CC BY
26
DOI 10.31588/2413-4201-1883-241-1-62-66
УДК619:616078:616.98:578/579:636.2
ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА
Гериш Ашуак - аспирант, Галиуллин А.К. - д.в.н., профессор, Гумеров В.Г.1 - д.в.н., вед. научный сотрудник, Шаева А.Ю. - к.б.н., ассистент, Парамонов А.С.2 - зав. отделом ПЦР
ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана»
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
2 ГБУ «Республиканская ветеринарная лаборатория»
Ключевые слова: вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота, ПЦР-РВ с флуоресцентной детекцией, лабораторная диагностика
Keywords: bovine parainfluenza virus type 3, RT-PCR with fluorescence detection, laboratory diagnostics
Респираторные заболевания молодняка крупного рогатого скота, вызываемые вирусами парагриппа-3, диареи, инфекционного ринотрахеита и респираторно-синцитиальной болезни, представляют собой серьезную проблему для здоровья крупного рогатого скота во всем мире, в том числе и в России. [1, 5]. Наиболее тяжелые последствия среди этих инфекций вызывает вирус ПГ-3.
Вирус парагриппа- 3 (ПГ-3) крупного рогатого скота относится к семейству Paramyxoviridae [9]. Геном вируса представлен однонитевой нефрагментирован-ной РНК негативной полярности, размером порядка 15500 оснований. Белки возбудителя, взаимодействуя с геномной РНК, образуют вирусный нуклеокапсид
[3].
Парагрипп-3 крупного рогатого скота (инфекционный бронхит, бронхопневмония, острый катар верхних дыхательных путей, транспортная лихорадка, параинфлуэнца-3) - острое контагиозное заболевание крупного рогатого скота (преимущественно молодняка до 6-месячного возраста), характеризующееся катарально-гнойным поражением органов дыхания, лихорадкой, общим угнетением, приступами сухого, болезненного кашля, катаральным конъюнктивитом [2, 4]. Кроме того, у взрослых животных парагрипп-3
может проявляться в виде абортов [8]. Сложность диагностики увеличивается из-за постоянного смешанного течения болезни (осложнение сальмонеллезом, ста-филококкозом, пастереллёзом) [6].
Лабораторная диагностика возбудителя болезни парагриппа-3 крупного рогатого скота обычно выполняется путем выделения вируса в культуре клеток (золотой стандарт), вирус вызывает типичный ци-топатический эффект с образованием синцития и цитоплазматических включений [11]. Молекулярным методом, используемым для диагностики ПГ-3, является ПЦР с предварительной обратной транскрипцией [10, 7].
Целью исследования было определение эффективности полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с применением тест-системы «ПЦР-парагрипп-3 КРС-фактор» в диагностике парагриппа-3 крупного рогатого скота.
Материал и методы исследований. В работе использовались следующие вирусные штаммы:
- «^-4» - референтный штамм вируса ПГ-3, инфекционная активность на перевиваемых линиях культуры клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК) - 7,25 кг ТЦД 50 / мл.
- «ПТК-45/86» - вакцинный штамм вируса ПГ-3, инфекционная активность на
перевиваемой линии культуры клеток ЛЭК - 6,75 лг ТЦД 50 / мл.
- «ЛД-9» - вирусный изолят, выделенный из патологического материала, взятого от больного респираторным заболеванием теленка, инфекционная активность на перевиваемой линии культуры клеток ЛЭК - 6,25 кг ТЦД 50 / мл.
ПЦР проводили с использованием набора «ПЦР-парагрипп-3 КРС-фактор», согласно инструкции производителя (ООО «ВЕТ ФАКТОР», Москва-Троицк) на ам-плификаторе ДТ-96 («ДНК-технология», Россия).
Выделение РНК возбудителя из биологического материала осуществляли с применением набора «ДНК / РНК-с-
фактор» (ООО «ВЕТ ФАКТОР», Москва-Троицк).
Для экстракции РНК использовали 50 мкл биологического материала. Для процесса амплификации использовали по 10 мкл выделенной РНК при общем объёме реакционной смеси 25 мкл.
Для постановки ПЦР-РВ с флуоресцентной детекцией необходима двухцепо-чечная ДНК, поэтому амплификации фрагментов генетического материала вируса прагриппа-3 предшествовало преобразование молекулы РНК возбудителя в ДНК путём обратной транскрипции.
Обратная транскрипция и амплификация осуществлялись по режиму, описанному в таблице 1.
"аблица 1 - Темпе ратурно-временной режим амплификации на ДТ-96.
№ п/п Температурно-временной режим Число циклов
1 55оС-15минут (обратная транскрипция) 1
2 95оС-5мин 1
3 95оС-20сек 45
58оС-30с, детекция НЕХ, Су5
72оС-20сек
Результаты исследований. Результаты кривых накоплений флуоресцентного сигнала анализировали с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией к прибору.
Учет результатов ПЦР-РВ проводили по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установлен-
ной на соответствующем уровне пороговой линии. На рисунках 1, 2, 3 представлены полученные нами графики амплификации.
В соответствии с вышеизложенным, все использованные нами пробы, как и предполагалось, оказались положительными, т.е показали присутствие вируса па-рагриппа-3 крупного рогатого скота
Рисунок 1 - График амплификации по флуорофору НЕХ изолята «ЛД-9» вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота
Конгшн Т<1рИЙ1 I
Метод;
Клчестпо««!^
и чаш 1
Щ I 5: У I Ш
Пороговый (О)
•1С
1 I I I
11(гп1«оЫ (6Л
7 * в 1 16 «а 14 и 33 20 2? 34 3| П Л4 Зв 32
Номер цикле
№ I Идентификатор
К-
Лея I СуБ мтк 'V"»
ЛЗ
ООРЙЯЧ!
12.1 я> С I
Рисунок 2 - График амплификации по флуорофору НЕХ вакцинного штамма «ПТК 45/86» вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота
! Тип анализа: Метод:
Качеств&тьй
Л
Пороговый (£3)
3
£
3
200
50- о
ТЪгеаЬоЫ (5,0)
-!-!-!-
№ Идентификатор | Нех 1 1 Су 5 [ Качественный О I анализ
щ нд
дг | 1 к- 27,3 -
АЗ Обртэеи 14.7 21 .Э
К» 21.0 1Э.О 1 ■ 1
в 3 10 12 14 15 13 20 22 24 26 23 30 32 34 36 35 40 42 Номер цикла
Рисунок 3 - График амплификации по флуорофору НЕХ референтного штамма «^-4» вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота
Таблица 2 - Анализ по номеру цикла по видам штамма
№ п/п Штамм Идентификатор СТ Качественный анализ
1 Вирусный изолят К- - -
«ЛД-9» Образец 13,0 +
К+ 23,1 +
2 Вакцинный К- - -
штамм «ПТК Образец 12,1 +
45/86» К+ 20,4 +
3 Референтный К- - -
штамм «SF-4» Образец 14,7 +
К+ 21,0 +
Примечание: К- - отрицательный контроль; К+ - положительный контроль; СТ - номер цикла
На рисунках 1, 2 и 3 показаны графики накопления флуоресценции при постановке ПЦР-РВ со штаммами вируса ПГ-3. Сигналы флуоресценции исследуемых образцов во всех трёх случаях появляются значительно раньше, чем в положительных контролях, что указывает на изначально более высокую концентрацию вируса па-рагриппа-3 крупного рогатого скота в пробах. Расшифровка графиков с указанием номеров циклов начала сигнала флуоресценции представлена в таблице 2.
Результаты показали, что значения СТ контрольных образцов находятся в пределах нормы (СТ<31), значит наблюдается экспоненциальный рост сигнала по НЕХ, образец считается положительным, РНК вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота присутствует.
Заключение. Результаты исследований методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) известных штаммов (референтный «^-4», вакцинный «ПТК45/86» и вирусный изолят «ЛД-9») вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота, как и предполагалось, оказались положительными, так как РНК вируса ПГ-3 крупного рогатого скота присутствует во всех образцах.
При отрицательных контролях амплификации активности не зарегистрировано. Это говорит о высокой достоверности метода ПЦР-РВ при диагностике ПГ-3 КРС.
Кроме того, система ПЦР в реальном времени обеспечивает дополнительную возможность определить начальное количество целевой ДНК или РНК, присутствующей в образце.
Исходя из вышеизложенного, следует заключить, что полимеразная цепная реакция в реальном времени, основанная на обнаружении генетического материала возбудителя, является надежным, точным и быстрым методом диагностики пара-гриппа-3 и при этом не требует выделения и культивирования самого вируса.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Гумеров, В.Г. Эпизоотологиче-ский и серологический мониторинг смешанных респираторно-кишечных инфек-
ций крупного рогатого скота / В.Г. Гуме-ров [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана - 2019. - № 237(1). - С. 56-60.
2. Лисицын, В.В. Проблемы респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота и пути их решения / В.В. Лисицын // Ветеринария с/х животных. -2010. - № 5. - С. 12-16.
3. Allan, E.M. Some characteristics of a natural infection by parainfluenza-3 virus in a group of calves / E.M. Allan [et al.] // Research in Veterinary Science. - 1978. - V. 24(3). - P. 339-346.
4. Ellis, J.A. The immunology of the bovine respiratory disease complex / J.A. Ellis // Veterinary Clinic of North America Food Animal Practice. - 2001. - Vol. 17. - P. 535-550.
5. Galiullin, A.K. Inactivated Liposomal Vaccine Against Bovine Infectious Rhi-notracheitis And Parainfluenza-3 / A.K. Galiullin [et al.] / Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. -2019. - V. 10(1). - P. 1766-1771.
6. Henrickson, K.J. Parainfluenza Viruses / K.J. Henrickson // Clin. Microbiol. Rev. - 2003. - V. 16(2). - P. 242-264.
7. Horwood, P.F. Identification of two distinct bovine parainfluenza virus type 3 genotypes // P.F. Horwood, J.L. Gravel, T.J. Mahony // Journal of General Virology. -2008. - V. 89(7). - P. 1643-1648,
8. Kirkbride, C.A. Viral agents and associated lesions detected in a10-year study of bovine abortions and stillbirths / C.A. Kirkbride // J. Vet. Diag. Invest. - 1992. - V. 4(4). - P. 374-379.
9. Maidana, S. Isolation and characterization of bovine parainfluenza virus type 3 from water buffaloes (Bubalus bubalis) in Argentina / S. Maidana [et al.] // BMC Veterinary Research. - 2012. - 8:83. - P. 1-9.
10. Murphy, F. Paramyxoviridae / F. Murphy [et al.] // Veterinary Virology. Third Edition. - 1999. - P. 411-428.
11. Vaucher, R.A. RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV-3) / R.A. Vaucher, A.B. Simonetti, P.M. Roehe // Acta Scientiae Veterinariae. -2008. - V. 36(3). - P. 215-220.
ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА
Гериш Ашуак, Галиуллин А.К., Гумеров В.Г., Шаева А.Ю., Парамонов А.С.
Резюме
Целью работы было определение эффективности метода ПЦР в диагностике пара-гриппа-3 (111 -3) крупного рогатого скота. Для исследований использовали референтный штамм «SF-4», вакцинный штамм «ПТК-45/86» и изолят «ЛД-9» вируса парагриппа-3. В результате проведенных исследований установлена эффективность и высокая скорость постановки ПЦР-РВ с флуоресцентной детекцией в диагностике парагриппа-3 крупного рогатого скота.
Все исследованные штаммы вируса ПГ-3 показали положительную амплификацию.
REAL-TIME PCR FOR DIAGNOSIS OF BOVINE PARAINFLUENZA-3
Gueriche Achouak, Galiullin A.K., Gumerov V.G., Shaeva A.Yu., Paramonov A.S.
Summarу
The aim of the work was to determine the effectiveness of the PCR method in the diagnosis of bovine parainfluenza-3 (BPI-3). For research, we used the reference strain SF-4, the vaccine strain PTK-45/86 and the isolate LD-9 of the parainfluenza virus 3. As a result of the studies, the effectiveness and high execution speed of RT-PCR with fluorescence detection for the diagnosis of bovine parainfluenza type 3 were established.
All studied strains of BPIV-3 showed positive amplification.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-241-1-66-70 УДК 619:616078:616.98:578/579:636.2
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТА ВИРУСА ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Гериш Ашуак - аспирант, Гумеров В.Г.1 - д.в.н., вед.н.с, Галиуллин А.К. - д.в.н., профессор., Каримуллина И.Г.1 - к.б.н.
ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана» 1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической
безопасности»
Ключевые слова: вирус парагриппа-3, изолят, культура клеток, биологические свойства, физико-химические свойства
Keywords: parainfluenza-3 virus, isolate, cell culture, biological properties, physicochemical properties
Вирус парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота вызывает тяжелую форму инфекции при интенсивном животноводстве. Это один из наиболее распространенных возбудителей респираторных инфекций у крупного рогатого скота и овец, особенно у молодняка [2, 10].
Первичная инфекция ПГ-3 обычно
сопровождается вторичными бактериальными инфекциями, которые могут привести к гибели животного. Неблагоприятные факторы окружающей среды, такие как низкая температура, высокая влажность, загазованность помещений и неполноценное кормление, могут также влиять на течение заболевания молодняка крупного
