики количественного определения суммы флавоноидов изучали условия экстракции в зависимости от степени измельченности сырья, соотношения сырья и экстрагента, концентрации спирта этилового, времени экстрагирования и полноты комплексообразования с 1% спиртовым раствором алюминия хлорида. Наиболее полное извлечение определяемых веществ достигалось с использованием 70% спирта этилового, в образцах сырья со степенью измельченности 1 мм, временем экстрагирования 2 ч и соотношением сырья и экстрагента 1 : 100 (табл. 1, 2).
Стабильность комплекса определяемой суммы флавоноидов травы пустырника пятилопастного и ГСО цинарозида достигается после 20 мин, устойчивость комплекса сохраняется в течение 15-20 мин. Стабильность комплекса определяемой суммы флавоноидов травы пустырника японского и ГСО рутина достигается после 40 мин, устойчивость комплекса сохраняется в течение 20-30 мин.
Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве пустырника. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 0,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 70% спирта этилового. Колбу взвешивали с погрешностью ±0,01 г, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры колбу вновь взвешивали и доводили до первоначальной массы 70% спиртом этиловым. Содержимое колбы фильтровали через воронку диаметром 7 см с вложенным ватным тампоном, отбрасывая первые 20 мл фильтрата.
Длина волны, нм
Длина волны, нм
Рис. 1. Спектры поглощения окрашенных комплексов с алюминия хлоридом: 1 - раствор ГСО цинарозида; 2 - извлечение 70% спиртом этиловым из травы пустырника пятилопастного
Рис. 2. Спектры поглощения окрашенных комплексов с алюминия хлоридом: 1 - раствор ГСО рутина; 2 - извлечение 70% спиртом этиловым из травы пустырника японского
Таблица 1. Влияние условий экстракции
на суммарное содержание флавоноидов в траве пустырника пятилопастного
Таблица 2. Влияние условий экстракции
на суммарное содержание флавоноидов в траве пустырника японского
Условия экстракции Содержание флавоноидов, % Условия экстракции Содержание флавоноидов, %
Размер частиц, мм Размер частиц, мм
1,00 1,01 1,00 0,81
2,00 0,85 2,00 0,66
5,00 0,53 5,00 0,51
Экстрагент спирт этиловый, % Экстрагент спирт этиловый, %
40 Помутнение раствора, ис- 40 Помутнение раствора, ис-
пользуемого для спектрофо- пользуемого для спектрофо-
тометрии, трудность фильт- тометрии, трудность фильт-
рования рования
70 1,01 70 0,81
95 0,88 95 0,66
Соотношение сырья и экстрагента Соотношение сырья и экстрагента
1 : 25 0,78 1 : 25 0,65
1 : 50 0,95 1 : 50 0,75
1 : 100 1,01 1 : 100 0,81
1 : 120 1,00 1 : 120 0,81
Время экстракции, мин (70% спирт этиловый, соотно- Время экстракции, мин (70% спирт этиловый, соотно-
шение 1 : 100) шение 1 : 100)
40 0,73 40 0,64
60 0,85 60 0,73
90 0,92 90 0,77
120 1,01 120 0,81
180 0,99 180 0,80
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 2 мл профильтрованного извлечения, добавляли 2 мл 1% раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом и доводили объем раствора 95% спиртом этиловым до метки. Для приготовления раствора сравнения в другую колбу вместимостью 25 мл помещают 2 мл фильтрата и доводят до метки 95% спиртом этиловым. Измерение оптической плотности проводили через 20 минут на спектрофотометре при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм для пустырника пятилопастного и через 40 мин на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм для пустырника японского. Параллельно измерили оптическую плотность раствора ГСО цинарозида (для пустырника пятилопастного) и рутина (для пустырника японского). Для этого 2 мл 0,02% раствора стандарта помещали в мерную колбу 25 мл, прибавляли 2 мл 1% раствора алюминия хлорида и доводили до метки 95% спиртом этиловым.
Суммарное содержание флавоноидов в сухом сырье в пересчете на стандарт и абсолютно сухое сырье вычисляли по формуле:
X D х m0 х 50 х100 _ D0 х m х (100 - W),
где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность раствора ГСО стандарта; m - масса сырья, г; m0 - масса ГСО стандарта, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Примечание. Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) цинарозида: около
0,01 г (точная навеска) ГСО цинарозида, предварительно высушенного при температуре 130-135 °С в течение 3 ч, растворяли в 85 мл 95% спирта этилового в мерной колбе местимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждали, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивали.
Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина: около 0,02 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135 °С в течение 3 ч, растворяли в 85 мл 95% спирта этилового в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждали, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивали.
Обсуждение результатов
Для проверки воспроизводимости методики проведено 8 независимых определений для каждого вида сырья. Результаты статистической обработки свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% не превышает 5% (табл. 3, 4).
С целью исключения систематической ошибки методики проведены опыты с добавками цинарозида к навеске сырья пустырника пятилопастного и рутина к навеске сырья пустырника японского. Установлено, что относительная ошибка метода не превышает ±5%, т.е. находится в пределах случайной ошибки разработанной методики, что указывает на отсутствие систематической ошибки (табл. 5, б).
Разработанная методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов была апробирована на образцах сырья из разных мест произрастания, заготовленных в различные фазы вегетации. Наиболее высокое содержание суммы флавоноидов наблюдалось в образцах сырья пустырника японского, культивируемого в Ленинградской области, и составило до 2,7б±0,04% в фазе активного роста. Результаты представлены в таблицах 7 и 8.
Таблица 3. Результаты количественного
определения суммарного содержания флавоноидов в траве пустырника пятилопастного и их метрологическая характеристика
Таблица 4. Результаты количественного
определения суммарного содержания флавоноидов в траве пустырника японского и их метрологическая характеристика
№ Содержание Метрологическая № Содержание Метрологическая
определения флавоноидов, % характеристика определения флавоноидов, % характеристика
1 0,98 X = 1,01 1 0,83 X = 0,81
2 1,03 S = 0,0185 2 0,82 S = 0,0151
3 1,00 S x = 0,0065 3 0,82 S x = 0,0053
4 1,02 t(95%, 7) = 2,36 4 0,79 t(95%, 7) = 2,36
5 1,02 Ax = 0,0437 5 0,80 Ax = 0,0356
б 0,99 A x = 0,0153 б 0,79 A x = 0,0125
7 1,01 є = 4,33% 7 0,81 є = 4,40%
8 1,03 є = 1,51% 8 0,82 є = 1,54%
Таблица 5. Результаты количественного определения суммарного содержания флавоноидов в траве пустырника пятилопастного с использованием метода добавок ГСО цинарозида
Содержание флаво-ноидов в 1 г сырья, мг Добавлено ГСО цинарозида, мг Содержание флавоноидов, мг Относительная ошибка, %
должно быть найдено
10,1 7,3 17,4 17,4 0
10,1 7,3 17,4 17,2 -1,1
10,1 14,6 24,7 24,5 -0,8
Таблица б. Результаты количественного определения суммарного содержания флавоноидов в траве пустырника японского с использованием метода добавок ГСО рутина
Содержание флаво-ноидов в 1 г сырья, мг Добавлено ГСО рутина, мг Содержание флавоноидов, мг Относительная ошибка, %
должно быть найдено
8,1 4,7 12,8 12,9 +0,8
8,1 4,7 12,8 12,6 -1,6
8,2 5,3 13,5 13,9 +3,0
Таблица 7. Результаты количественного определения суммарного содержания фланоноидов в траве пустырника пятилопастного
Место сбора Дата сбора Фаза вегетации Содержание флавоноидов, %
Ленинградская область 30.06.2006 Массовое цветение 1,01±0,02
Ленинградская область 02.08.2006 Начало плодоношения 1,37 ±0,02
Таблица 8. Результаты количественного определения суммарного содержания фланоноидов в траве пустырника японского
Место сбора Дата сбора Фаза вегетации Содержание флавоноидов, %
Ленинградская область 09.2006 Активный рост 2,7б±0,04
Ленинградская область 09.2006 Начало бутонизации 2,58±0,04
Южный Китай 06.2006 Начало бутонизации 1,б3±0,03
Северный Вьетнам 06.2006 Начало бутонизации 1,73±0,03
Южный Вьетнам 07.2006 Массовое цветение 0,81±0,01
Выводы
1. Изучены условия экстракции и спектрофотометрического определения флавоноидов в траве пустырника пятилопастного и траве пустырника японского.
2. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве пустырника пятило-пастного в пересчете на цинарозид и траве пустырника японского в пересчете на рутин. Относительная ошибка предложенной методики составила 1,51 и 1,54% соответственно.
3. Определено, что образцы сырья пустырника японского, культивируемого в Ленинградской области, имеют довольно высокое содержание флавоноидов в сравнении с образцами, собранными в местах естественного произрастания данного вида.
Список литературы
1. Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР). СПб., 1995. 989 с.
2. Государственная фармакопея СССР. XI издание. Вып. 2. М., 1990. 398 с.
3. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Сем. Hippuridaceae -Lobeliaceae. СПб., 1991. 198 с.
4. Phan Minh Giang, Phan Tong son, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki Otsuka. New Labdane-Type Diterpenoids from Leonurus heterophyllus Sw. // Chem.Pharm.Bull. 2005. V. 53. №8. P. 938-941.
5. Phan Minh Giang, Phan Tong son, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki Otsuka. New Bis-spirolabdane-Type Diterpenoids from Leonurus heterophyllus Sw. // Chem.Pharm.Bull. 2005. V. 53. №11. P. 1475-1479.
6. Chao Z., Ma L.L., Zhou X.J. Determination of stachydrine and leonurine in Herba Leonuri by ion-pair reserved-phase high-performance liquid chromatography // Di Yi Jun Da Xue Xue Bao. 2004. V. 24. №11. P. 1223-1226.
7. Государственная фармакопея СССР. XI издание. Вып. 1. М., 1987. 334 с.
Поступило в редакцию 7 апреля 2007 г.
