CC BY
172
Химия растительного сырья. 2000. №1. С. 85-88.
УДК 615.322
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В МАНЖЕТКЕ ОБЫКНОВЕННОЙ ALCHEMILLA VULGARIS L.S.L.
© В.Ю. Андреева, Г.И. Калинкина
Сибирский государственный медицинский университет, Томск (Россия), e-mail: oal@pharm.tsu.ru
Оценку качества травы манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L.s.l., рекомендуемой в качестве гемореологиче-ского средства, предложено проводить по содержанию флавоноидов. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии. Изучены условия извлечения флавоноидов из сырья 70%-ным этанолом: соотношение сырья и экстрагента 1 : 100, время двукратного извлечения на кипящей водяной бане 45 и 35 мин. В качестве комплексообразователя использовали 2%о-ный раствор алюминия хлорида. Оптическую плотность окрашенного комплекса определяли при длине волны 400 нм. Расчет суммы флавоноидов проводили с использованием удельного показателя поглощения государственного стандартного образца цинарозида. Относительная ошибка предложенной методики - 2,9%. Содержание флавоноидов в надземной части манжетки обыкновенной из разных мест произрастания составляет 4,0-8,1%.
Введение
В надземной части манжетки обыкновенной нами обнаружен богатый комплекс биологически активных веществ, среди которых преобладают фенольные соединения и вещества полисахаридной природы. Особую значимость в манжетке имеют фенольные соединения, а именно: флавоноиды, которые, как показано в эксперименте, могут обусловливать гемореологические свойства данного растения [1]. На основании этого мы предлагаем вести стандартизацию сырья манжетки по флавоноидам.
Целью настоящего исследования является разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки обыкновенной с использованием дифференциальной спектрофотометрии.
Экспериментальная часть
Для количественного определения флавоноидов в сырье манжетки обыкновенной нами предлагается методика, основанная на их способности образовывать окрашенный комплекс со спиртовым раствором алюминия хлорида, который вызывает батохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения и при этом дает основной максимум поглощения при длине волны 400 нм. Аналогичный максимум поглощения при длине волны 400 нм отмечен для комплекса государственного стандартного образца (ГСО) лютеолин-7-гликозида (цинарозида) [2], использованного нами в методике в качестве стандартного образца (рис. 1). Присутствие данного гликозида в манжетке подтверждено нами хроматографически [3]. Использование в качестве контроля испытуемого раствора без реактива позволяет исключить влияние окрашенных и других сопутствующих веществ.
Автор, с которым следует вести переписку.
D1
0,S
0,б
0,4
0,2
0
1
нм
2S0 300 320 340 3б0 3S0 400 420 440 4б0 4S0
Рис.1. УФ-спектры комплексов с A1C13 70%-ного экстракта Alchemilla vulgaris L.s.l (1) и ГСО цинарозида [2]
Установлено, что наиболее полное извлечение целевых веществ достигается при соотношении сырья и экстрагента 1 : 30 (дальнейшее увеличение этого соотношения не приводит к повышению выхода флавонои-дов из сырья). Для экстракции использовался 70%-ный этанол, так как гликозиды флавоноидов манжетки практически равнозначно извлекаются как 40%, так и 70%-ным этанолом (6,35% и 6,20% соответственно).
Максимальное извлечение флавоноидов из сырья происходило при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником двукратно в течение 45 и 30 мин (табл. 1).
При определении оптимального количества 2% раствора алюминия хлорида, используемого в качестве комплексообразующего реагента, установлено, что наиболее стабильные результаты получаются при соотношении экстракта и раствора комлексообразователя 1 : 1 .
Максимальное время прохождения комплексообразующей реакции составляло 20 мин, устойчивость комплекса сохраняется в течение 20-30 мин. Раствор ГСО готовили в соответствии с временной фармакопейной статьей ВФС 42-1940-89.
С целью пересчета содержания суммы флавоноидов в траве манжетки на цинарозид изучены комплексы раствора ГСО цинарозида с хлоридом алюминия, удельный показатель которых при аналитической длине волны (400 нм) составляет 145,0 ± 2,3. На этом основании в формулу расчета включено теоретическое зна-
Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки обыкновенной.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 70%-ного спирта, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 45 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяют еще раз указанным выше способом в течение 35 мин. Извлечение фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу, фильтр промывают 70%-ным спиртом и доводят объем фильтрата спиртом до метки (раствор А).
2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 2%-ного раствора хлорида алюминия в 95%-ном спирте и доводят объем раствора 95%-ным спиртом до метки; через 20 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют следующий раствор: 2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 каплю разведенной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора 95%-ным спиртом до метки.
Таблица 1. Динамика извлечения флавоноидов 70%-ным этанолом из надземной части манжетки обыкновенной
Время извлечения, мин Содержание суммы флавоноидов, %
I II Всего
30 20 50 4.90
45 35 80 5.98
60 40 100 5.90
90 30 120 5.85
Параллельно измеряют оптическую плотность комплекса раствора стандартного образца лютеолина-7-гликозид с хлоридом алюминия.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:
Х = Рх • V • Уз 100 .
145 ш- У2 • (100-
где Бх - оптическая плотность испытуемого раствора; У1 - объем раствора А (мл); У2 - объем аликвоты взятой из раствора А (мл); У3 - объем раствора В (мл); ш - масса сырья (г); W - потеря в массе при высушивании сырья (%); 145 - удельный показатель поглощения комплекса лютеолин-7-гликозида с алюминия хлоридом при длине волны 400 нм.
Разработанная методика была апробирована на образцах сырья из разных мест произрастания. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что содержание суммы флавоноидов в траве манжетки обыкновенной составляет от 4 до 8,1% (табл. 2, 3).
Результаты статистической обработки полученных данных показали, что ошибка единичного определения при доверительной вероятности 95% находится в пределах 2,9%.
Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были поставлены опыты с добавлением в спиртовое извлечение манжетки заведомо известного количества лютеолин-7-гликозида, которые показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения. Это свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики (табл. 4).
Таблица 2. Содержание флавоноидов в надземной части Alchemilla vulgaris в зависимости от места сбора
Наименование образца Содержание флавоноидов, %
Томская обл., окр.пос. Светлый, разнотравно-злаковый луг, июль 1996, цветение 4,50±0,25
Окр. Томска, смешанный разреженный разнотравный луг, июнь 1997, цветение 7,10±0,35
Окр. Томска, берег р. Ушайки, разнотравный луг, июль 1995, цветение 6,20±0,30
Томская обл., окр. пос. Лоскутово, опушка смешанного леса, июль 1997, цветение 7,20±0,32
Красноярский кр., окр. Ачинска, опушка смешанного леса, июль 1997, цветение 8,10±0,35
Окр. Челябинска, разнотравный луг, июль 1997, цветение 6,20±0,30
Таблица 3. Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы флавоноидов в манжетке обыкновенной Alchemilla vulgaris L.s.l.
f Х S S2 P t(P,f) AX E E3
Сумма флавоноидов 7 6,05 0,2 0,04 95 2,36 0,18 2,9 1,69
Таблица 4. Результаты количественного определения суммы флавоноидов в сырье манжетки обыкновенной с использованием добавок ГСО цинарозида
Содержание флавоноидов в 1 .0 г сырья, мг Добавлено ГСО цинарозида, мг Найдено флавоноидов, мг Ошибка абсолютная, мг Ошибка относительная, %
56,90 4,0 (в сырье) 61,98 1,08 1,74
62,65 4,0 (в сырье) 67,92 1,27 2,19
55,89 4,0 (в экстракт) 61,34 1,45 2,82
55,85 4,0 (в экстракт) 61,24 1,39 2,26
Таким образом, разработанная методика количественного определения суммы флавоноидов может быть использована для оценки качества травы манжетки обыкновенной по содержанию основной группы биологически активных соединений.
Выводы
1. Изучены условия извлечения и спектрофотометрического определения флавоноидов из надземной части манжетки обыкновенной по реакции с алюминия хлоридом.
2. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в сырье манжетки обыкновенной в пересчете на цинарозид. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 95% находится в пределах 2,9%.
Список литературы
1. Плотников М.Б., Колтунов А.А., Алиев О.И., Калинкина Г.И., Березовская Т.П., Андреева В.Ю. Гемореологические свойства экстрактов из некоторых растений, содержащих флавоноиды // Раст. ресурсы. 1998. №1. С. 87-90.
2. Временная Фармакопейная статья. Лютеолин -7-гликозид - стандартный образец. Цинарозид. (ВФС 42- 1940-89).
3. Андреева (Коваленко) В.Ю., Березовская Т.П., Калинкина Г.И. Исследование манжетки обыкновенной как возможного гемореологического средства. // Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений. Новосибирск. 1 998. С. 96-97.
Поступило в редакцию 1б февраля 2000 года
