CC BY
35
БИОЛОГИЯ
УДК 612.017.1:616-001
РАСТВОРИМЫЕ МОЛЕКУЛЫ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ I И II КЛАССОВ В КРОВИ БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛОЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ
© 2010 г. С.В. Новикова1, Н.Б. Преснякова1, В.В. Королева1, В.В. Новиков\
М.Ю. Лебедев3, М.Н. Шолкина3, А. О. Трофимов3
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной 3Нижегородский НИИ травматологии и ортопедии
mbre@mail.ru
Поступила в редакцию 09.04.2010
Изложены результаты исследования сывороточного уровня эНЬА-! и эНЬА-БЯ, а также количества НЬА-1+ и НЬА-БЯ+ лимфоцитов периферической крови у пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой. Показано, что экспрессия НЬА-1 увеличена в ранний посттравматический период, а секреция эНЪА-! - у впоследствии погибших больных. Экспрессия всех форм молекул НЬА-БЯ снижена на всех стадиях обследования.
Ключевые слова: НЬА I класса, НЬА-БЯ, тяжелая черепно-мозговая травма.
Введение
Тяжесть состояния после тяжелой черепномозговой травмы (ЧМТ), высокая частота присоединения посттравматических инфекций во многом определяются состоянием иммунной системы организма пострадавшего [1,2]. В связи с этим, все большее значение уделяется способам иммунотерапии, разработка которых возможна лишь на основании знания молекулярноиммунологических аспектов тяжелой черепномозговой травмы. Известно, что молекулы гистосовместимости HLA I класса (sHLA-I) могут присутствовать в сыворотке крови и других биологических жидкостях в растворимой форме. Они образуются за счет протеолитического срезания мембранных форм молекул HLA I класса (mHLA-I) сериновыми протеазами [3]. Кроме этого, секреция растворимых молекул HLA-I может осуществляться путем альтернативного сплайсинга пре-мРНК [4, 5]. Установлено, что значительные количества sHLA-I секретируются активированными Т- и В-лимфоцитами как in vitro, так и in vivo. Естественным лигандом sHLA-I выступает молекула CD8.
Значимые изменения уровня sHLA-I в сыворотке крови происходят при самых различных заболеваниях. Описано повышение уровня sHLA-I при системной красной волчанке, у
больных с различными лимфомами, при ВИЧ-инфекции, поражениях печени различной этиологии, при раке желудка, лихорадочных состояниях, ревматоидных заболеваниях, при вирусных гепатитах В, С, в, при раке молочной железы на III и IV стадиях заболевания. Снижение уровня 8НЬА-1 показано при одной из форм сифилиса. Известна прогностическая значимость уровня 8НЬА4 при тяжелых ожогах, вирусных гепатитах, трансплантациях различных органов [6, 7].
Растворимые формы одного из подклассов молекул гистосовместимости II класса - НЬА-БЯ ^НЬА-БЯ) определяются в виде гетеродимера в сыворотке крови и других биологических жидкостях, включая цереброспинальную и синовиальную жидкости [8-10]. Они образуются путем альтернативного сплайсинга пре-мРНК [11] или кливеджа (протеолитического срезания молекул с поверхности клеток) нейтральными сериновыми протеазами, в том числе НЬБ (человеческая лейкоцитарная эластаза) или катепсином в [12]. Известно, что растворимые молекулы НЬА-БЯ способны существовать в межклеточном пространстве в виде стабильного комплекса с СБ74 антигеном [13]. Другой способ существования растворимых молекул НЬА-БЯ заключается в агрегации гетеродимеров между собой. Все фракции 8НЬА-БЯ в высоких концентрациях способны супрессировать Т-клеточный ответ [11].
Основными продуцентами растворимых форм молекул НЬА-БЯ являются активированные антигенпрезентирующие клетки (дендритные клетки, моноциты, макрофаги, В-лим-фоциты) и, в меньшей степени, активированные Т-хелперы, Т-цитотоксические лимфоциты, имеющие фенотип клеток памяти (СБ45ЯО) [9, 14], а также КК-клетки. Естественным лигандом 8НЬА-БЯ выступает комплекс ТСЯ-СБ4 [15]. Значительные изменения содержания 8НЬА-БЯ в сыворотке крови происходят при самых различных заболеваниях. Описано повышение уровня 8НЬА-БЯ при злокачественных заболеваниях, рассеянном склерозе, Н^-инфекции, ревматоидном артрите и других аутоиммунных болезнях. Снижение содержания сывороточного уровня 8НЬА-БЯ антигенов обнаружено у больных, получивших механическую травму, осложненную последующим сепсисом [16], а также у больных с ожогами [7].
Задачи настоящей работы - исследование сывороточной концентрации растворимых молекул гистосовместимости I класса и растворимых форм НЬА-БЯ, а также определение уровня экспрессии их мембранных аналогов на лимфоцитах периферической крови у пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой.
Материалы и методы
Исследованы образцы крови 76 пациентов (68 мужчин и 8 женщин) с тяжелой черепномозговой травмой (по шкале Комы Глазго индекс тяжести состояния больных - до 8 баллов), лечившихся в Нижегородском межобластном нейрохирургическом центре больницы № 39. Возраст пациентов варьировал от 18 до 68 лет (в среднем - 43 года). Причинами травм явились: дорожно-транспортное происшествие -39 (51.3%), падение с высоты - 7 (9.2%), побои -21 (27.6%), бытовые повреждения - 4 (3.7%) и прочие неизвестные обстоятельства -5 (7.6%). Сроки госпитализации составили от
одних суток до 35 дней. В зависимости от исходов черепно-мозговой травмы пациенты были разделены на две группы. В первую группу вошли 26 пострадавших, у которых тяжелая черепно-мозговая травма послужила причиной смерти, наступившей в сроки от 1 до 14 суток с момента получения травмы. Во вторую группу включены 50 пациентов, которые были выписаны на амбулаторное долечивание или переведены в неврологический стационар в удовлетворительном состоянии. В качестве контроля использовали образцы крови 35 клинически здоровых доноров. Средний возраст доноров составил 36 лет.
Молекулы гистосовместимости на поверхности лимфоцитов выявляли методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител ИКО-1 (против НЬА-БЯ) и ИКО-53 (против альфа-цепи молекул НЬА I класса). Содержание растворимых форм молекул гистосовместимости I класса в сыворотке крови пациентов изучали с помощью иммуно-ферментного анализа с использованием моноклональных антител ИКО-53 (против альфа-цепи молекул НЬА I класса) и ИКО-216 (против в2-микроглобулина) как описано ранее [6]. Содержание растворимых форм молекул НЬА-БЯ в сыворотке крови исследовали с помощью им-муноферментного метода с применением моноклональных антител ИКО-1 и козьих поликлональных антител против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток человека [17].
При статистическом анализе использовали программный пакет ЗРББ 14/0. Результаты выражали в виде М±т. При р < 0.05 результаты считали достоверными.
Результаты и их обсуждение
Обнаружено, что на фоне тяжелой черепномозговой травмы происходят значительные изменения экспрессии мембранных молекул НЬА-БЯ и НЬА I класса (табл. 1). Это выражается в
Таблица 1
Относительное содержание лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих молекулы гистосовместимости (%)
Популяция лимфоцитов Норма Группы пациентов Время после ЧМТ, сутки
1-3 4-7 8-14 15-21
НЬА4+ 56.4±1.3 умерших 65.9±3.8* 44±3.3* 26.6±3.3* -
выживших 74.8±2.4* 63.5±3.6 56.8±3 54.0±2.6
НЬА-БЯ+ 37.9±2.4 умерших 16.4±2.8* 18.0±3.1* 14.1± 2.8* -
выживших 23.1± 2.0*’" 21.5±1.6* 25.1±1.9*’** 28.6±2.9*
* Статистически достоверные различия в сравнении с нормой (р < 0.05).
** Статистически достоверные различия в сравнении с группами (р < 0.05).
Таблица 2
Содержание растворимых молекул НЬЛ-1 и НЬЛ-БЯ в сыворотке крови больных с тяжелой черепно-мозговой травмой (ед/мл)
Растворимая молекула Здоровые доноры Группы больных Время после ЧМТ, сутки
1-3 4-7 8-14 15-21
бНЬЛ-і 1032±36 умершие 2172±266*’** 1411±262* 2455±303*’** -
выжившие 1516±170* 1301±234 1279±133 1323±202
вНЬЛ-БЯ 100±12 умершие 19±7* 28±14* 21±13* -
выжившие 32±9* 37±13* 35±6* 38±13*
* Статистически достоверные различия в сравнении с нормой (р < 0.05).
** Статистически достоверные различия в сравнении с группами (р < 0.05).
снижении относительного и абсолютного числа клеток НЬА-БЯ+ как в группе погибших, так и в группе выживших пациентов. Имелись достоверные различия в содержании абсолютного количества лимфоцитов НЬА-БЯ+ в периферической крови погибших и выживших пострадавших (р < 0.05).
Период первых трех суток от момента травмы вне зависимости от ее исхода характеризовался повышением относительного числа клеток НЬА4+. Однако уже с 4-х суток после черепно-мозговой травмы у впоследствии погибших относительное число лимфоцитов НЬА4+ было достоверно ниже нормальных значений. В группе выживших пострадавших на протяжении второй и третьей недель после травмы определялась лишь тенденция к снижению относительного количества лимфоцитов НЬА4+.
Выявлены значительные изменения сывороточного содержания 8НЬА4 в зависимости от исхода и времени, прошедшего с момента травмы (табл. 2). В группе погибших пациентов с первых суток после тяжелой черепно-мозговой травмы определялось статистически достоверное повышение уровня молекул 8НЬА4 (210% по сравнению с донорской группой и 143% по сравнению с выжившими больными). На 4-7 сутки после травмы содержание 8НЬА4 имело тенденцию к повышению (137% по сравнению с нормальными величинами и 108% по сравнению с уровнем у выживших). На 8-14 сутки в сыворотке крови впоследствии погибших концентрация 8НЬА4 резко увеличивалась (238% по сравнению с донорами и 191% по сравнению с выжившими больными). У выживших пострадавших в период с 4-х по 21-е сутки определялась лишь тенденция к повышению сывороточной концентрации 8НЬА-!
Начиная с первых суток после тяжелой черепно-мозговой травмы, наблюдалось досто-
верное снижение сывороточного уровня 8НЬА-БЯ в обеих группах пострадавших. В этот период содержание 8НЬА-БЯ в сыворотке крови впоследствии погибших составляло лишь 20% от уровня нормы, а у выживших - 32%. На 4-7 сутки от момента травмы уровень растворимых молекул НЬА-БЯ был снижен в обеих группах пациентов (29% от нормы у впоследствии погибших и 37% у выживших соответственно). В период между 8 и 14 сутками после травмы у впоследствии погибших пациентов содержание 8НЬА-БЯ в сыворотке крови составляло 21% от уровня здоровых добровольцев. У выживших пациентов в течение второй и третьей недель наблюдения уровень 8НЬА-БЯ был также достоверно понижен и составлял 35% и 38% от нормы, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что тяжелая черепномозговая травма, независимо от ее исхода, приводит к значительному снижению как относительного количества лимфоцитов НЬА-БЯ+, так и уровня растворимых молекул НЬА-БЯ в сыворотке крови пациентов на протяжении всего периода наблюдения.
Таким образом, тяжелая черепно-мозговая травма приводит: 1) к достоверному повышению относительного количества лимфоцитов НЬА4+ в раннем посттравматическом периоде, 2) повышению сывороточного
уровня молекул 8НЬА4 у пациентов с неблагоприятным исходом; 3) к статистически достоверному снижению сывороточного содержания молекул 8НЬА-БЯ и относительного количества лимфоцитов НЬА-БЯ+ в обеих группах больных в течение всех периодов наблюдения.
Список литературы
1. Лисяной Н.И., Радзиевский А.А., Головко О.Ю. ЧМТ как пусковой механизм формирования вторич-
ного иммунодефицита и возможность его коррекции // Нейрохирургия. Киев. 1990. № 23. С. 58-64.
2. Горбунов В.И. Автореферат дис. ...д-ра мед. наук. М.: ММА ин. им. И.Н. Сеченова, 2000. 38 с.
3. McDonald J.C., Adamashvili I. Soluble HLA: A review of the literature // Hum. Immunol. 1998. V. 59. P. 387-403.
4. Le J., Hua J.C. Production of soluble HLA-class-I molecules by IFN-gamma-induced colon-adeno-carcinoma cells // Int. J. Cancer. 1995. V. 4. P. 576-581.
5. Mark L., Heaney D., Golde W. Soluble Cytokine Receptors // Blood. 1996. V. 87. № 3. P. 847-857.
6. Lebedev M.Ju., Krizhanova M.A., Vilkov S.A. et al. Peripheral blood lymphocytes immunophenotype and serum concentration of soluble HLA class I in burn patients // Burns. 2003. V. 29. P. 123-128.
7. Новиков В.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы. М.: Изд-во МИА, 2008. 249 с.
8. Hausmann S., Claus R., Buchwald S. et al. Quantitation of soluble HLA-DR antigens in human serum and other body fluids // Infusionsther Transfusionsmed. 1994. V. 32. P. 281-287.
9. JendroM., GoronzyJ.J., WeyandC.M. Structural and functional characterization of HLA-DR molecules circulating in the serum // Autoimmunity. 1991. V. 8. P. 289-296.
10. Aultman D., Adamashvili I., Yaturu K. et al. Soluble HLA in human body fluids // Hum. Immunol. 1999. V. 60. Р. 239-244.
11. Claus R., BittorfT., Walzel H. et al. High concentration of soluble HLA-DR in the synovial fluid: Rebmann V generation and significance in «rheumatoid-like» inflammatory joint diseases // Cell Immunol. 2000. V. 206. P. 85-100.
12. Seidl C., Lee J.S. Expression of alternatively spliced HLA class II transcripts in lymphoid and nonlymphoid tissues // Immunogenetics. 1992. V. 35. P. 385-390.
13. RebmannV., Ugurel S., Tilgen W. et al. Soluble HLA-DR is a potent predictive indicator of disease progression in serum from early-stage melanoma patients // Cancer. 2002. V. 100. P. 580-585.
14. Mазуров Д.В., Mастерник Ю.А., Пинегин Б.В. Возрастные изменения T-лимфоцитов человека, несущих маркеры CD45RO и HLA-DR // Иммунология. 2002. № 5. С. 268-271.
15. Claus R., Hausmann S., Zavazava N. et al. In vitro effects of solubilized HLA-DR-role in immunoregu-lation // Cell Immunol. 1994. V. 155. P. 476-485.
16. Ditschkowski M., Kreuzfelder E., Rebmann V. et al. HLA-DR expression and soluble HLA-DR levels in septic patients after trauma // Ann. Surg. 1999. V. 229. P. 246-254.
17. Худякова Н.Е., Mартынова TX., Никитина И.А. и др. Разработка и апробация иммунофермент-ного метода определения растворимой формы молекул HLA-DR // Вестн. Нижегородского ун-та им. Н.И. Лобачевского. Сер. «Биология». 2001. № 1(5). С. 191-194.
SERUM LEVELS OF SOLUBLE HLA CLASS I AND HLA-DR IN PATIENTS WITH BRAIN INJURY
S. V. Novikova, N.B. Presnyakova, V. V. Korolyova, V. V. Novikov,
M.Yu. Lebedev, M.N. Sholkina, A.O. Trofimov
Serum levels of sHLA-I and sHLA-DR has been determined by ELISA sandwich method in patients with severe traumatic brain injury and healthy volunteers. sHLA-I level was significantly increased in non-survivors during the whole period of their stay in the clinic and in survivors during the first 3 days compared to the volunteers. Simultaneously, a decrease in sHLA-DR level in the patients with severe traumatic brain injury versus volunteers was observed during the whole period of their stay in the clinic. The number of HLA-I+ lymphocytes in all patients was significantly increased during the early posttraumatic period.
Keywords: HLA class I, HLA-DR, brain injury.
