CC BY
12разработка биологических контрольных материалов для оценки качества лабораторной..
разработка биологических контрольных материалов для оценки качества лабораторной диагностики сифилиса в кыргызской республике
Северина О.П1., Ибраева И.Г1, Мырзаева С.А.1, Рожкова О.И.1, Юсупова Д.М2.,
Белоглазова Т.И.2, Кучук Т.Э.1 1 - Научно-производственное объединение «Профилактическая медицина»; 2 - клинико-серологическая лаборатория Республиканского кожно-венерологического диспансера (РКВД), Бишкек, Кыргызстан
Кыргыз республикасында сифилисти аныктоочу лабораториялардын сапатын баалоочу биологиялык козомолдоо нерселерди иштеп чыгуу.
Северина О. П.1, Ибраева И. Г.1, Мырзаева С. А.1, Рожкова О. И.1 , Юсупова Д.М2., Белоглазова Т.И.2, Кучук Т. Э.1 «Алдын алуучу медицина» илимий - ондуруштук бирикмеси 1, Республикалык тери-венерикалык диспан-
серинин кленикалык серологиялык лабораториясы 2
Корутунду: Сифилисти аныктоочу лабораторияларга системалык сапатын козомолдоону киргизуу учун, биологиялык козомолдоочу нерселерди иштеп чыгуу принцептери ажырагыс бологу экенин макалада корсо-тулот. ИФА методу менен сифилисти аныктоочу лабораторияларда, лабораториянын ичиндеги козомолдоочу улгу лабораториялык каталарды убагында таап чыгып жана жоюга жардам берди. Кыргыз Республикасын-дагы сифилисти аныктоочу лабораториялардын денгээлине баа беруу учун референс-панель сывораткасы позитивтик жана неготивтик ар кандай концентрациядан турган улгулорду сапатына сырттан баа беруу учун улуттук программада адистик тестке объективтуу баа берууго колдонулду, саламаттык сактоо менистерле-гинин денгээлинде негизги масилерелди таап чыгуу жана жоюга иш чараларды иштеп чыгуу.
негизги создор: Иммуноферменттик анализдер, сапатын текшируу, лабораториянын ичиндеги козомолдоочу улгу, сапатына сырттан баа беруу.
Development biological checking material for estimation quality laboratory diagnostics of the syphilis in
Kyrgyz Republic.
Severina O.P.1, Ibraeva I. G.1, Myrzaeva S.A.1, Rozhkova O.I.1, Usupova D. M.2, Beloglazova T. I.2, Kychyk T. E.1.
Scientific production association «Preventive medicine»1, clinic- serology laboratory Republican skin- venereal dispenser (RSVD) 2
Abstract : The principles development biological checking material as integral part of the introducing the system of the checking quality laboratory diagnostics of the syphilis are given in this article. Designed interlaboratory checking sample (ICS) promoted introduction an interlaboratory checking quality diagnosticses of the syphilis by IEA, helped in good time reveal and avoid the laboratory mistakes. Referens-panel of serum, including negative and positive sample in different concentration, was used in national program of the external estimation quality (EEQ) by method of the professional testing that has allowed to give the objective estimation a level diagnosticses of the syphilis in Kyrgyz State laboratory, reveal main its problems and develop the actions upon their removal at a rate of ministry of the public health Kyrgyz State.
Key words: the Enzyme immunoassay, quality assurance, ICS, EEQ
Сифилис относится к наиболее значимым по социальным и медицинским последствиям заболеванием и продолжает занимать лидирующие позиции среди болезней, передающихся половым путем как во всем мире [6], так и на территории Кыргызстана [1]. Существенно изменить сложившуюся ситуацию способна лабораторная диагностика, которая должна поставлять своевременную и достоверную лабораторную информацию службам здравоохранения для принятия адекватных лечебно-профилактических и противоэпидемических мероприятий [3,4,5]. Необходимым условием успешности этих мероприятий во многом определяется качеством
лабораторных анализов, основанных на разработке системы, позволяющей контролировать исследования, как в каждой лаборатории, так и на уровне государства. Эта система основана на международных стандартах (ISO, CLSI, ВОЗ) и охватывает все составляющие лабораторного процесса: лабораторный персонал, оборудование, реагенты, а также осуществление контроля соблюдения установленных требований на всех его этапах путем внедрения внутрила-бораторного контроля (ВКК) и внешней оценки качества (ВОК) [10,11,12,13, 14]. В соответствие с международными требованиями данные виды контролей ни в коей мере не заменяют, а наобо-
рот, дополняют друг друга. ВКК осуществляется силами самой лаборатории на постоянной основе для своевременного выявления и исправления лабораторных погрешностей, в то время как ВОК осуществляется компетентной сторонней организацией с определенной периодичностью для независимой и объективной оценки работы лабораторий, выявления основных проблем и разработки мер по их устранению в масштабах государства. Для организации такого контроля необходимо применение специфических инструментов - контрольных биологических материалов, которые должны создаваться и использоваться в соответствие с их назначением [8, 15,16,17].
Согласно вышесказанному целью нашего исследования явилась разработка биологических контрольных материалов для проведения внут-рилабораторного контроля и внешней оценки качества лабораторной диагностики сифилиса.
Материалы и методы:
Образцы сывороток крови человека: Для разработки контрольных биоматериалов было отобрано 75 образцов сывороток крови от больных с диагнозом «Сифилис» на разных стадиях заболевания. Все позитивные образцы были получены из клинико-серологической лаборатории
Республиканского Кожно-Венерологического Диспансера (РКВД). Негативные образцы в виде рекальцифицированной плазмы в количестве 10 штук (каждой по 200 мл.) были взяты от здоровых доноров из Республиканского центра крови. В работу были отобраны образцы, не содержащие маркеры гемотрансмиссивных инфекций: антитела к вирусу иммунодефицита человека (анти-ВИЧ) антитела к вирусу гепатита С (анти-ВГС) и поверхностный антиген к вирусу гепатита В (HBsAg), что позволяло обеспечить безопасность в отношении этих инфекций при последующей работе с биоматериалом.
Диагностические препараты:
• для проведения исследований реакции микропреципетации (РМП) с кардиолипиновым антигеном - «Люис-тест» ф. «Диагностические системы», Россия;
• для реакции быстрого определения реагинов плазмы (RPR-test) - «Syphilis RPR test» ф. «Human», Германия;
• для проведения реакции пассивной ге-магглютинации (РПГА) - «Syphilis TPHA liquid» ф. «Human», Германия;
• для реакции иммунофлюорисценции (РИФ-абс) - «ЛюмиБест антипаллидум» ф. «Вектор - Бест», Россия
• Для выявления специфических антител к Tr. pallidum, методом иммуноферментного анализа (ИФА): «ICE* Syphilis» ф. ABBOTT Murex Biotech Limited, Великобритания; «РекомбиБест анти-
паллидум-суммарные антитела-стрип» и «РекомбиБест антипаллидум IgM-стрип» ф. «Вектор - Бест», Россия; «Сиф-^-ДС-стрип» и «Сиф-ДСM-суммарный» ф. «Mедико-биологический Союз», Россия.
• Тест-системы для определения анти-ВИч, анти-ВГС и HBsAg методом ИФА: «Murex HIV-1.2.0»; «Murex anti-HCV (version 4.0)»; «Murex HBsAg Version 3» ф. ABBOTT Murex Biotech Limited, Великобритания.
Эталонные биоматериалы для калибровки национальных контрольных материалов:1-ый Mеждународный стандарт «WHO International Standard 1st IS for human syphilitic plasma IgG and IgM», NIBSC code 05/132.
Лабораторные: РMП, RPR-test, РПГА и РИФ использовались на базе серологической лаборатории РКВД г.Бишкек; RPR-test, РПГА и ИФА в республиканском центре контроля качества лабораторной диагностики инфекционных болезней (РЦККЛДИБ). Все лабораторные методы использовались для отбора позитивных и негативных образцов, а также и для разработки и аттестации референс-панели ВОК. Для разработки и аттестации внутрилабораторного контрольного образца (ВКО) использовался метод ИФА.
Для удаления фибриновых сгустков и устранения неспецифических реакций проводилась конверсия негативной плазмы в сыворотку методом рекальцификации [7].
Статистические: определение аттестационных характеристик ВКО включало расчеты показателей среднего арифметического значения (Хср.); расчет среднеквадратичного отклонения (S) и предупредительных и контрольных границ для построения контрольной карты.
где n - общее количество измерений;
X1 = первый результат измерения ВКО;
X2 = второй результат измерения ВКО;
Xn = последний результат измерения ВКО.
Высчитывалось среднеквадратическое отклонение (S) - значение разброса отдельных показателей ВКО:
Где I - сумма результатов измерений; ^ - X)2 - сумма квадратов разницы между отдельными показателями ВКО и его средней величиной;
п - 1 - количество измерений минус единица. Рассчитывали значения пределов:
разработка биологических контрольных материалов для оценки качества лабораторной..
+1Б = X + 1Б - 1Б = X - 1Б
+ 2Э = X + 2Э - 2Э = X - 2Э
+ 3Э = X + 3Э - 3Э = X - 3Э
результаты и обсуждения:
С целью проведения внутрилабораторного контроля качества и выявления лабораторных погрешностей при постановке методом ИФА был разработан ВКО, который готовился путем последовательного разведения высокоположительного образца сыворотки негативным образцом (рис. 1).
Основным критерием отбора нужного разведения ВКО служило условие, при котором
3,500
с 3,000 О
* 2,500 15
® 2,000 то
| 1,500 с 1,000 0,500 0,000
Аттестационные характеристики ВКО включали 20-кратную постановку стандарта в разные дни постановки теста с последующим расче-
оптическая плотность (ОП) образца должна превышать ОП критического уровня в 2 - 3 раза, так как именно этот промежуток наиболее объективно выявляет погрешности при постановке теста [9]. Предварительное титрование ВКО проводилась в имеющихся ИФА тест-системах от разных фирм-производителей, что позволило определить значение ВКО в каждой из них. Далее приготовленный ВКО разливался по дозам, достаточным для однократного использования и закладывался на хранение при температуре минус 200С с целью сохранения его стабильности на протяжении срока использования.
том среднего арифметического значения (Хср.), среднеквадратичного отклонения и значений контрольных пределов (табл. 1).
Таблица № 1
результаты аттестации вКо
Х ср. S -1S + 1S -2S +2S -3S +3S
1,542291 0,339666 1,202625 1,881957 0,862959 2,221624 0,523293 2,56129
рисунок № 1. схема последовательного разведения положительной сыворотки отрицательной.
Данные расчеты были использованы для построения контрольной карты Levi - Dgenings. Приготовленный ВКО в последующем использовался при каждой постановке анализов на сифилис методом ИФА, что позволило своевременно выявить лабораторные погрешности и провести мероприятия по их устранению. На рисунке 2 продемонстрировано нарушение правила Westgard 13S (21 аналитическая серия), свиде-
тельствующее о наличии случайной ошибки и не позволяющей учесть результаты данной аналитической серии.
Последующий анализ полученных результатов помог выявить возможную причину ошибки, повлекшую за собой брак всей серии. После устранения причины и перестановки теста значение ВКО находилось в допустимом пределе что позволило нам учесть результаты анализов.
3,05
2,55
£ 2,05
CL 2 С
О
С
О
1,05
0,55
0,05
I
У i t 1
* t А 1
J1 г! V ш
* * *
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171 161 191 20"
Дни постановок ИФА
рисунок №2. результаты внутрилабораторного контроля качества лабораторной диагностики сифилиса.
Для проведения национальной программы ВОК в лабораториях занимающихся диагностикой сифилиса была разработана референс-па-нель сывороток крови человека. Референс-па-нель разрабатывалась в соответствии с международными требованиями ISO и ВОЗ согласно которым она включала как негативные, так и позитивные образцы. В свою очередь позитивная часть референс-панели была представлена образцами, включающими различные классы антител к Treponema pallidum: IgM и IgG и содержала их в различной концентрации. Такой подход позволял нам всесторонне изучить качество тестирования на сифилис в лабораториях республики, дать оценку чувствительности и специфичности используемых методов диагностики, выявить лаборатории, имеющие проблемы при идентификации позитивных и негативных образцов и определить способность лабораторий выявлять ранние формы заболевания.
Позитивные образцы референс-панели были получены методом поэтапного разведения пула позитивных образцов негативной сывороткой до заданных концентраций. Панель состояла из 4 образцов 2 из которых содержали антитела к сифилису классов IgG и IgM: (высоко- и среднеактивный), 1 - только антитела класса IgG (низкоактивный) и 1 негативный образец. Низкоактивный позитивный образец содержал антитела к сифилису в концентрации 3 МЕ, что соответствовало концентрации 1 Международного эталона ВОЗ (NIBSC Код: 05/132), по которому он был откалиброван. Выбор этой
концентрации был не случаен, а обусловлен различной чувствительностью используемых методов диагностики сифилиса. Поэтому было важно иметь в панели образец с минимальной концентрацией антител, выявляемый всеми методами.
Последующая аттестация референс-панели позволила дать характеристику каждого образца при тестировании различными методами и подтвердила правильность выбранной тактики её создания (табл.2).
Созданная нами референс-панель была использована в национальной программе ВОК при оценке качества диагностики сифилиса 37 лабораторий Кыргызстана.
Полученные с её помощью результаты помогли оценить качество тестирования в лабораториях страны (табл. 3), выявить основные причины ошибок и разработать рекомендации по совершенствованию диагностики сифилиса на уровне министерства здравоохранения Кыргызской Республики.
Таким образом, предпосылкой для разработки биологических контрольных материалов был обусловлен высоким уровень заболеваемости сифилисом в республике, ростом случаев врожденного сифилиса, поздних и скрытых форм заболевания [1,2].
Такая ситуация указывает на несвоевременное выявление болезни на ранних стадиях, что связано с недостатками в организации лечебно-профилактических и диагностических мероприятий, в том числе и низким качеством диагностики сифилиса.
разработка биологических контрольных материалов для оценки качества лабораторной...
Таблица №2
Характеристика образцов панели на сифилис по результатам аттестации
№ образца Характеристика образцов панели Характеристика результатов образца при использовании следующих методов:
ифа IgG ифа суммарные ифа IgM рмп рпр рпга риФабс.
2 Низкотитражный (содержит антитела класса positive 1.6* positive 5.5 negative 0.45 positive positive positive positive
3 Высокотитражный (содержит антитела классов 1дМ + positive 9.0 positive 10.5 positive 2.3 positive 1:4 positive 1:8 positive 1:160 positive
4 Среднетитражный (содержит антитела классов 1дМ + positive 5.1 positive 8.5 positive 1.2 positive 1:2 positive 1:4 positive 1:80 positive
5 Негативный negative 0.09 negative 0.28 negative 0.25 negative negative negative negative
1-й Международный эталон positive positive positive positive positive positive positive ВОЗ 2.0 5.7 2.0
*При аттестации методом ИФА даны значения коэффициента позитивности (КП = ОП образца /ОП крит. уровня). Чем выше КП, тем больше концентрация антител.
Таблица №3
результаты профессионального тестирования образцов референс-панели в программе воК-2008 на сифилис
№ и характеристика образцов референс-панели процент правильных результатов при использовании разных методов диагностики
ифа рмп рпр рпга рск ЭКспр. тест итого
IgG IgM
№2 (Низкотитражный IgG) 100% 100% 12,5% 33,3% 11,1% 0% 100% 51%
№3 (Высокотитражный IgM + IgG) 100% 66,7% 87,5% 100% 100% 85,7% 100% 91,4%
№4 (Среднетитражный IgM + IgG) 100% 66,7% 83,3% 83,3% 44,4% 66,7% 100% 77,8%
№5 (Негативный) 100% 100% 66,7% 91,7% 100% 85,7% 100% 92%
Заключение:
Данное обстоятельство продиктовало необходимость разработки и внедрения системы контроля качества лабораторной диагностики сифилиса в Кыргызстане, неотъемлемой частью которой является использование биологических контрольных материалов. Созданный нами ВКО способствовал внедрению внутрилабораторного контро-
ля качества диагностики сифилиса методом ИФА, помог своевременно выявлять и устранять лабораторные ошибки. Референс-панель применялась при проведении национальной программы ВОК методом профессионального тестирования, что позволило дать объективную оценку уровню диагностики сифилиса в лабораториях Кыргызской Республики.
Список используемой литературы:
1. Эпидемиологическая ситуация по сифилису и гонорее в Кыргызской Республике (1990 - 2005г.), клинические особенности течения сифилиса и меры, направленные по снижению их заболеваемости среди населения /М.К. Балтабаев, А.Т. Шакирова //Рос. журн. Medic - 21 vek. 01.04.2006.
2. Эпидемиологическая ситуация по БППП в г. Бишкек/В.С. Тойгонбаева, А.Б. Рыскулбекова, С.К. Карагулова, А.В. Аникин // Кырг. Журн. Медицина Кыргызстана - 2007 г. С - 236 - 238 .
3. Положительные серологические реакции на сифилис как проблема в клинической медицине / К. М. Ломоносов, В. С. Новоселов //Рос. журн. кож. и вен. бол - 2005. - №4 - с. 5-7.
4. Создание региональной программы внешней оценки качества диагностики сифилиса в Приволжском федеральном округе /Н. И.Иванова, О. Ю. Пекшева, Н. В. Чепурченко, А. П. Обрядина, Н. В. Залеских // Клин. лаб. диагностика - 2007 г., №7, с. 40 - 48.
5. лабораторная диагностика сифилиса / С.В. Петришина // Рос. журн. кож. и вен. бол - 2004. - №2 - с. 46 - 49.
6. Глобальная ликвидация врожденного сифилиса: обоснование и стратегия действий. Доклад ВОЗ, -2008г., с.1,
7. Обеспечение и внутрилабораторный контроль качества в иммуноферментном анализе, методическое руководство. Бишкек-2005, стр-44.
8. Принципы приготовления и учреждения эталонных ма-
териалов биологических препаратов. Сер. техн. докладов ВОЗ, -1998.
9. Заключительный отчет о научно-исследовательской работе по теме: «Разработка системы мер по управлению качеством лабораторных исследований парентеральных вирусных гепатитов в Кыргызстане», Научно-производственное объединение «Профилактическая медицина» Бишкек - 2006, № 0003096, с-7,.
10. ИСО.МЭК 17025. Общие требования к компетентности тестирующих и калибрующих лабораторий.
11. ISO 15189. Медицинские лаборатории - Специальные требования к качеству и компетентности.
12. NCCLS GP26-A3. Применение модели системы управления качеством для лабораторной службы. Утвержденное руководство. Издание третье., 2004, США. [ISBN 156238-553-4]
13. ИСО.МЭК 43. Проверка лабораторий на качество проведения испытаний посредствам межлабораторных сличений.
14. WHO/DILJLAB/99.2. Требования и руководство для схем внешней оценки качества для лабораторий здравоохранения
15. ISO-GUIDE 34. Quality system guidelines for the production of reference materials 34 - 1996.
16. ISO-GUIDE 35. Reference materials - General and statistical principles for certification. 35 - 2006
17. ISO 13528. Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons.
