CC BY
10
Всероссийская научно-практическая
конференция с международным участием Санкт-Петербург
«АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ» 30-31 мая 2019 г.
А. С. Поляков, Я. А. Носков, Ю. В. Никитин, Д. К. Жоголев, А. Д. Золотарёв, Ю. Е. Пучкова
ФГБВОУ ВО Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова, Санкт-Петербург
РАЗРАБОТКА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ EX VIVO МОДЕЛЕЙ И ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БЛАСТНЫХ КЛЕТОК ПРИ ОСТРЫХ МИЕЛОИДНЫХ ЛЕЙКОЗАХ
Введение. Отсутствие заметного прогресса в оказании помощи при острых миелоидных лейкозах (ОМЛ) в течение нескольких десятилетий, а также высокая фенотипическая и ге-нотипическая разнородность этой группы заболеваний определяют актуальность развития персонифицированных подходов к терапии, в том числе, основанных на определении индивидуальной химиочувствительности опухолевых клеток.
Цель работы. Разработка индивидуальных ex vivo моделей ОМЛ и методов изучения химиочувствительности бластных клеток для оценки перспектив внедрения персонифицированных подходов к терапии ОМЛ.
Материалы и методы. Бласты, полученные из периферической крови или костного мозга пациентов с различными формами ОМЛ культивировали в полной питательной среде (ППС), состоящей из 80 % RPMI-1640, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 10 % оригинальной сыворотки больного, 10 мкл ФГА и 100 ЕД/мл пенициллина. Для определения химиочувствительности клеточной линии к противоопухолевым препаратам были адаптированы к локальным условиям и отработаны 2 метода: микроядерный тест (Метод-1) и флуоресцентная сортировка клеток с определением жизнеспособности по маркировке свободной ДНК (Метод-2). В Методе-1, после предварительного культивирования (24 час.), в пробы добавляли разведенные в ППС препараты или чистую ППС (контроль). Была оценена генотоксичность нескольких противоопухолевых препаратов: цитарабин, даунорубицин, идарубицин, миток-сантрон, интерферон альфа-2а, децитабин (каждый до 3 разведений в ППС, в диапазоне фармакологических сведений о средней равновесной концентрации in vivo). Через 48 час добавляли цитохалазин для блока цитокинеза. Через 24 час готовили микропрепараты и определяли соотношение количества клеток с микроядрами к клеткам без митотического патоморфоза, а также общее количество микроядер на 100 клеток. В Методе-2 для сортировки окрашенных антителами CD34 PE, 7 AAD Viability Dye
(Beckman Coulter, USA) образцов использовали клеточный сортер MoFlow Astrios EQ (Beckman Coulter, USA) с тремя лазерами (200мВт 488нм, 55мВТ 405нм, 100мВт 645нм), стандартным набором фильтров, насадкой сопла Jet-in-air 70 мкм, давлением 59,7-60 psi для потока обжимающей жидкости IsoFlow (Beckman Coulter) и 60,9-61,1 psi для потока образца, скоростью анализа до 10000 событий в секунду. Из 300 мкл периферической крови в 2 пробирки отсортировали по 520650 CD34+ жизнеспособных клеток. Клетки культивировали 4 суток (5 мл полной питательной среды, 37 °C, 5 % CO2). В одну из проб после первых суток добавили децитабин в концентрации 1160 нг на 1 мл среды. На 5 сутки маркировкой свободной ДНК определили количество клеток, сохранивших жизнеспособность.
Результаты. Из бластов периферической крови или костного мозга пациентов с ОМЛ удалось получить морфологически однородные стабильные клеточные линии, пригодные для определения чувствительности к противоопухолевой терапии. В Методе-1 кратность различий генотоксичности между всеми пробами и контролем составляла от 1,7 до 14,4 в зависимости от добавленного в пробу препарата. Таким образом, была показана информативность микроядерного теста для определения химиочувствительности бластов in vitro. В Методе-2 удалось показать сохранение достаточной для ограниченного культивирования жизнеспособности отсортированных CD34+ клеток. Однако в связи с отсутствием необходимых для стабильного роста много-цитокиновых сред, погибших клеток в обеих пробах оказалось значительно больше, чем ожидалось. Тем не менее, в пробе с добавлением децитабина живых бластных клеток осталось почти в 2 раза меньше, чем в контроле (9330 и 17633 клеток соответственно), что подтвердило потенциальную информативность и этой методики.
Выводы. Применение результатов определения химиочувствительности выделенных от конкретного больного бластных клеток в мо-
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XV, № 3, 2019
дели ex vivo является одним из перспективных направлений разработки персонифицированных схем терапии. И даже несмотря на то, что пока непосредственный перенос результатов изучения опухолевых клеток вне организма в клиническую практику имеет определенные сложности, полученные при помощи таких методов сведения уже сейчас могут, как минимум, помочь избежать назначения заведомо неэффек-
тивных для конкретного пациента препаратов. Это может способствовать снижению общей токсичности терапии и предупреждению развития множественной лекарственной резистентности. В дальнейшем мы планируем усовершенствовать и дополнить предлагаемые методики культивирования и оценки химиочувствительности опухолевых клеток, расширить спектр испытываемых фармакологических агентов.
Е. А. Попонина, Е. В. Бутина, А. В. Йовдий, Г. А. Зайцева, Н. В. Минаева
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства», Киров
ОСОБЕННОСТИ ПРЯМОЙ ПРОБЫ КУМБСА У ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПАЦИЕНТОВ
Введение. Течение онкогематологических заболеваний может сопровождаться развитием аутоиммунных осложнений, в том числе, появлением антиэритроцитарных аутоанти-тел. Для обнаружения антител и компонентов комплемента на поверхности эритроцитов применяется прямая проба Кумбса (ППК), дифференцированный вариант которой позволяет полуколичественно оценить фиксировавшиеся на эритроцитах иммуноглобулины и определить их подкласс.
Цель исследования. Изучить особенности дифференцированной ППК у онкогематологических больных.
Материалы и методы. Результаты ППК проанализированы у 250 онкогематологических больных, впервые госпитализированных в клинику института в 2018 г. с диагнозами: множественная миелома (ММ) — 67 человек, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) — 55, не-ходжкинские лимфомы (НХЛ) — 44, острый лимфолейкоз (ОЛЛ) — 32, болезнь Ходжки-на — 26, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) — 19, хронический миелолейкоз (ХМЛ) — 7. ППК проводилась гелевым методом с использованием карт анти-IgG/C3d, DC-Screening I и DAT IgG1/ IgG3 (BioRad, Швейцария). В качестве контрольной группы обследованы 200 доноров крови и её компонентов.
Результаты. У всех доноров получен отрицательный результат ППК. У 15,2 % онкогематологических больных выявлены антиэритроци-тарные аутоантитела (p <0,05). Наиболее часто положительный результат ППК наблюдался у пациентов с ММ — 26,9 %. Среди больных НХЛ антиэритроцитарные аутоантитела выявля-
лись у 18,2 %, лимфомой Ходжкина — у 15,4 %, ОМЛ — у 10,9 %, ХЛЛ — у 10,5 %. У пациентов с ОЛЛ и ХМЛ результат ППК отрицательный. Интенсивность реакции (+) наблюдалась у 57,9 % больных с положительным результатом ППК, (++) — у 34,2 %, (+++) — у 5,3 %, (++++) — у 2,6 %. В подавляющем большинстве случаев (92,1 %) на поверхности эритроцитов сорбировались IgG2,4, ассоциирующиеся с низким риском иммунного гемолиза. Только у 3 пациентов (7,9 %) с силой реакций (+++) и (++++) ППК была положительной за счет ^М и компонентов комплемента. Аутоантитела в крови пациентов могут взаимодействовать не только с собственными эритроцитами, но и с тест-эритроцитами и эритроцитами доноров, выявляясь в непрямом антиглобулиновом тесте (НПАГТ) и экранируя трансфузионно опасные аллоантитела. Положительный результат НПАГТ зафиксирован у 13,2 % больных с положительной ППК, что приводило к затруднениям при подборе доноров из-за неспецифической агглютинации.
Выводы. Несмотря на то, что развитие онкогематологических заболеваний достаточно часто сопровождается продукцией антиэритроцитарных аутоантител, далеко не в каждом случае положительный результат ППК следует расценивать как признак аутоиммунного гемолиза. Для правильной оценки риска гемолиза врач должен ориентироваться, в том числе, на другие лабораторные и клинические показатели. Положительная ППК может коррелировать со сложностями подбора доноров. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №18-04-00162А
