Разработка метода иммуноферментного анализа для диагностики вирусного гепатита С, основанного на выявлении вирусных антигенов core и Е2 в сыворотке крови Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Мир вирусных гепатитов 3 (2009)

правилами ^Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений» СанПиН 2.1.7.728-99 использованные перчатки должны быть помещены в дезинфицирующий раствор. На наш взгляд несогласованность и не достаточная обоснованность требований нормативных документов существенно затрудняет организацию экстренной профилактики профессионального заражения медицинских работников инфекциями с гемоконт.1ктным механизмом передачи.

S6. Разработка метода иммупоферментного анализа для диагностики вирусного гепатита С, основанного на выявлении вирусных антигенов

core и Е2 в сыворотке крови

Е.А. Рыжиков Закрытое акционерное общество «Эпитек», г. Новосибирск

Возможность детектировать антигены вируса гепатита С (ВГО в пробах печепи, сыворотки тяммм была продемонстрирована более 10 лет назад. Для детекции использовали только антиген core ВГС, поскольку иммунодоминантный эпитоп этого белка консервативен ;щя большинства известных штаммов. Было показано, ч'до core антиген ВГС удается выявлять в более чем 80% слз'чаев на следующий-день посЯе первого обнаружения РНК ВГС, часто core антител ВГС

обнаруживается в сыворотках кропи при наличие анти-ВГС антител и ГНК ВГС. Чувствительность лучших иммуноферментных тост-систем по ьыявлению core антигена ВГС соответствует примерно 500 копий/мя^РНК ВГС в анализе методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Исследователи наблюдали высокую корреляцию межлу содержанием РНК ВГС, измеренною ПЦР, и детекцией антигена core ВГС методом иммуноферментного анализа (ИФА), которая для разных модификаций ИФА варьитюзала от 94% до 96%, однако, зсе эти параметры достигались в образцах, которые были взяты задолго до появления акти-core ВГС антител. При наличии вирусспецифических антител в исследуемых пробах, приходится вводить процедуру деза1регации иммунных комплексов, при этом удается обнаружить не менее 1,5-2 пк/мл антигена.

Целью работы являлась разработка ИФА метода диагностики антигенов ВГС в обрззиах сыворотик крови, положительных по антиВГС антителам, получение диагностических пар антител для выявления антигенов ВГС, сравнительная характеризация эффективности ИФА диагностики антигенов с помощью разработанных антител и выявления вирусной РНК методом ПТ {Р.

Методами теоретической биологии были спроектированы структуры антигенных пептидов, несущих эпитопы консервативных и вариабельных районов структурных белков ВГС

Результаты. В рамках настоящей работы с целью создания диагностических антител, способных взаимодействовать с большим ко,тичеством вариантов HYR1, был спроектирован набор последовательностей, которые были изготовлены с применением методики библиотечного твердофазного пептидного синтеза. Разработанная схема синтеза библиотеки пептидов позво,хяет синтезировать смеси пептидов с содержанием целевых последовательностей не менее 80%. Предложенная концепция предполагает возможность выявления множества зарнантов вариабельных поверхностных антигенов ВГС, что практически не реализуемо при использовании технологии моноклональных антител. Выбор пары диагностических антител проводился на основании анализа пространственной структуры белков core и Е2, с учетом взаимной пространствашой ориентации белков Е2 на поверхности внриона Спроектированные пептиды были синтезированы и введены в состав иммуногенных конструкции, с помощью которых была проведена игямунизация животчых-донорсв. Из сыворотки крови иммунных животных методом аффинной хроматографии выделено четыре моноэпитопных антитела, которые представляют собой две пары диагностических антител. Одна Пара диагностических антите;. нредназначена для выявления по консервативным эпитопам антигена core вируса гепатита С, вторая пара диагностических антител предназначена для выявления антигена Е2 по вариабельным эпитопам. Массив из 37 образцов плазмы крови положительных по антиВГС антителам и с концентрацией РНК ВГС от 1С3 до 10s МЕ/мл использовали для изучения возможности количественного определения антигенов ВГС в сыворотке крови в присутствии ВГС специфичных антител. Методом ИФА антигенов ВГС наб; додали ;Гипсшт}то зависимость оптической плотности, нормированной по ОПкрит, от концентрации РНК ВГС с коэффициентом корреляции 0,8. В массиве сывороток пара ^диагностических антител к эпитопам антигена core выявляла 89% образцов, а пара диагностических антител к эпитопам антигена Е2 выявляла 95% образцов. Предел чувствительности ИФА тест-системы по определению антигенов core соответствовал 2149 'HtHjÊtm РНК ВГС.

Заключение. Разработанные пары диагностических антител позволяют выявлять антигены ВГС без предварительной обработки образцов с целью разрушения иммунных комплексов. 30