CC BY
29
Физиология и иммунология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 275-279
УДК 576.524:616-006
СЫВОРОТОЧНЫЙ УРОВЕНЬ РАСТВОРИМЫХ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫХ МОЛЕКУЛ ПРИ ОСТРОМ ЛИМФОБЛАСТНОМ ЛЕЙКОЗЕ У ДЕТЕЙ
© 2012 г. Л.А. Пашева1’3, Н.Б. Преснякова1, В.В. Королёва1, Г.А. Захаренкоъ,
Л.П. Пирогова3, Г.Л. Туманинаъ, О.А. Овсянникова3
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2 Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной 3 Нижегородская областная детская клиническая больница
Поступила в редакцию 12.03.2012
Проведен сравнительный анализ уровня суммарных и олигомерных фракций растворимых молекул CD25, CD38, CD95, суммарной фракции растворимых молекул CD8, НЬА I класса, HLA-DR и растворимого комплекса HLA-I-CD8 в сыворотке крови 22 детей от 2 до 17 лет с первичным острым лимфобластным лейкозом из предшественников В-лимфоцитов. Обнаружено повышение сывороточного уровня олигомерных и суммарных фракций растворимых молекул CD25, CD38, CD95, а также молекул HLA-DR и растворимого комплекса HLA-I-CD8. Полихимиотерапия больных в большинстве случаев нормализовала повышенный сывороточный уровень растворимых дифференцировочных молекул.
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, растворимые дифференцировочные молекулы, CD25, CD38, CD95, CD8, ^А I класса, комплекс ^А-!^8, HLA-DR.
Перспективы в понимании регуляции противоопухолевого иммунного ответа при гемобла-стозах в комплексе с иммунофенотипированием костного мозга дает определение уровня растворимых дифференцировочных молекул и молекул гистосовместимости [1, 2]. Последние образуются путем протеолитического шеддинга (отщепления мембранных белков с поверхности клеток) или альтернативного сплайсинга матричной РНК и могут образовывать олигомеры. Изменение их концентрации в сыворотке крови становится причиной нарушения взаимодействий иммунокомпетентных клеток, а значит и модуляции иммунного ответа. Детекция растворимых дифференцировочных молекул в сыворотке крови человека имеет дифференциально-диагностическое и мониторинговое значение при многочисленных иммуноопосредованных заболеваниях [2, 3]. Изменение уровня этих молекул в сыворотке крови больных онкогемато-логическими заболеваниями подтверждено в ряде исследований [4-6], однако информация об уровне олигомерных форм растворимых диф-ференцировочных антигенов и их растворимых комплексов при острых лимфолейкозах у детей отсутствует. Цель настоящего исследования -анализ уровня суммарных (sum) и олигомерных (ol) фракций растворимых молекул CD25, CD38, CD95, CD8, HLA I класса, комплекса
HLA-I-CD8 и HLA-DR в сыворотке крови детей с первичным острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) из предшественников В-лимфоцитов, а также оценка их изменений на ранних этапах терапии.
Материалы и методы
Исследованы образцы костного мозга, полученные путем пункции подвздошной кости, и сыворотки крови 22 детей от 2 до 17 лет (медиана возраста - 4 года) с первичным ОЛЛ из предшественников В-лимфоцитов (в том числе 17 с диагнозом пре-пре-В-ОЛЛ (common) и 5 с пре-В-ОЛЛ), полученные до начала лечения и в период с 15-го по 21-й день индукционной терапии по протоколу ALL-MB-2008 [7]. Морфологическое исследование и подсчет форменных элементов костного мозга проводили по методу М.И. Аринкина [8]. Оценка иммунологического фенотипа бластных клеток проведена иммунологической лабораторией Нижегородской областной детской клинической больницы методом проточной цитофлюориметрии (зав. лабораторией Горбатова Н.А., ст. ординатор Пасина Г.В.). Диагноз устанавливался в соответствии с классификацией Всемирной Организации Здравоохранения и на основании иммунофенотипи-ческой характеристики лейкемических клеток
(EGIL-95). В качестве контроля использованы 57 образцов сыворотки крови практически здоровых детей сходного возраста (медиана возраста - 6 лет). Определение уровня растворимых молекул проводили двухсайтовым имму-ноферментным методом с использованием моноклональных антител серии ИКО [9]. Результаты выражали в условных единицах (и/т1).
Результаты представлены в виде медианы и диапазона данных (25-75 процентили): Ме[25р;75р]. Для оценки статистической значимости различий между группой пациентов с ОЛЛ и группой здоровых детей использовали критерий Манна-Уитни, при анализе статистической значимости изменений у пациентов на этапе лечения - критерий Уилкоксона. Анализ корреляционных взаимоотношений между исследуемыми показателями осуществляли с помощью критерия Спирмена. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми прир < 0.05.
Результаты исследования и их обсуждение
В пунктатах костного мозга детей с диагнозом ОЛЛ из предшественников В-лимфоцитов до начала лечения количество миелокариоцитов колебалось в широких пределах, медиана составила 60.8[13.2;133.8]- 109/л. Медиана относительного количества бластных клеток в костном мозге составила 79[51.3;91.3]%.
Выявлено, что уровень растворимых диффе-ренцировочных молекул и их ассоциатов как у здоровых детей, так и детей с ОЛЛ характеризуется высокой вариабельностью. Обнаружено статистически значимое повышение сывороточного уровня суммарных и олигомерных фракций растворимых молекул CD25, CD38, CD95, а также HLA-DR и комплекса HLA-I-CD8 у детей с ОЛЛ из предшественников В-лимфоцитов на этапе первичной диагностики заболевания, до начала специфической терапии, по сравнению с группой здоровых детей сходного возраста. Содержание молекул sCD8, sHLA I класса в сыворотке крови детей с лейкозом, по отношению к этим показателям у группы сравнения, существенно не менялось (таблица).
Корреляции между числом миелокариоци-тов, бластных клеток в пунктатах костного мозга и уровнем молекул sCD25sum, sCD25ol, sCD38sum, sCD38ol, sCD95sum, sCD95ol, sCD8, sHLA I класса, sHLA-I-CD8 и sHLA-DR в сыворотке крови детей с ОЛЛ из предшественников В-лимфоцитов не обнаружено.
При цитологическом исследовании миело-грамм детей с диагнозом ОЛЛ из предшествен-
ников В-лимфоцитов на 15-й день лечения обнаружен преимущественно малоклеточный костный мозг, медиана количества миелокарио-цитов составила 9.i[5.0;i7.0]• 109/л, при этом 20 из 22 детей находились в состоянии морфологической ремиссии (количество бластных клеток в пунктатах костного мозга составляло менее 5%).
На начальном этапе терапии в условиях цитопении, Т- и В-клеточного дефицита обнаружена тенденция к нормализации сывороточного уровня суммарных и олигомерных фракций молекул CD25, CD38, CD95, в то же время сывороточный уровень комплексов HLA-I-CDS в течение этого периода существенно не менялся. Отмечена тенденция к повышению сывороточного уровня CDS на этапе лечения, до начала лечения медиана составляла 6З8[495; 973] U/ml, в период с i5 по 2i день терапии - 790[561; 96i] U/ml, однако различия между сывороточным уровнем этих молекул на этапе лечения и уровнем группы сравнения оказались статистически незначимы (р > 0.05). Сывороточный уровень HLA-DR статистически значимо не менялся, превышая норму (таблица).
Растворимый рецептор интерлейкина-2 (sCD25) связывает интерлейкин-2 в крови, блокируя, таким образом, активацию Т-лимфо-цитов. Выявленное нами повышение его сывороточного уровня у детей с ОЛЛ из предшественников В-лимфоцитов до начала терапии является закономерным свидетельством угнетения противоопухолевого иммунного ответа. Этот факт, а также тенденция к нормализации концентрации sCD25 на этапе химиотерапии были зарегистрированы ранее [i0—i2], но преимущественно для объединенных групп пациентов с Т- и В- линейным ОЛЛ, а не для ОЛЛ из предшественников В-лимфоцитов.
Выявление линейно нерестриктированных антигенов HLA-DR, CD38 на бластных клетках при острых лейкозах в ряде случаев позволяет прогнозировать течение заболевания [2, 13, 14], поэтому исследование сывороточного уровня их растворимых аналогов представляет особый интерес. Предыдущими исследованиями показано увеличение сывороточного содержания sHLA-DR [15—i7], суммарной и олигомерной фракции sCD38 у взрослых пациентов с ОЛЛ [i7], однако в этих работах не были выделены группы Т- и В- линейной направленности.
В аспиратах костного мозга детей с ОЛЛ из предшественников В-лимфоцитов молекулы HLA-DR и CD3S были представлены на 85[73.8;90]% и 90[77.5;93.3]% бластных клеток соответственно. Корреляции между сывороточ-
Таблица
Уровень растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы в сыворотке крови детей, больных ОЛЛ, U/ml
Наименование растворимого белка Группы детей
ОЛЛ до начала лечения, n = 22 ОЛЛ, 15-21 день терапии, n = 22 Здоровые, n = 57
CD25sum 976 [498;1428] *,** 732[462;942] 498[411;729]
CD25ol 759[472;929]*,** 579[421;943]* 419[278;680]
CD38sum 478[268;804]*,** 340 [253;584]* 202[174;266]
CD38ol 642[469;969]*,** 626[402;1407]* 317[236;476]
CD95sum 903[606;1181]*,** 717[451;938]* 448[307;607]
CD95ol 617[358;876]*,** 429[334;687]* 303[264;358]
HLA-DR 186[150;303] * 238[130;315]* 92[74;111]
HLA-I 2184[1681;4325]** 1975[1515;3812] 2175[1558;3215]
HLA-I-CD8 862[584;1405]* 830[547;1267] 724[626;981]
CD8 638[491;972] 790[561;961] 616[530;769]
* Статистически значимые различия с группой здоровых (р < 0.05);
** статистически значимые различия с группой ОЛЛ, 15-21 день терапии (р < 0.05).
ным уровнем sHLA-DR и числом HLA-DR-положительных бластных клеток, а также между сывороточным уровнем суммарной и олигомерной фракций sCD38 и числом CD38-положительных бластных клеток не выявлено.
Заметим, что мономерная форма молекул CD38 в большей степени выполняет функцию белка адгезии, а димерная форма значительно проявляет функцию эктоэнзима [13, 14].
Обнаруженное нами увеличение содержания молекул sHLA-DR при В-ОЛЛ до начала лечения по отношению к группе сравнения может быть следствием активационных процессов, связанных с реализацией противоопухолевого Th1-иммунного ответа. В то же время сохранение уровней sHLA-I и sCD8 в пределах нормальных значений, с нашей точки зрения, является следствием слабости цито-токсического звена иммунитета. Предполагается, что sCD8 у больных В-ОЛЛ освобождается из нетрансформированных клеток, а уровень sCD8 прямо отражает количество CD8-положительных клеток. Полученные нами результаты относительно уровня sCD8 при ВОЛЛ противоречат данным предыдущих исследователей [10].
Выявленное увеличение содержания суммарной и олигомерной фракций sCD95 в сыворотке крови больных с ОЛЛ подтверждает результаты предыдущих исследований [1, 2]. Повышенный уровень растворимой формы CD95 у детей с лейкозом блокирует действие мембранного аналога, что ограничивает CD95-опосредованный апоптоз при исследуемой патологии. Нарушение баланса в CD95-рецепторно-ли-гандной системе приводит к дисрегуляции апоптоза, которая играет существенную роль в патогенезе гемобластозов.
Результаты исследований прогностической значимости экспрессии CD95 на бластных клетках при ОЛЛ противоречивы. По данным одних авторов, чаще экспрессия CD95 на мембране бластных клеток определялась при пре-пре-В-подварианте ОЛЛ. Это является клинически благоприятным признаком, увеличивающим как безрецидивную, так и общую выживаемость, в то время как отсутствие CD95 антигена на поверхности бластов позволяет говорить о плохом прогнозе в развитии болезни [18]. В более поздних исследованиях показано, что бластные клетки при Т-ОЛЛ имеют более высокий уровень экспрессии CD95 и большую чувствительность к рекомбинантному Fas-лиганду, чем бластные клетки при ОЛЛ из клеток-предшественников В-лимфоцитов [19].
Может ли сывороточный уровень sCD95 служить критерием эффективности циторедук-тивной терапии? Согласно современным представлениям, применение глюкокортикоидных гормонов (ГК) на этапе индукции ремиссии вызывает активацию ключевых элементов апопто-тической программы в лейкемических клетках. Однако механизм ГК-индуцированного апопто-за недостаточно изучен. Имеются данные, что мембранные рецепторы «региона клеточной смерти» не связаны с индуцированным ГК апоптозом, а вероятным инициатором активации каспазы-3, других каспаз, протеаз и ДНКаз, приводящей к апоптозу, является каспаза-9 [20]. Безусловно, наряду с детекцией мембранного CD95 на лимфобластах важным является определение его растворимого аналога в сыворотке крови пациентов. Это имеет ценность во взаимосвязи с огромным количеством факторов, участвующих в анализе сигналов клеточной смерти и выживания.
Нормализация сывороточного уровня большинства исследованных растворимых форм мембранных протеинов клеток иммунной системы на начальных этапах терапии ОЛЛ может быть следствием действия лекарственных препаратов, приводящих к апоптозу клеток-продуцентов растворимых протеинов. Кроме того, имеются сведения о подавлении ГК синтеза рецептора интерлейкина-2 (СБ25) [20]. Возможно, изменения сывороточного уровня растворимых форм мембранных протеинов обусловлены изменением интенсивности экспрессии этих белков на неапоптотических клетках у пациентов с первичным В-линейным ОЛЛ на этапе индукционной терапии под воздействием ГК, как было показано для других мембранных белков [2i].
Таким образом, показано статистически значимое повышение сывороточного уровня суммарных и олигомерных фракций растворимых молекул CD25, CD3S, CD95, а также HLA-DR и комплекса HLA-I-CDS у детей с ОЛЛ из предшественников В-лимфоцитов на этапе первичной диагностики заболевания по сравнению с группой здоровых детей сходного возраста, а также тенденция к нормализации сывороточного уровня суммарных и олигомерных фракций молекул CD25, CD3S, CD95, HLA I класс на начальном этапе терапии. Полученные данные позволяют дополнить представления о возможных механизмах реализации иммунного ответа у больных с ОЛЛ из предшественников В-лимфоцитов на стадии первичной диагностики и на раннем этапе индукционной терапии.
Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследова-ния и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 годы».
Список литературы
1. Новиков В.В. Растворимые формы дифферен-цировочных антигенов гемопоэтических клеток // Гематол. и трансфузиол. i996. № 6. С. 40—43.
2. Новиков В.В., Евсегнеева И.В., Караулов A^., Барышников A.Ю. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы при социально значимых инфекциях // Рос. биотерапевт. журн. 2005. Т. 4. № 2. С. i00—105.
3. Новиков В.В., Караулов A^., Барышников A.Ю. и др. Особенности структурного состояния пула растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы // Мол. медицина. 2009. № 4. С. 27—33.
4. Новиков В.В., Барышников A.Ю., Караулов A^. Растворимые формы мембранных антигенов
клеток иммунной системы // Иммунология. 2007. Т. 28. № 4. С. 249-254.
5. Голенков А.К., Митина Т.А., Новиков В.В. и др. Клиническое значение растворимых молекул адгезии (sCD50 - ICAM-3), апоптоза (sCD95) и sHLA класса I при лимфопролиферативных заболеваниях // Рос. биотерапевт. журн. 2002. Т. 1. № 1. С. 60-64.
6. Новиков В.В., Бабаев А.А., Кравченко Г.А. и др. Растворимые ассоциаты молекул адгезии CD54 и CD18 в сыворотке крови человека // Иммунология. 2008. Т. 29. № 4. С. 220-223.
7. Карачунский А.И., Румянцева Ю.В., Румянцев А.Г. Эволюция лечения острого лимфобластного лейкоза у детей: критическое использование мирового опыта в России // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2011. Т. 4. № 2. С. 15-31.
8. Луговская С.А., Морозова В.Т, Почтарь М.Е, Долгов В.В. Лабораторная гематология. М.-Тверь: «Триада», 2006. 222 с.
9. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. М.: Изд-во «Медицина», 1997. 212 с.
10. Srivastava M.D., Srivastava A., Srivastava B.I. Soluble interleukin-2 receptor, soluble CD8 and soluble intercellular adhesion molecule-1 levels in hematologic malignancies // Leuk. Lymphoma. 1994. V. 12. P. 241251.
11. Moon Y., Kim Y., Kim M. et al. Plasma soluble interleukin-2 receptor (sIL-2R) levels in patients with acute leukemia // Ann. Clin. Lab. Sci. 2004. V. 34 (4). P. 410-415.
12. Kalmanti M., Karamolengou K., Dimitriou H. et al. Serum levels of tumor necrosis factor and soluble interleukin 2 receptor as markers of disease activity and prognosis in childhood leukemia and lymphoma // Intern. J. Hematol. 1993. V. 57 (2). P. 147-152.
13. Deaglio S., Aydin S., Vaisitti T. et al. CD38 at the junction between prognostic marker and therapeutic target // Trends Mol. Medicine. 2008. V. 14 (5). P. 210218.
14. Lebedev M.Ju., Sholkina M.N., Vilkov S.A. et al. Serum levels of different forms of soluble CD38 antigen in burned patients // Burns. 2004. Т. 30. № 6. С. 552-556.
15. Herlyn M., Lange B., Bennicelli J. et al. Increased levels of circulating HLA-DR antigen in sera of patients with acute lymphoblastoid leukemia // Leuk. Res. 1984. V. 8 (3). Р. 323-334.
16. Stevenson F.K., George A.J., Walters M.T., Hamblin T.J. Analysis of soluble HLA class II antigenic material in patients with immunological diseases using monoclonal antibodies // J. Immunol. Methods. 1986. V. 86 (2). P. 187-190.
17. Новиков В.В., Гостюжова Е.А., Караулов A.B. и др. Состояние пула растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы при острых лейкозах // Рос. иммунол. журн. 2009. № 2. С. 164-170.
18. Лейкозы у детей / Под ред. Г.Л. Менткевича, С.А. Маяковой. М.: Практическая медицина, 2009. 384 с.
19. Akahane K., Inukai T., Zhang X. et al. Resistance of T-cell acute lymphoblastic leukemia to tumor necrosis factor--related apoptosis-inducing ligand-mediated apop-tosis // Exp. Hematol. 2010. V. 38 (10). Р. 885-895.
20. Астрелина Т.А., Владимирская Е.Б. Молекулярные механизмы чувствительности и резистентности лейкемических клеток к глюкокортикоидам при остром лимфобластном лейкозе // Вопросы гемато-
логии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2005. Т. 4. № 3-4. С. 10-19.
21. Мовчан Л.В., Шман Т.В., Белевцев М.В. и др. Изменение иммунофенотипа лейкемических клеток на этапах индукционной терапии острого лимфобластного лейкоза из предшественников В-лимфоцитов у детей // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2011. Т. 10. № 1. С. 21-26.
LEVEL OF SOLUBLE DIFFERENTIATION MOLECULES IN BLOOD SERUM OF CHILDREN WITH ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA
L.A. Pasheva, N.B. Presnyakova, V.V. Koroleva, G.A Zakharenko, L.P. Pirogova,
G.L. Tumanina, O.A. Ovsyannikova
A comparative analysis has been carried out of serum levels of total and oligomeric fractions of soluble molecules CD25, CD38, CD95, total fractions of soluble molecules CD8, HLA class 1, HLA-DR and soluble complex HLA-1-CD8 in blood serum of 22 children aged from 3 to 17 years with primary B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. An increase of serum levels has been found of total and oligomeric fractions of soluble molecules CD25, CD38, CD95 and HLA-DR and soluble complex HLA-I-CD8. In most cases these increased serum levels of soluble differentiation molecules have been normalized after polychemotherapy of the patients.
Keywords: acute lymphoblastic leukemia, soluble differentiation molecules, CD25, CD38, CD95, CD8, class 1 HLA, HLA-1-CD8 complex, HLA-DR.
