CC BY
18
МИКРОБИОЛОГИЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
© коллектив авторов, 2019
Рунина А. в.1, Шпилевая М. в.1, Филиппова М. А.2, Катунин Г. Л.1 Кубанов А. А.1
ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОЧИПА С ПАНЕЛЬЮ ИЗ 12 ДИАГНОСТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ T. PALLIDUM ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ДИНАМИКИ ПРОФИЛЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССОВ IGG И IGM В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ СИФИЛИСОМ ДО И ПОСЛЕ ТЕРАПИИ
1ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава РФ, 107076, Москва, Россия;
2ФГБУ Институт молекулярной биологии им. в. А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, Россия
Цель исследования - применение иммуночипа с панелью из 12 диагностических антигенов T. pallidum для изучения динамики профиля иммуноглобулинов классов IgG и IgM у больных различными формами сифилиса в процессе клинико-серологического контроля и оценка прогностической значимости полученных результатов. Динамику показателей иммуноглобулинов двух классов IgG и IgM по результатам реакции непрямой флуоресценции (нРИФ) на иммуночипе сравнивали с показателями нетрепонемного - RPR и трепонемных - ИФА, РПГА серологических тестов. В сыворотке крови пациентов с первичным, вторичным, ранним скрытым и поздним скрытым сифилисом с диагностически значимым уровнем IgM-антител после успешного лечения в нРИФ на иммуночипе отмечается негативация результатов данного теста. Сохранение противотрепонемных IgM может свидетельствовать об активности инфекционного процесса и служить показанием к проведению дополнительного специфического лечения. Выраженная в большинстве случаев в нРИФ тенденция к снижению диагностически значимого титра антител класса IgG после адекватной и полноценной антибиотикотерапии может свидетельствовать об успешном лечении. Полученные с использованием иммуночипа результаты не противоречат данным стандартных серологических тестов. Технология с применением иммуночипа даёт перспективу расширения диагностических возможностей трепонемных тестов при контроле качества проводимого лечения и детекции антител класса IgM в качестве критерия эффективности терапии сифилиса.
Ключевые слова: иммуночип; иммунофлуоресценция; серологические тесты; иммуноглобулины; T. pallidum. Для цитирования: Рунина А. В., Шпилевая М. В., ФилипповаМ. А., Катунин Г. Л., Кубанов А. А. Применение иммуночипа с панелью из 12 диагностических антигенов Т. pallidum для изучения динамики профиля иммуноглобулинов классов IgG и IgM у больных различными формами сифилиса. Клиническая лабораторная диагностика. 2019;64 (9): 546-552.
D0I:http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-9-546-552
RuninaA. V.1, ShpilevayaM. V.1, FilippovaM. A.2, Katunin G. L.1, KubanovA. A.1
DIAGNOSTIC IMMINOARRAY ASSAY FOR CHARACTERIZATION OF IMMUNOGLOBULIN IGG AND IGM LEVEL IN SYPHILIS PATIENTS SERUM TOWARDS 12 RECOMBINANT ANTIGENS OF T. PALLIDUM BEFORE AND AFTER THE THERAPY
1State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology 107076, Moscow, Russia;
2The V.A. Engelhardt Institute of Molecular Biology, 119991, Moscow, Russia
For correspondence: Shpilevaya M.V., Ph.D., .senior researcher; e-mail: [email protected]
The aim of the study was to characterize the dynamics of immunoglobulin IgG and IgM level in syphilis patients serum at different stages of the disease before and after the therapy towards 12 diagnostic antigens of T. pallidum in an microarray assay and to evaluate these data as possible prognostic markers. The dynamics of immunoglobulin IgG and IgM level was measured in the reaction of indirect immunofluorescence using microarray and compared to the results of non-treponemal RPR test and treponemal tests as EIA and reaction of passive hemagglutination. In microarray assay diagnostically high level of IgM in patients with primary, secondary and early latent and late latent syphilis decreased dramatically to zero after the successful therapy. Continuously high level of IgM after the therapy proposes the persistence of infection agents in the organism and points out the need of additional antimicrobial treatment. In most of the cases anti-treponemal IgG level also declined after the successful therapy and this confirms the appropriate treatment. The results of microarray assay coincide with the results of other mentioned laboratory tests for syphilis diagnostics. Microarray assay with the recombinant T. pallidum antigens gives the perspective for creating methods with wider spectrum of diagnostic and therapy control options using the IgM immunoglobulin level as a marker for successful syphilis treatment.
Keywords: microarray; immunofluorescence; serological test; immunoglobulins; T. pallidum.
For citation: Runina A.V., Shpilevaya M.V., Filippova M.A., Katunin G.L., Kubanov A.A. Diagnostic imminoarray assay for characterization of immunoglobulin igg and igm level in syphilis patients serum towards 12 recombinant antigens of t. pallidum before and after the therapy. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2019; 64(9): 546-552. (inRuss.) DOI: http://dx.doi.org/10.18821m69-2084-2019-64-9-546-552
Для корреспонденции: Шпилевая Марина Валентиновна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории инфекций, передаваемых половым путём, и дерматозов; е-mail: [email protected]
MICROBIOLOGY
Information about authors:
Runina A.V., http://orcid.org/0000-0003-3177-2823
Shpilevaya M.V., https://orcid.org/0000-0002-9957-4009
Filippova M.A., https://orcid.org/0000-0002-9454-5938
Katunin G.L., https://orcid.org/0000-0003-0599-6305
Kubanov A.A., https://orcid.org/0000-0002-7625-0503
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
Acknowledgment. The work was supported by Grant of Russian Science Foundation (№ 17-75-20039).
Received 25.06.2019 Accepted 25.07.2019
Введение. Сифилис - венерическое инфекционное заболевание, возбудителем которого является бледная трепонема (Treponema pallidum, ssp. pallidum), имеет характерную периодизацию в течении. Наряду с другими инфекциями, передаваемыми половым путём, сифилис относится к группе социально значимых и представляющих опасность для здоровья окружающих заболевани-ий1. Согласно Приказу Минздрава Российской Федерации № 87 от 26.03.200l г.2, для серологической диагностики сифилиса в России применяются два вида тестов: нетрепонемные - реакция микропреципитации (РМП) или её аналоги, такие как RPR-тест быстрых плазменных реагинов, и трепонемные - иммуноферментный анализ (ИФА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в модификациях РИФабс и РИФ реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ). Выбор сочетания серологических тестов в каждом случае определяется целью проводимого исследования. Регламентированными серологическими реакциями для контроля эффективности лечения больных сифилисом являются нетрепонемные тесты (РМП, RPR)3. Негативация нетрепонемных тестов или четырёхкратное снижение титров антител, определяемых в данных серологических реакциях в течение года после окончания специфической терапии по поводу ранних форм сифилиса, подтверждает её эффективность, стойкое сохранение положительных результатов без тенденции к снижению титров антител служит основанием для диагностики серологической резистентности. Негатива-ция трепонемных тестов (ИФА, РПГА, РИФ) наблюдается исключительно редко.
В последние годы сформулирована и обоснована концепция определения активности инфекционного процесса по наличию специфических противотрепо-немных антител, в частности IgM [1]. Снижение уровня, затем исчезновение противотрепонемных IgM-антител после лечения является показателем его эффективности. В большинстве случаев после лечения раннего приобретённого сифилиса специфические IgM-антитела исчезают в течение 3-12 мес, после лечения позднего сифилиса - в течение 12-24 мес [2-7]. Ряд исследователей акцентировали внимание на значимости выявления в
'Приказ Минздрава РФ от 26.03.2001 № 87 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса».
2Приказ Минздрава РФ от 26.03.2001 № 87 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса».
3Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология; 2015. Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путём. 5-е изд., перераб. и доп. М.: Деловой экспресс; 2016: 679-720.
крови IgM как маркёров присутствия в организме активного возбудителя заболевания в случаях реинфекции или неудач в проведении антибактериальной терапии [2, 9-11]. Противотрепонемные IgG антитела, в отличие от IgM, сохраняются в сыворотке больных многие годы, несмотря на снижение титров после адекватного лечения, при этом скорость снижения пропорциональна длительности клинических симптомов: чем короче продолжительность заболевания, тем более транзитор-ны IgG [1]. Определение уровня противотрепонемных IgG для контроля за терапией показывает, как правило, противоречивые результаты [12] и их обнаружение в сыворотке больных спустя многие годы не является свидетельством неэффективности лечения [3,13,14].
Технология иммуночипа даёт возможность единовременно диагностировать трепонема-специфические антитела разных классов (IgG, IgM) к панели рекомби-нантных антигенов T. pallidum в реакции непрямой им-мунофлуоресценции (нРИФ) [15]. Иммуночип с панелью из 12 антигенов T. pallidum, применён для исследования парных образцов сыворотки от больных сифилисом до и после проведённого лечения.
Цель исследования - использование иммуночипа для изучения динамики профиля иммуноглобулинов у больных сифилисом в процессе клинико-серологического контроля и оценка прогностической значимости полученных результатов.
Материал и методы. Уровень антител классов IgG и IgM исследовали в сыворотке крови больных сифилисом до начала терапии и в период клинико-серологического контроля после её окончания. В исследование включены образцы сыворотки крови больных первичным (n=2), вторичным (n=5), ранним скрытым (n=14), поздним скрытым (n=9) сифилисом. Специфическое лечение больных сифилисом проводилось в клинико-диагностическом отделении ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава РФ в соответствии с Федеральными клиническими рекомендация по ведению больных сифилисом. Эффективность лечения оценивалась лечащим врачом на основании полноценности проведённого специфического лечения сифилиса, отсутствия клинических симптомов заболевания и результатов нетрепонемного (RPR) и трепонемных (ИФА, РПГА) серологических тестов. Сыворотки данных больных исследованы методом нРИФ на иммуночипе с 12 диагностическими антигенами T. pallidum, полученные результаты сравнивались с данными стандартных серологических тестов.
нРИФ проводилась на разработанной панели диагностических антигенов T. pallidum, которая включала: 1) коммерческие антигены Тр15, Тр17, Тр47, TmpA (ИМ-
МИКРОБИОЛОГИЯ
Рис. 1. Схема иммуночипа с панелью из 12 антигенов T. pallidum. Сверху - схема расположения антигенов T. pallidum и контрольных образцов; снизу - общий вид иммуночипа.
ТЕК, Россия), применяемые в стандартных тестах; 2) клонированные de novo рекомбинантные белки Тр0453, Тр0319, Тр1038, Тр0965, Тр0277, Тр0684; 3) коммерческие рекомбинантные белки Тр0163, Тр0971 (Cusabio, Китай). Дополнительные антигены отобраны на основе биоинформатического анализа протеома T. pallidum [16]. Созданный с их использованием иммуночип состоит из стеклянной подложки и нанесённых на неё полусферических гидрогелевых элементов с рекомбинантными антигенами (по 4 повтора каждый). Область печати для анализа накрывали пластиковой реакционной камерой. Печать иммуночипа проводили с использованием технологии сополимеризационной иммобилизации на базе Института молекулярной биологии им. В. А. Энгель-гардта РАН. Схема печати иммуночипа и его общий вид приведены на рис. 1.
При проведении исследований на иммуночипе образцы сыворотки крови разводили 1:10 в 1-кратном фосфатно-солевом буфере (1х PBS) с 0,05% Tween-20 и вносили в реакционную камеру. После инкубации в течение 12 ч при 37° С с иммуночипов удаляли реакционную камеру, ополаскивали деионизированной водой, промывали 1х PBS с 0,05% Tween 20 в течение 30 мин на ротационном шейкере при 200 об/мин, вновь ополаскивали деионизированной водой и высушивали в потоке воздуха. Для выявления IgG и IgM, специфически взаимодействующих с антигенами T. pallidum, на иммуночип наносили раствор конъюгата антител козы к IgG человека с флуоресцентным красителем Cy5 (KPL, США) в разведении 1:2000 в 1х PBS, конъюгата к IgM человека с флуоресцентным красителем Cy3 (KPL, США) в таком
же разведении. После повторной инкубации в течение 1 ч при 37° С иммуночипы промывали деионизированной водой и высушивали в потоке воздуха. Визуализацию результатов исследования проводили на аппаратно-программном комплексе для анализа биочипов (ООО «Био-чип ИМБ», Россия), регистрирующего интенсивность флуоресцентного сигнала флуорохромов Cy5 и Cy3. Интенсивность флуоресценции рассчитывали как средний сигнал от 4 повторных ячеек с одним антигеном. Пороговый уровень флуоресценции (ФЛ ) для каждого анти-
гт V ,,.ЧоРог/
гена T. pallidum определяли среднее значение образцов сыворотки крови здоровых доноров с поправкой +3о (квадратическое отклонение для данной выборки). Положительными считались значения, превышающие ФЛ более чем на 10%; отрица-
порог ' *
тельными - составляющие менее 90% от ФЛ , значения ±10% от
порог
ФЛ расценивались как сомни-
порог *
тельные («серая зона» диагностического исследования).
Статистическую обработку результатов выполняли с помощью программного пакета Statistica 13.0. Для попарного сравнения эффективности теста нРИФ со стандартными тестами применяли критерий Мак-Немара (McNemar). Различия считали достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение. По результатам серологических тестов в течение года лечение одного из пациентов с первичным сифилисом, всех пациентов с вторичным сифилисом, 8 из 9 пациентов с ранним скрытым сифилисом оценено как эффективное, и сопровождалось негативацией или снижением титра нетрепонемно-го теста (RPR), преимущественным снижением уровня специфических антител в реакциях ИФА и разнонаправленными изменениями в тесте РПГА. Негативация результата нетрепонемного теста отмечена у одного из 9 пациентов с поздним скрытым сифилисом (№ 30). 5 случаев раннего скрытого сифилиса (образцы № 17-21) характеризовались сохранением позитивности и уровня титра антител как в нетрепонемном, так и в трепонем-ных тестах, что явилось основанием установления серологической резистентности.
Образцы сыворотки этих же пациентов, взятые до лечения и через 12 мес исследованы на содержание антител классов IgG и IgM к 12 антигенам T. pallidum Обобщённые результаты стандартных тестов, нРИФ на иммуночипе парных образцов сыворотки пациентов с различными формами сифилиса, полученные до лечения и в процессе клинико-серологического контроля, приведены в табл. 1.
Флуоресцентные изображения и соответствующие им значения флуоресценции при детекции эмиссии флуоро-форов Су5 (определение IgG) и Су3 (определение IgM) сыворотки крови пациента с вторичным сифилисом представлены на рис. 2. В приведённом примере (пациент №
MICROBIOLOGY
Таблица 1
Результаты регламентированных лабораторных тестов сыворотки крови больных сифилисом, использованных для исследования уровня антител IgG и IgM к 12 рекомбинантным антигенам T. pallidum на иммуночипе.
Период, IgG IgM
Код образца ИФА РПГА RPR Положительных Динамика Положительных Динамика
месяцы реакций из 12 изменений реакций из 12 изменений
Первичный сифилис
1 0 2,83 1 + 1:80 отр 1 4
12 1,81 2+ 1:80 отр 3 +2 1 -3
2 0 4,64 2+ 1:160 2+ 1:2 5 2
12 1,4 2+ 1:160 отр 5 0 0 -2
Вторичный сифилис
3 0 12,72 4+ 1:640 4+ 1:8 8 2
12 7,63 4+ 1:640 отр 7 -1 0 -2
4 0 12,56 4+ 1:1280 4+ 1:16 7 2
12 4,49 4+ 1:640 отр 2 -5 0 -2
5 0 11,61 4+ 1:2560 4+ 1:16 8 0
12 14,83 - отр 7 -1 0 0
6 0 17,71 4+ 1:2560 4+ 1:64 8 0
12 10,64 4+ 1:2560 отр 6 -2 0 0
7 0 15,91 4+ 1:1280 4+ 1:16 5 0
12 5,43 3+ 1:320 отр 3 -2 0 0
Ранний скрытый сифилис
8 0 10,22 4+ 1:1280 4+ 1:16 2 1
12 4,46 - отр 2 0 0 -1
9 0 4,58 3+ 1:320 2+ 1:2 6 1
12 1,32 2+ 1:160 отр 5 -1 0 -1
10 0 15,14 - 4+ 1:16 5 3
12 1,82 2+ 1:160 отр 8 +3 0 -3
11 0 5,22 4+ 1:2560 4+ 1:16 9 0
12 6,28 - отр 7 -2 0 0
12 0 6,81 2+ 1:80 2+ 1:2 5 1
12 3,03 3+ 1:320 отр 5 0 1 0
13 0 17,82 4+ 1:2560 4+ 1:16 7 0
12 10,35 4+ 1:1280 отр 5 -2 0 0
14 0 7,77 4+ 1:1280 2+ 1:2 2 6
12 9,35 4+ 1:640 2+ 1:2 0 -2 0 -6
15 0 15,08 4+ 1:2560 4+ 1:16 8 0
12 10,25 3+ 1:4 8 0 0 0
16 0 12,93 4+ 1:2560 4+ 1:64 8 0
12 10,28 4+ 1:2560 3+ 1:4 8 0 0 0
Образцы с серорезистентностью
17 0 13,65 4+ 1:8 9 11
12 13,06 4+ 1:640 4+ 1:8 9 0 11 0
18 0 11,72 4+ 1:2560 4+ 1:32 9 4
12 15,16 4+ 1:2560 4+ 1:32 9 0 4 0
19 0 18,55 4+ 1:640 2+ 1:2 6 0
12 12,77 4+ 1:1280 2+ 1:2 6 0 0 0
20 0 16,08 4+ 1:2560 4+ 1:8 8 0
12 16,93 4+ 1:2560 3+ 1:4 7 -1 0 0
21 0 14,50 4+ 1:1280 2+ 1:2 7 0
12 14,58 4+ 1:640 3+ 1:4 7 0 0 0
Поздний скрытый сифилис
22 0 6,19 2+ 1:160 отр 1 0
12 8,69 2+ 1:160 отр 0 -1 0 0
23 0 7,02 2+ 1:160 отр 0 9
12 7,91 2+ 1:160 отр 1 +1 0 -9
24 0 10,53 2+ 1:160 отр 1 6
12 10,45 3+ 1:320 отр 0 -1 0 -6
25 0 13,55 4+ 1:1280 отр 0 6
12 8,97 4+ 1:1280 отр 1 +1 0 -6
26 0 7,68 2+ 1:160 отр 0 1
12 5,63 3+ 1:320 отр 3 +3 3 +2
27 0 8,84 3+ 1:320 отр 2 0
12 4,12 4+ 1:640 отр 0 -2 0 0
28 0 12,00 3+ 1:320 отр 1 1
12 13,33 4+ 1:640 отр 2 +1 0 -1
29 0 1,79 2+ 1:80 отр 3 0
12 3,33 3+ 1:320 отр 0 -3 4 +4
30 0 12,15 3+ 1:320 2+ 1:2 0 0
12 7,67 3+ 1:320 отр 4 +4 0 0
МИКРОБИОЛОГИЯ
До лечения
Значения
ФЛ (о.е.ф)
После лечения
Значения ФЛ (о.е.ф)
IgG • о • ф • о • ф • Тр15 ТрП 1562 3127 • • • • • • • ф • • Тр15 Тр17 1668 3955
Тр47 1396 • • • • Тр47 1835
ф о ф ф TmpA 2181 • TmpA 1077
• о • ф • Тр0453 2755 • • • • • Тр0453 3181
о о о о Тр0319 1774 • • о о • • Тр0319 1504
# Tpl03S 0 Тр1038 37
• в • Тр0965 1077 • О • • Тр0965 1242
• в • Тр0277 Tp06S4 225 16S Ф • ф • Тр0277 Tp06S4 133 441
о • о о Тр0163 1330 в • • • Тр0163 1995
• • • • Тр0971 1794 ф Тр0971 5S9
IgM
Тр15
Тр17
Тр47
ТтрА
Тр0453
Тр0319
Tpl03S
Тр0965
Гр0277
Tp06S4
Тр0163
Тр0971
О 32 3 72 О 26 О О О О О 114
Рис. 2. Результат исследования на иммуночипе с 12 антигенами T. pallidum сыворотки крови пациента с диагнозом вторичный сифилис до и через 12 мес после проведённого лечения. Жирным шрифтом выделены значения флуоресцентного сигнала, оцененные как «положительные».
3) при первичном обследовании и через 12 мес после проведённого лечения детектированы антитела классов IgG, IgM, взаимодействующие с рядом рекомбинантных антигенов T. pallidum. При исследовании иммуноглобулинов класса IgG в сыворотке крови данного пациента до начала лечения обнаружено специфическое взаимодействие с иммунодоминантными антигенами Тр15, Тр17, Тр47, TmpA, антигенами Тр0453, Тр0319, Тр0163, Тр0971. После эффективного лечения флуоресцентный сигнал в отношении антигена Тр0971 снижался от 1794 о.е.ф. до 589 о.е.ф., что в последнем случае оценивало результат реакции как «отрицательный». Количество определения диагностически значимого уровня иммуноглобулинов классов IgG к рекомбинантным антигенам T. pallidum в сыворотке крови данного пациента после терапии снизилось с 8 до 7. Исследование антител класса IgM до начала лечения обнаруживало положительные результаты реакции с антигенами TmpA, Тр0971. Через 12 мес (после проведённого лечения) диагностически значимого уровня антител класса IgM в сыворотке крови не обнаружено.
В группе первичного сифилиса у одного пациента после лечения выявлено повышение уровня IgG против антигенов Тр17, Тр0965. У всех пациентов детектировано понижение уровня IgM против Тр15, Тр17, TmpA, Тр0453, у одного - незначительное повышение уровня IgM к Тр0453 и Тр0277.
В группе вторичного сифилиса 4 пациента после лечения показали снижение уровня антител IgG к TmpA, 3 - против антигена Тр0277, 2 - против антигенов Тр47, Тр0319, Тр0971. Уровень IgG против антигенов Тр15, Тр17, Тр0453, Тр0163 при этом оставался конститутивно положительным. IgM антитела к большинству представленных антигенов T. pallidum у пациентов этой группы отсутствовали. Исключение
- положительный уровень IgM у двух пациентов против Тр0971, у одного против Тр17, и у одного против TmpA, которые после лечения негативировались.
Группа пациентов с ранним скрытым сифилисом отличалась стабильно высоким уровнем IgG к антигенам Тр15, Тр17, Тр0453, и более чем половина группы,
- к антигенам Тр0163, Тр47. Снижение количества прореагировавших антител данного класса отмечено для антигенов TmpA, Тр0971. Понижение титра антител класса IgM наблюдалось преимущественно в отношении антигенов Тр17, Тр0277, Тр0971, в единичных случаях - в отношении Тр47, Тр0453, Тр1038, Тр0684, Тр0163. У 5 пациентов с установленной серорезистентностью конститутивно высоким оставалось количество положительных реакций IgG против антигенов Тр15, Тр17, Тр47, TmpA, Тр0453, Тр0163, у 4 из них положительными были реакции против антигенов Тр0319, Тр0277. После проведения терапии только в одном случае наблюдалась негати-вация IgG к антигену Тр0277. Титр антител класса IgM, положительный для 2-х пациентов и отрицательный для остальных, после терапии не изменился.
Для группы позднего скрытого сифилиса характерен общий низкий титр иммуноглобулинов класса IgG с единичными положительными реакциями отдельных антигенов. Исключением можно считать антиген Тр17, антитела против которого определены у всех пациентов (до и/или после лечения). Титр иммуноглобулинов класса IgM был низким практически во всех образцах сыворотки пациентов в данной группе.
Согласно полученным результатам, после окончания специфического лечения количество диагностически значимых противотрепонемных IgG в образцах сыворотки больных изменяется разнонаправлено - преимущественно уменьшается у больных ранними формами сифилиса и увеличивается у больных с поздней формой. Изменение количества антител класса IgM носит более определённый характер. В парных сыворотках у 2 пациентов с первичным сифилисом, 2 пациентов с вторич-
Таблица 2
Таблица сопряжённости для определения связи между тестами RPR и нРИФ(IgM)
RPR нРИФ(^М) Сумма по строке
нет да
нет 2 (A) 1 (B) 3
да 1 (C) 7 (D) 8
Всего 3 8 11
Таблица 3
Уровни статистической значимости попарных различий эффективности тестов нРИФ(IgG) и нРИФ(IgM) с регламентированными трепонемными и нетрепонемным тестом у больных с разными формами сифилиса в процессе клинико-серологического контроля
Группы сравнения Количество больных в выборке Уровень статистической значимости (p)
ИФА - нРИФ(^) 30 0,2673
РПГА - нРИФ(^) 24 0,1306
RPR - нРИФ(^) 22 0,1139
ИФА - нРИФ(^М) 17 0,3711
РПГА - нРИФ(^М) 14 0,0412
RPR - нРИФ(^М) 11 1,0000
ным сифилисом (№ 3, 4) и 4 пациентов с ранним скрытым сифилисом (№ 8, 9, 10, 14) в нРИФ на иммуночипе отмечена негативация титров антител данного класса. У двух пациентов с ранней скрытой формой сифилиса (№ 17, 18) через 12 мес после окончания специфической терапии в нРИФ на иммуночипе отмечено стойкое сохранение положительных реакций IgM при отсутствии динамики со стороны других серологических тестов.
У всех пациентов с поздней скрытой формой сифилиса через 12 мес после лечения клинические проявления заболевания отсутствуют. Методом нРИФ у 5 из них (№ 23-26, 28) до начала лечения определены антитела класса IgM. Через 12 мес после терапии у 4 из них отмечена негативация титров антител данного класса, у одного - количество положительных реакций IgM антител возросло (№ 26). У пациента № 29 появление IgM антител констатировано после лечения и сопровождалось двукратным ростом серореактивности в ИФА и четырёхкратным в РПГА.
Проведено статистическое сравнение эффективности метода нРИФ и стандартных тестов при исследовании динамики серологических показателей в процессе лечения. Изменение (уменьшение или увеличение) количества прореагировавших в тесте нРИФ(IgG) или нРИФ(^М) антител попарно сопоставляли с соответствующими изменениями титров антител в ИФА, РПГА, RPR. Исследование проводилось на группе больных из 30 человек. Для сравнения качественных признаков зависимых групп использовали критерий Мак-Немара. Данные для статистического анализа выражены в номинативной шкале: метод зафиксировал снижение титра антител после лечения (=да); метод не зафиксировал снижение уровня антител (=нет). Для проверки гипотезы о наличии связи между двумя видами серологических тестов использованы таблицы сопряжённости (табл. 2).
В качестве индикатора эффективности лечения выбрано количество снижения уровня антител, зафик-
MICROBIOLOGY
сированное одним методом, но не зафиксированное другим, т. е. сравнивали ситуации «да-нет» и «нет-да». Нулевая гипотеза формулировалась следующим образом: показатели эффективности методов равны, т. е. H0: P(A)=P(D). Различия считали статистически значимыми при p>0,05.
Рассчитанное по таблице сопряжённости методом Мак-Немара значение вероятности ^=1,0000 (>0,05), поэтому нулевая гипотеза не отвергается. На уровне значимости 0,05 можно считать, что эффективности характеризовать динамику терапии для методов RPR и нРИФ(Т^М) очень близки. Вычисленные описанным выше способом значения вероятности (р) при попарном сравнении эффективности тестов нРИФ(IgG) и нРИФ(^М) со стандартными трепонемными и нетрепонемным серологическими тестами у больных с различными формами сифилиса в процессе клинико-серологического контроля представлены в табл. 3.
Попарное сравнение эффективности методов нРИФ(IgG) с методами ИФА и РПГА с использованием критерия Мак-Немара не выявило между ними статистически значимых различий. Оценка методом нРИФ(IgG) парных сывороток, полученных от больных сифилисом до и после проведённого лечения, показала сходное со стандартными трепонемными тестами изменение регистрируемого профиля трепонема-специфических антител класса IgG.
При сравнении эффективности нРИФ(^М) и RPR определён максимальный уровень значимости (р=1,000). Большая степень сходства двух тестов представляет особый интерес, поскольку определяемое в реакции RPR четырёхкратное снижение титров антител является подтверждением эффективности терапии. Высокий уровень антител к кардиолипину у больных сифилисом (особенно поздними формами) до лечения встречаются нечасто [17], что вызывает трудности в трактовке результатов при динамическом обследовании. В таких случаях снижение количества реагирующих IgM антител в тесте нРИФ может служить дополнительным, а иногда и единственным показателем результативности лечения. Уменьшение титра IgM антител в тесте нРИФ при отсутствии или низкой активности теста RPR до лечения отмечено у больных первичным сифилисом, у трёх больных поздним скрытым сифилисом (№ 23, 24, 28), у которых RPR тест не применялся. Лечение всех пациентов признано эффективным, и результат нРИФ(^М) является дополнительным серологическим подтверждением данного факта. У пациента с поздней скрытой формой сифилиса № 26 увеличение количества положительных реакций IgM антител, у пациента № 29 появление IgM антител в период наблюдения после лечения может рассматриваться как неблагоприятный прогностический признак и может расцениваться как реактивация инфекции. Определение противотрепо-немных IgM антител у пациентов с установлением серологической резистентности (№ 17, 18) при отсутствии динамики со стороны других серологических тестов может свидетельствовать о персистенции в организме бледных трепонем и служить показанием к проведению дополнительного специфического лечения [3, 4, 14].
При сравнении нРИФ(^М) с РПГА значение вероятности р=0,0412 <0,05, т. е., при определении серологических изменений в процессе терапии сифилиса данные методы обладают разной эффективностью. Полученный результат согласуется с информацией о незначительном снижении позитивности реакции РПГА у переболевших сифилисом даже спустя многие годы после полноценно-
МИКРОБИОЛОГИЯ
го лечения, хотя имеются отдельные наблюдения по возможности негативации РПГА в динамике сероконтроля терапии сифилиса [18].
Статистический анализ констатировал сходную эффективность стандартных серологических тестов и метода нРИФ на иммуночипе с 12 диагностическими антигенами при оценке излеченности. Высокая степень соответствия результатов определяется общностью используемых в постановке серологических реакций антигенов бледной трепонемы - Тр15, Тр17, Тр47, TmpA. нРИФ позволяет охарактеризовать роль каждого из участвующих антигенов в динамике иммунного ответа в процессе лечения. Среди антигенов T. pallidum, индуцирующих негатива-цию иммунного ответа IgG антител при адекватном лечении ранних форм сифилиса, преобладают TmpA, Тр47, Тр971, в случае позднего скрытого сифилиса - Тр453, Тр971. Стимуляция выработки IgM антител к большинству антигенов, присутствующих на иммуночипе, в случае эффективной терапии в течение года прекращается. У пациентов с сохранившимися после полноценного лечения положительными серологическими реакциями поддерживается высокая активность антител обоих классов к большинству анализируемых рекомбинантных белков T. pallidum. Случаи предполагаемой реинфекции сопровождаются появлением IgM антител к Тр971 и Тр47.
Заключение. Серологические тесты остаются основными методами лабораторного подтверждения диагноза сифилиса, при этом использование данных методов для контроля эффективности лечения не всегда позволяет определить активность течения инфекции. Одновременное определение трепонема-специфических антител разных классов (IgG, IgM) к расширенной панели рекомбинантных антигенов T. pallidum методом нРИФ может расширить возможности стандартных серологических тестов для оценки эффективности проведённой антибактериальной терапии больных сифилисом, позволит определить тактику ведения пациентов с серологической резистентностью, серологическим рецидивом и реинфекцией.
В работу включена небольшая выборка сывороток крови больных сифилисом, поэтому более корректная оценка диагностической чувствительности и эффективности метода нРИФ и возможность его применения для определения трепонема-специфических антител разных классов (IgG, IgM) к расширенной панели рекомби-нантных антигенов T. pallidum, нуждается в проведении дальнейших исследований.
Финансирование. Работа была выполнена при поддержке грантаРНФ № 17-75-20039.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп.3-14 см. REFERENCES)
1. Красносельских Т.В., Соколовский Е.В. Достижения и перспективы совершенствования серологической диагностики сифилиса и оценки излеченности Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. 2010; 4: 69-75.
2. Ляхов В.Ф., Борисенко К.К., Потекаев Н.С., Борисова Т.К., Сидорова Е.В. Динамика трепонемоспецифической иммуноглобу-линемии при ранних формах сифилиса. Вестник дерматологии и венерологии. 1990; 8: 38-42.
15. Рунина А.В., Катунин Г.Л., Филиппова М.А., Затевалов А.М., Кубанов А.А., Дерябин Д.Г. Иммуночип для серологической диагностики сифилиса с использованием расширенной панели рекомбинантных антигенов T. ра1Шит. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2018; 165(6):726-73.
16. Хайруллин Р.Ф. Ротанов С.В., Фриго Н.В., Белоусова А.В. Био-информатический анализ специфических антигенов T. pallidum. Вестник дерматологии и венерологии. 2012; 5: 56-64.
17. Негашева Е.С., Ротанов С.В. Клинико-серологическое наблюдение пациентов, получивших лечение по поводу ранних форм сифилиса. Клиническая дерматология и венерология. 2015; 4: 42-9.
18. Дмитриев Г. А., Аковбян В.А., Тихонова Л.И. Эволюция лабораторной диагностики сифилиса. Инфекции, передаваемые половым путем. 2001; 6: 35-7.
REFERENCES
1. Krasnosel'skikh T.V., Sokolovskiy E.V. Achievements and prospects of syphilis serology diagnostics improvement and evaluation cure. Sovremennye problemy dermatovenerologic immunologii i vrachebnoy kosmetologii. 2010; 4: 69-75. (in Russian)
2. Lyahov V.F., Borisenko K.K., Potekaev N.S., Borisova T.K., Sidorova E.V.. Dynamics pallidum specific immunoglobulins in early syphilis. Vestnik dermatologii i venerologii. 1990; 8: 38-42. (in Russian)
3. Baker-Zander SA, Roddy RE, Handsfield HH, Lukehart SA. IgG and IgM antibody reactivity to antigens of Treponema pallidum after treatment of syphilis. Sexually Transmitted Diseases. 1986; 13(4):214-20.
4. O'Neill P, Nicol CS. IgM class antitreponemal antibody in treated and untreated syphilis. British Journal of Veneral Diseases. 1972; 48: 460-3.
5. Wilkinson AE, Rodin P. IgM-FTA test in syphilis in adults: its relation to clinical finding. British Journal of Veneral Diseases. 1976; 52: 219-23.
6. Merlin S., Andre J., Alacoque B., Paris-Hamelin A. Importance of specific IgM antibodies in 116 patients with various stages of syphilis. Genitourinary Medicine. 1985; 61 (2): 82-7.
7. Isinaga M., Sasaki E. Clinical survey of syphilis at the Dermato-logical Clinic of Nippon Medical School Hospital from 1984 to 1988, with special reference to the recent clinical manifestation and evaluation of IgM antibodies to Treponema pallidum. The Journal ofDermatology. 1990; 17: 618-29.
8. Muller F., Moskophidis M. Evaluation of an enzyme immunoassay for IgM antibodies to Treponema pallidum in syphilis in man. British Journal of Veneral Diseases. 1984; 60: 288-92.
9. Egglestone S.I., Turner A.J.L. Serological diagnosis of syphilis. Communicable disease and public health. 2000; 3: 158-62.
10. Castro R., Prieto E.S., Santo I. et al. Evaluation of enzyme immu-noassay technique for detection antibodies against Treponema pal-lidum. Journal Clinical Microbiology. 2003; 41: 250-3.
11. McMillan A., Young H. Qualitative and quantitative aspects of serologic diagnosis of syphilis. International Journal of STD & AIDS. 2008; 19: 620-4.
12. Bosshard P. P., Graf N., Knaute D. F. et al. Response of Treponema pallidum particle agglutination test titers to treatment of syphilis. Clinical Infectious Diseases. 2013; 56 (3): 463-4.
13. Baughn RE, Jorizzo JL, Adams CB, Musher DM. IgG class and IgG subclass responses to Treponema pallidum in patients with syphilis. Journal of Clinical Immunology. 1988; 8(2):128-39.
14. Moskophidis M, Muller F. Molecular analysis of immuno-globulins M and G immune response to protein antigens of Treponema pallidum in human syphilis. Infection and Immunity. 1984; 43(1):127-32.
15. Runina A.V., Katunin G.L., Filippova M.A., Zatevalov A.M., Kubanov A.A., Deryabin D.G. Immunochip for serological diagnosis of syphilis using an extended panel of recombinant antigens T. рallidum. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2018; 165(6):726-73. (in Russian)
16. Hayrullin R.F. Rotanov S.V., Frigo N.V., Belousova A.V. Bioinfor-matic analysis of T. pallidum specific antigens. Vestnik dermatologii i venerologii. 2012; 5: 56-64. (in Russian)
17. Negasheva E.S., Rotanov S.V. Clinical and serological surveillance of patients treated for early syphilis forms. Klinicheskaya derma-tologiya i venerologiya. 2015; 4: 42-9. (in Russian)
18. Dmitriev G.A., Akovbyan V.A., Tihonova L.I. Evolution of laboratory testing for syphilis. Infektsii, peredavaemye polovym putem. 2001; 6: 35-7. (in Russian)
Поступила 25.06.19 Принята к печати 25.07.19
