ПОДТВЕРЖДАЮЩЕЕ ТЕСТИРОВАНИЕ на АНТИТЕЛА к ВИРУСУ ГЕПАТИТА С с ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОСНОВНЫХ ИММУ НО ДОМИНАНТНЫХ ЭПИТОПОВ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ПОДТВЕРЖДАЮЩЕЕ ТЕСТИРОВАНИЕ на АНТИТЕЛА к ВИРУСУ ГЕПАТИТА С с ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОСНОВНЫХ ИММУНОДОМИНАНТНЫХ ЭПИТОПОВ

Р.Мартенс, Г.Мартене, Е.Саблон

«Инноджинетикс», Бельгия

Введение. Вирус гепатита С (HCV) составляет род в семействе Флавивирусов с близкой гомологией к вирусам гепатита G и GB и Пестивирусам. Его геном, представленный положительной РНК, кодирует по крайней мере девять белков; белки Core, El и Е2 составляют структурные белки; NS3, NS4A, NS4B NS5A и NS5B являются неструктурными белками. Скрининг на антитела к HCV, проводимый на станциях переливания крови и в клинических лабораториях, обычно проводится в соответствии с алгоритмом, включающим первичный скрининг с использованием различных технологий (в том числе ИФА, МЕА и др.) с последующим исследованием в подтверждающих тестах, таких как LIA или RIBA. Молекулярно-биологические методы детекции вирусной нуклеиновой кислоты (NAT) могут привлекаться для диагностики острой инфекции и для скрининга на станциях переливания крови. Использование подтверждающих тестов с оптимальным покрытием иммунодоминантных эпитопов является ключевым фактором для достоверной диагностики и для верификации положительных результатов, полученных в скрининговых исследованиях.

Методы. Концепция технологии подтверждающих тестов на полосках INNO-LIA использует синтетические пептиды и рекомбинантные белки HCV, Эти пептиды и белки нанесены и фиксированы в виде отдельных линий, расположенных в строго определенном порядке для удобства считывания результата на полосках нитроцеллюлозы, что позволяет осуществлять многопараметровое подтверждающее тестирование на наличие специфических антител к антигенам HCV, Подтверждающий тест «INNO-LIA HCV Ab III Update» относится к тестам третьего поколения, включает антигены HCV, относящиеся к региону Core, гипервариабельному региону Е2, региону NS3, кодирующему геликазу, а также иммунодомииантные эпитопы, относящиеся к регионам NS4A,NS4BnNS5A.

Для того, чтобы повысить специфичность и увеличить чувствительность подтверждающего теста, два синтетических пептида, представляющих различные кластеры иммунодоминантных эпитопов региона Core HCV, нанесены в виде двух отдельных линий. Для подтверждения сероконверсии к белкам гипервариабельного региона Е2 в подтверждающем тесте использованы несколько пептидов из различных изолятов HCV, причем положительные результаты сероконверсии имеют сильную корреляцию с выявлением РНК HCV. Геликазный регион ORF NS3 включен в подтверждающий тест в виде рекомбинантного mTNF фьюжн-белка, экспрессированного в системе E.coli, антительный ответ к которому доминирует во время сероконверсии. Подтверждение сероконверсии к антигенам регионов NS4A и NS4B достигается с использованием пептидов основных эпитопов регионов NS4A и NS4B, выбранных по их перекрестной реактивности с различными генотипами HCV. Использованный пептид из региона NS5A включает 4 наиболее важных в отношении сероконверсии эпитопа. NS5B не включен в подтверждающий тест из-за данных о наличии неспецифических реакций.

Результаты. Сравнительные испытания по определению чувствительности подтверждающих тестов INNO-LIA HCV Ab III Update и RIBA HCV 3.0 были проведены с использованием 14 сероконверсионных панелей BBI. Полученные результаты показали, что INNO-LIA HCV Ab III Update была более чувствительна, исходя из более раннего выявления сероконверсии в образцах сывороток на 10 сероконверсионных панелях, и выявила такую же чувствительность (сходный результат), как RIBA HCV 3.0 на 4 из 14 панелей BBI. Дополнительно в исследование были включены 24 образца сывороток из низкотитражных панелей и панелей сывороток со смешанными титрами. На всех

образцах сывороток из низкотитражных панелей и панелей сывороток со смешанными титрами INNO-LIA HCV Ab III Update показал лучший уровень реактивности по сравнению с RIBA HCV 3.0 и подтверждающим тестом Recomblot. Специфичность подтверждающего теста оценена экспериментально при тестировании 588 сывороток от серонегативных доноров и составила 100% (или 96,4%. Включая неопределенные результаты).

Выводы. Применение в конструкции сочетания смеси синтетических пептидов и рекомбинантных белков из основных иммунодоминантных эпигонов HCV позволило создать подтверждающий тест INNO-LIA HCV Ab III Update на антитела к HCV с превосходной специфичностью и чувствительностью для определения статуса инфицирования вирусом гепатита С, что является основополагающим условием для раннего выявления антител к РСМ в процессе сероконверсии.

ИММУНОФЕРМЕНТНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА НУКЛЕОКАПСИДА (CORE)

ВГС в СЫВОРОТКАХ БОЛЬНЫХ ХГС О.В.Масалова, Т.В.Вишневская, Т.В.Шкурко, Е.И.Келли, А.А.Кущ

НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Инфекционная клиническая больница

№1, г. Москва

Цель работы состояла в сопоставлении результатов определения core-белка в сыворотках больных ХГС с клиническими, биохимическими, гистологическими и вирусологическими данными пациентов.

Материалы и методы. Соге-белок ВГС в сыворотках 98 пациентов с ХГС определяли с помощью оригинального разработанного нами количественного сэндвич-варианта ИФА с применением моноклональных антител (МКА). Метод позволяет дифференцировать циркулирующие в крови вирионы и иммунные комплексы (ИК). Наличие РНК ВГС в сыворотках и ткани печени определяли методом RT-PCR. Белки ВГС (core, NS3, NS4, NS5) в печени выявляли на криостатных срезах биопсий методом иммунопероксидазного окрашивания с помощью МКА. Антитела к различным белкам ВГС в сыворотках определяли в подтверждающей тест-системе «ИФА-анти-НСУ-спектр» (НПО «Диагностические системы», Н. Новгород).

Результаты. Соге-белок ВГС был обнаружен в сыворотках 80 пациентов (82%), из них у 36% больных core циркулировал преимущественно в виде свободных вирионов, у 48% - исключительно в составе ИК, у 16% больных обнаружена социркуляция вирионов и ИК. Минимальная концентрация core в сыворотках составляла 20 пг/мл, максимальная -более 2 нг/мл (в среднем 391±95 пг/мл). Определение core коррелировало с результатами выявления РНК ВГС в сыворотках (г=0,5, р<0,0001). Core-позитивные пациенты (соге»+») отличались от core-негативных (core»-») большей тяжестью хронического гепатита: 1) повышенный уровень фермента АЛТ имели 85% пациентов соге»+» и только 61% - соге»-» (р=0,03); 2) воспалительно-некротические процессы в ткани печени были более выражены в группе соге»+» (р<0,05); 3) пациенты с тяжелым фиброзом и циррозом печени встречались только среди больных соге»+» (р<0,05), при этом 12 из 15 таких пациентов обнаружены в группе с циркулирующими ИК; 4) большинство пациентов соге»+» (63%) имели антитела к белку NS5 ВГС, тогда как аналогичный показатель у больных core»-» составлял 39% (р<0,05). Ранее мы показали, что антитела к NS5 ассоциируются с более тяжелым течением ХГС; 5) соге»+» пациенты чаще содержали ВГС (вирусные белки или РНК) в ткани печени - 86% и 56% пациентов соответственно (р=0,007).

Полученные данные показали, что разработанный ИФА-метод количественной детекции core-белка является эффективным инструментом для оценки вирусной нагрузки