CC BY
12
VВсероссийская научно-практическая конференция с международным участием «ГЕНЕТИКА ОПУХОЛЕЙ КРОВЕТВОРНОЙ СИСТЕМЫ -ОТ ДИАГНОСТИКИ К ТЕРАПИИ»
Probe (6q23.3). Уровни ДК, МДА и ЦП и активность ГП сыворотки крови оценивали спектро-фотометрически; уровень нитрита сыворотки определяли с помощью иммуноферментного анализа. Контрольная группа включала 30 практически здоровых доноров. Для выявления взаимосвязи между выраженностью ОС и частотой ЦА была проведена биномиальная логистическая регрессия.
Результаты. FISH-исследование позволило установить следующую частоту ЦА у пациентов с B-ХЛЛ: хромосомные аномалии были обнаружены у 42 пациентов (~65,6 %), у 22 пациентов ЦА не были выявлены. Наличие del 13q14.3 как единственной аномалии имело место у 19 пациентов (~29.7 %), del 11q22.3 — у 5 пациентов (~7,8 %), del 17р13.1 — у 4 пациентов (6,25 %), множественные ЦА установлены у 14 пациентов (~21,9 %). Аберраций хромосом 14 и 6 обнаружено не было. Уровни ДК, МДА, ЦП и нитрита в сыворотке крови были достоверно увеличены во всех группах пациентов по сравнению с контрольной группой. Одновре-
Санкт-Петербург 26-27 апреля 2019 г.
менно наблюдалось снижение активности ГП в сыворотке пациентов всех групп, что коррелировало со стадией заболевания. Однако из пяти предикторов статистически значимыми оказались только два — ДК и ЦП. Установлено, что вероятность наличия скрытой мутации увеличивается в 2,77 раза при увеличении уровня ДК на одну единицу (нмоль/мл) и в 1,01 раза при относительном уменьшении уровня ЦП на одну единицу (мг/л).
Выводы. Окислительный стресс играет важную роль в патогенезе В-ХЛЛ и характеризуется избыточным накоплением маркеров ОС (ДК, МДА и нитрита) и антиоксидантного маркера ЦП, а также снижением активности ГП. Увеличение содержания ДК и недостаточно высокий уровень ЦП были независимо связаны с повышенной вероятностью наличия скрытой мутации у пациентов с В-ХЛЛ. Профилактика последствий ОС может улучшить результаты лечения пациентов с В-ХЛЛ и оптимизировать прогноз заболевания.
Д. К. Жоголев, А. С. Поляков, С. Н. Колюбаева, Ю. В. Никитин, А. Д. Золотарёв, Я. А. Носков
Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова», Министерства обороны Российской Федерации, г. Санкт-Петербург
ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БЛАСТНЫХ КЛЕТОК ПРИ ОСТРОМ МИЕЛОИДНОМ ЛЕЙКОЗЕ В ОПЫТАХ IN VITRO
Введение. Исследования in vitro играют все более значительную роль в онкогемато-логии, позволяя в настоящее время изучать генетические характеристики и устойчивость опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам. В работе представлен опыт культивирования бластных клеток, полученных от больного с полирезистентным вторичным острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) и апробация двух адаптированных методик оценки воздействия на них различных противоопухолевых препаратов.
Цель. Освоение методики культивирования бластных клеток при ОМЛ, апробация и оценка возможностей применения клеточного сортин-га и микроядерного теста (МЯТ) для оценки генотоксичности различных химиопрепаратов in vitro.
Материалы и методы. Бластные клетки получены из периферической крови пациента с вторичным полирезистентным к тера-
пии ОМЛ. В дни забора образцов абсолютное содержание бластов в крови составляло от 28,0 х 10*9/л до 52,0 х 10*9/л. Всего проведено 3 эксперимента с исследованием генотоксичности нескольких водорастворимых противоопухолевых препаратов in vitro. В эксперименте № 1: при помощи клеточного сортера MoFlo Astrios EQ (Beckman Coulter) отсортировали по 520650 CD34+ клеток в 2 пробирки, которые культивировали (37 °C, 5 % CO2) в течение 4 суток в 5 мл полной питательной среды (ППС), содержащей: 80 % RPMI-1640, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 10 % оригинальной сыворотки больного, 10 мкл ФГА и 100 ЕД/мл пенициллина. В одну из проб после первых суток добавили децита-бин в концентрации 1160 нг на 1 мл среды. Для оценки его генотоксичности на том же сортере по окончании культивирования определили количество клеток, сохранивших жизнеспособность, путём оценки результатов маркировки
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XV, № 2, 2019
свободной ДНК. В экспериментах №2 и №3 0,5 мл цельной крови культивировали с 5 мл ППС. Через 24 часа в пробы эксперимента № 2 добавили децитабин в различных концентрациях (290 нг/мл, 580 нг/мл, 1160 нг/мл), в пробы эксперимента № 3 — даунорубицин (3400 нг/мл), а также его комбинацию с интерфероном альфа-2а в расчёте 3600 МЕ на 1 мл ППС. Далее пробы культивировали в течение 48 часов. Для оценки генотоксичности в этих экспериментах использовали МЯТ по следующей методике: в культуры добавлялось по 6 мкл/мл цитохалазина, через 24 часа клетки фиксировали, раскапывали по предметным стёклам и окрашивали по Романовскому-Гимзе. В каждом препарате подсчитывали по 100 бластных клеток с блоком цитокинеза. Оценка генотоксичности производилась по определению соотношения количества клеток с микроядрами к количеству «чистых» делящихся клеток, а также по общему количеству микроядер на 100 клеток.
Результаты. В результате эксперимента № 1 была апробирована методика культивирования отсортированных СЭ34+ бластных клеток ОМЛ из периферической крови. В связи с тем, что культивирование осуществлялось без специальных смесей цитокинов для роста СБ34+ клеток, а также возможным повреждением при сортировке, погибших клеток в обоих пробах оказалось значительно больше, чем ожидалось. Тем не менее, в пробе с добавлением децита-бина живых бластных клеток оказалось почти в 2 раза меньше, чем в контрольной пробе (9330 и 17633 клеток соответственно), что подтвердило потенциальную информативность методики.
В эксперименте № 2 при концентрациях де-цитабина 0 нг/мл (контроль), 290 нг/мл, 580 нг/мл, 1160 нг/мл процент клеток, содержащих микроядра, составил 7, 12, 23, 37 при общем количестве микроядер 7, 16, 42, 72 соответственно. В эксперименте №3 в контрольной пробе обнаружено 5 % клеток с микроядрами, в пробе с чистым даунорубицином — 30 %, в пробе с добавлением интерферона — 37 %. Общее количество микроядер составило 5, 38 и 73 соответственно.
Выводы. 1. Культуры бластных клеток при ОМЛ, полученные из проб периферической крови, могут быть применены в качестве модели для оценки генотоксичности химиопрепаратов. 2. Клеточный сортер позволяет отобрать необходимое количество клеток с нужным для исследования фенотипом, а после культивирования с высокой точностью оценить их жизнеспособность. Однако, помимо необходимости применения дорогостоящего оборудования, для длительного культивирования менее жизнеспособных после сортировки CD34+ клеток необходимо применение специальных многоци-токиновых сред и других расходных материалов, не производимых на территории Российской Федерации, что требует разработки и изучения альтернативных методик. 3. МЯТ может быть использован для оценки генотоксичности хи-миотерапевтических препаратов в отношении бластных клеток периферической крови. При этом для адаптации и освоения методики отсутствует необходимость закупки дополнительного дорогостоящего оборудования и материалов.
4. Из результатов эксперимента № 2 следует, что концентрация препарата напрямую коррелирует с уровнем генотоксичности, что подкрепляет выводы о достаточной специфичности результатов таких исследований. В эксперименте № 3 комбинация дауноруби-цина с интерфероном показала в 1,5 раза более выраженное генотоксическое воздействие на бластные клетки по сравнению с только даунорубицином, что может быть одним из подтверждений прямого противоопухолевого действия препаратов интерферона-альфа. 5. Апробированные методики изучения бластных клеток после дополнительного изучения и совершенствования могут быть использованы в качестве одного из перспективных направлений развития планирования и индивидуализации противоопухолевой терапии не только при ОМЛ, но, возможно, и при других злокачественных новообразованиях. Освоение не требующего существенных затрат метода МЯТ для исследования химиочувствительности опухолевых клеток in vitro может способствовать ускорению внедрения в рутинную практику методов индивидуализированной терапии.
