CC BY
23
ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА
Гериш Ашуак, Галиуллин А.К., Гумеров В.Г., Шаева А.Ю., Парамонов А.С.
Резюме
Целью работы было определение эффективности метода ПЦР в диагностике пара-гриппа-3 (111 -3) крупного рогатого скота. Для исследований использовали референтный штамм «SF-4», вакцинный штамм «ПТК-45/86» и изолят «ЛД-9» вируса парагриппа-3. В результате проведенных исследований установлена эффективность и высокая скорость постановки ПЦР-РВ с флуоресцентной детекцией в диагностике парагриппа-3 крупного рогатого скота.
Все исследованные штаммы вируса ПГ-3 показали положительную амплификацию.
REAL-TIME PCR FOR DIAGNOSIS OF BOVINE PARAINFLUENZAL
Gueriche Achouak, Galiullin A.K., Gumerov V.G., Shaeva A.Yu., Paramonov A.S.
Summary
The aim of the work was to determine the effectiveness of the PCR method in the diagnosis of bovine parainfluenza-3 (BPI-3). For research, we used the reference strain SF-4, the vaccine strain PTK-45/86 and the isolate LD-9 of the parainfluenza virus 3. As a result of the studies, the effectiveness and high execution speed of RT-PCR with fluorescence detection for the diagnosis of bovine parainfluenza type 3 were established.
All studied strains of BPIV-3 showed positive amplification.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-241-1-66-70 УДК 619:616078:616.98:578/579:636.2
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТА ВИРУСА ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Гериш Ашуак - аспирант, Гумеров В.Г.1 - д.в.н., вед.н.с, Галиуллин А.К. - д.в.н., профессор., Каримуллина И.Г.1 - к.б.н.
ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана» 1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической
безопасности»
Ключевые слова: вирус парагриппа-3, изолят, культура клеток, биологические свойства, физико-химические свойства
Keywords: parainfluenza-3 virus, isolate, cell culture, biological properties, physicochemical properties
Вирус парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота вызывает тяжелую форму инфекции при интенсивном животноводстве. Это один из наиболее распространенных возбудителей респираторных инфекций у крупного рогатого скота и овец, особенно у молодняка [2, 10].
Первичная инфекция ПГ-3 обычно
сопровождается вторичными бактериальными инфекциями, которые могут привести к гибели животного. Неблагоприятные факторы окружающей среды, такие как низкая температура, высокая влажность, загазованность помещений и неполноценное кормление, могут также влиять на течение заболевания молодняка крупного
рогатого скота. Источниками инфекции являются больные животные, инфицированные ПГ-3, которые выделяют вирус в окружающую среду секретами [1, 3].
В некоторых случаях может развиться интерстициальная пневмония. Первичные инфекции обычно проходят через 3-4 дня без последствий. Иммунитет недолговечный, и через несколько месяцев эти животные подвержены реинфекции ПГ-3 [6].
Вирус парагриппа типа-3 может инфицировать широкий спектр млекопитающих, включая людей, домашних животных и диких животных. Также сообщалось о межвидовых инфекциях, например, БР1У-3 у людей и овец, а также овец и у крупного рогатого скота, ВРГУ-3 является одной из причин респираторного заболевания крупного рогатого скота (BRDC). Этот вирус может вызвать повреждение тканей и иммуносупрессию, приводящую к тяжелой бронхопневмонии, особенно когда животные находятся в стрессовых условиях [4, 7, 8, 9].
Поэтому, диагностика и профилактика респираторных заболеваний крупного рогатого скота на сегодняшний день считается актуальной проблемой ветеринарной медицины [2, 5, 10].
Целью данной работы являлось сравнительное изучение биологических и физико-химических свойств изолята «ЛД-9» с вакцинным и референтным штаммами вируса парагриппа-3 КРС.
Материал и методы исследований. Первоначальную идентификацию выделенного цитопатогенного агента проводили путем определения типа нуклеиновой кислоты в его геноме. С этой целью в качестве ингибитора синтеза ДНК использовали 5-бромдезоксиуридин (5-БДУ). Учет реакции проводили титрованием обработанного материала на культуре клеток ПЭК. В качестве контроля использовали вакцинный штамм «ПТК-45/86» и референтный штамм «8Б-4» вируса парагриппа-3 КРС.
Сохранение инфекционной активности цитопатогенного агента после обработки 5-БДУ давало нам основание считать, что изолят является РНК-
содержащим вирусом, тогда как у ДНК-содержащих вирусов инфекционная активность снижается на 1,0 1§ ТЦД 50/мл и ниже.
Дальнейшая идентификация вирусного изолята «ЛД-9» основывалась на определение его гемагглютнирующих и гемадсорбирующих свойств.
Реакцию гемагглютинацию (РГА) ставили макрометодом в лунках пластиковых панелей. С этой целью во все лунки панеля вносили по 0,4 см3 физиологического раствора с рН 7,2-7,4. Затем в первую лунку вносили 0,4 см3 вируссо-держащей культуральной жидкости и путем последовательного переноса в последующие лунки получали двукратно возрастающий ряд разведения. После чего во все лунки вносили по 0,4 см3 1 %-ой суспензии эритроцитов крупного рогатого скота, барана, кролика и морской свинки. Тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре. Учет реакции производили после оседания эритроцитов в контроле по 3-х, 4-х крестовой оценке агглютинации.
Реакцию гемадсорбции проводили на культуре клеток ЛЭК с использованием 0,5-ных взвеси эритроцитов вышеперечисленных животных. С этой целью через 610 часов после инфицирования культуры клеток исследуемыми вирусными материалами во флаконы добавляли по 0,2 см3 взвеси эритроцитов и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Затем флаконы осторожно промывали раствором Хенкса, чтобы освободиться от осевших на монослой эритроцитов и просматривали под малым увеличением светового микроскопа.
При положительной реакции на поверхности зараженных клеток наблюдали диффузную адсорбцию эритроцитов, тогда как в интактной культуре они отсутствовали. Оценку реакции проводили визуально по 4-х крестовой степени адсорбции эритроцитов на монослое культуры клеток. Дальнейшую идентификацию изолята вируса осуществляли путем изучения его физико-химических свойств.
Термостабильность изолята «ЛД-9» изучали при Т 56 0С. С этой целью про-
бирки с пробами вирусного материала помещали в водяную баню с вышеуказанной температурой. После экспозиции 20, 30, 60 и 90 минут опытными пробами заражали культуру клеток. Снижение инфекционного титра более чем на 1,0 1§ ТЦД 50/мл свидетельствовало о чувствительности изолята вируса к данной температуре.
Устойчивость вирусного изолята к различным значениям рН среды определяли по следующей методике. Первоначально при помощи 0,1 М раствора соляной кислоты доводили до соответствующего
значения показатель рН поддерживающей среды. Затем 1 часть вирусного материала смешивали с 9 частями питательной среды соответствующей рН. После экспозиции в течение 3-х часов при комнатной температуре каждой пробой инфицировали культуру клеток. В качестве контроля использовали разведение вирусного материала в соотношении 1:10 в среде с рН 7,2. Устойчивость исследуемого изолята к различным показателям рН определяли по наличию ЦПД в монослое культуры клеток.
Таблица 1 - Изучение биологических и физико-химических свойств вируса парагриппа-3
КРС (п = 4)
№ Виды исследований Единица из- Вакцинный Референт- Вирус-
п/п мерений штамм ный штамм ный
«ПТК-45/86 «8Б-4» изолят
вируса вируса «ЛД-9»
ПГ-3 ПГ-3
1 Инфекционная актив- ТЦД 50/мл 6,75 7.25 6,25
ность на культуре клеток
2 Чувствительность к 5- ТЦД 50/мл 6,5 7,0 6,0
БДУ
3 Резистентность к эфиру ТЦД 50/мл 0 0 0
4 Резистентность к хлоро- ТЦД 50/мл 0 0 0
форму
5 Инактивация при минута 25 30 25
Т +560
6 Чувствительность:
к рН 8,0; ТЦД 50/мл 6,5 7,0 6,0
к рН 5,0; 5,0 5,5 4,5
к рН 3,0 1,0 1,5 0,5
7 Способность агглютини-
ровать эритроциты:
кр. рог. скота; Титр в РГА
барана; 1:8 1:16 1:8
кролика; 1:2 1:4 1:2
морской свинки 1:2 1:4 1:2
1:16 1:32 1:8
8 Способность адсорбиро-
вать эритроциты:
кр. рог. скота; Визуальная +++ +++ +++
барана; оценка(+) ++ ++ +
кролика; + ++ +
морской свинки ++++ ++++ ++++
С целью изучения чувствительности изолята вируса к эфиру, вируссодер-жащей культуральной жидкости добавляли
эфир до 20 % концентрации. Флаконы плотно укупоривали пробками и помещали в холодильник при 4+7 0С на 18-20 часов,
периодический перемешивая исследуемые материалы. Затем резиновые пробки заменяли ватными, и флаконы оставляли в холодильнике до полного испарения эфира. После этого проводили титрацию на культуре клеток опытных и контрольных образцов вирусного материала. Снижение инфекционного титра вируса на 1,0 lg ТЦД 50/мл и более свидетельствовало о его чувствительности к эфиру. Устойчивость вирусного изолята к хлороформу определяли по методу Mayr A., Bogel K. (З. Ляр-ский, 1980). Для этого исследуемый материал смешивали с 10 % объема хлороформа и встряхивали при помощи Шюттель-аппарата в течение 1 часа при 4 0С, после чего смесь оставляли при той же температуре до следующего дня. Затем опытный материал центрифугировали при 2000 об/мин, в течение 30 минут. Образовавшуюся надосадочную жидкость титровали на культуре клеток в сравнении с необработанным вирусным материалом. Степень устойчивости вируса к хлороформу оценивали по изменению инфекционного титра в lg ТЦД 50/мл.
Результаты исследований. Результаты исследований биологических и физико-химических свойств вирусного изолята представлены в таблице 1. Дальнейшую идентификацию изолята осуществляли путем изучения его физико-химических свойств в сравнении с вакцинным и референтным штаммами вируса парагриппа-3. Так при определении резистентности вирусов к эфиру и хлороформу установлено, что после обработки препаратами штаммы полностью инактивировались. С целью изучения термостабильности изолята «ЛД-9» вирусный материал выдерживали при Т 56 0С. В результате проведенных исследований установлено, что все 3 штамма инактивируются при данной температуре в течение 25-30 минут. В опытах по определению устойчивости вирусного изолята к различным параметрам рН установлено, что в щелочной среде вирус сохраняется лучше, чем в кислой.
Заключение. Таким образом, проведенные нами опыты по идентификации выделенного вирусного агента «ЛД-9» на основании изучения отдельных биологиче-
ских и физико-химических свойств показали его идентичность с референтным и вакцинным штаммами вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Глотов, А.Г. Распространение болезней телят вирусно-бактериальной этиологии / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова // РАСХН. Сиб. отд-ние ГНУ ИЭВСиДВ. -Новосибирск, 2008. - № 3. - 256 с.
2. Гумеров, В.Г. Эпизоотологиче-ский и серологический мониторинг смешанных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота / В.Г. Гуме-ров [и др.] // Ученые записки КГАВМ. -2019. - Т. 237(1). - С. 56-60.
3. Лисицын, В.В. Проблемы респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота и пути их решения / В.В. Лисицын // Ветеринария с/х животных. -2010. - № 5. - С. 12-16.
4. Юров, К.П. Этиология, диагностика и профилактика массовых респираторных болезней телят / К.П. Юров [и др.] // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных. Материалы конференции. - Москва. - 2006. -
C. 128-132.
5. Maidana, S. Isolation and characterization of bovine parainfluenza virus type 3from water buffaloes (Bubalus bubalis) in Argentina / S. Maidana [et all.] // BMCVeterinary Research. - 2012. - V. 8(83) - P. 1-9.
6. Horwood, P.F. Identification of two distinct bovine parainfluenza virus type 3 genotypes / P.F. Horwood, J.L. Gravel, T.J. Mahony // J Gen Virol. - 2008. - V. 89:1643. P. 8.
7. Intisar, K.S. Isolation of some respiratory viruses from camels / K.S. Intisar [et al.] // Int. J. Livest Prod. - 2014. - 5:177. - P. 81.
8. Stevenson, R.G. Comparative pathology of lambs and calves infected with parainfluenza virus type 3 / R.G. Stevenson,
D.E. Hore // J. Comp Pathol. - 1970. -80:613. - P. 8.
9. Ben-Ishai, Z., Naftali V, Avram A, Yatziv S. Human infection by a bovine strain of parainfluenza virus type 3. / Z. Ben-Ishai [et al.] // J. Med Virol. - 1980. - 6:165. P. 8.
10. Snowder, G.D. Bovine respiratory netic, and economic factors / G.D. Snowder disease in feedlot cattle: environmental, ge- [et al.] / J. Anim Sci. - 2006. - 84:1999-2008.
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТА ВИРУСА ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Гериш Ашуак, Гумеров В.Г., Галиуллин А.К., Каримуллина И.Г.
Резюме
В данной статье представлены результаты изучения биологических и физико-химических свойств изолята вируса парагриппа-3 (111 -3) крупного рогатого скота. Установлено, что после обработки препаратом 5-БДУ всех 3-х испытуемых штаммов выявлено лишь незначительное (на 0,25 lg) снижение инфекционной активности. Данное обстоятельство свидетельствовало о том, что все они являются РНК-содержащими вирусами.
При постановке реакции гемагглютинации изолят вируса также как референтный и вакцинный штаммы ПГ-3 агглютинировал эритроциты морской свинки и КРС в титре 1:8, а также 1:2 эритроциты барана и кролика. Аналогичные результаты были получены и в реакции гемадсорбции. Все испытуемые штаммы вируса диффузно адсорбировали эритроциты вышеперечисленных животных.
При изучение физико-химических свойств изолята «ЛД-9» установлено, что он также как и референтный и вакцинный штаммы вируса ПГ-3 КРС чувствителен к воздействию эфира, хлороформа, Т +56 0С, рН 5,0 и 3,0.
STUDY OF THE BIOLOGICAL, PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES OF THE ISOLATE OF VIRUS PARAGRIP-3 CATTLE
Gueriche Achouak, Galiullin A.K., Gumerov V.G., Karimullina I.G.,
Summary
This article presents the results of a study of the biological and physicochemical properties of bovine parainfluenza-3 virus (PG-3) isolate. It was found that after treatment with the 5-BDU preparation of all 3 tested strains, only a slight (0,25 lg) decrease in infectious activity was revealed. This circumstance testified to the fact that they are all RNA-containing viruses. When setting the hemagglutination reaction, the virus isolate as well as the reference and vaccine strains PG-3 agglutinated erythrocytes of guinea pig and cattle in a titer of 1: 8, as well as 1: 2 sheep and rabbit erythrocytes. Similar results were obtained in the hemadsorption reaction. All test strains of the virus diffusely adsorbed red blood cells of the above animals.
When studying the physicochemical properties of the LD-9 isolate, it was found that it, as well as the reference and vaccine strains of the PG-3 cattle virus, is sensitive to the effects of ether, chloroform, T +560 C, pH 5.0 and 3.0.
