CC BY
30ЕГЕПШАРНЫЙ
Врач
ispolzovaniya vozbuditeley infektsionnyh zabolevaniy cheloveka i zhivotnyh (za isklucheniyem sluchaya, yesli ukazannaya deyatelnost osuschestvlyayetsya v meditsinskih tselyah) i genno-inzhenerno-modifitsirovannyh organizmov III i IV stepeney potentsialnoy opasnosti, osuschestvlyayemoy v zamknutyh sistemah" [On licensing of activity related with using human and animal infection agents (except the cases when the work is carried out for medical purposes) and genetically engineered and modified organisms of 3rd and 4th levels of potential hazard in closed systems] / Rossiyskaya gazeta. - 2012. - April 24th . - 10 p.
7. "О sanitarno-epidemiologicheskom blagopoluchii naseleniya ["On sanitation and epidemiological health"] Federal law № 52-FZ of 30.03.1999 // httpy/Право-мед.ру: information portal. - 13 p.
8. Federal Service for Supervision of Consumers Protection and Welfare, Order N 775 of July 18th, 2012 "Ob utverzhdenii Administrativnogo reglamenta Federalnoy sluzhbe po nadzoru v sfere zaschity prav potrebiteley i blagopoluchiya cheloveka po predostavleniyu gosudarstvennoy uslugi po vydachi na osnovanii rezultatov sanitarno-epidemiologicheskih ekspertiz, rassledovaniy, obsledovaniy, issledovaniy, ispytaniy i inyh vidov otsenok, oformlennyh v ustanovlennom poryadke, sanitarno-epidemiologicheskih zaklucheniy" [On establishing an Administrative regulations for Federal Service for Supervision of Consumers Protection and Welfare on providing public services in issuance of sanitation and epidemiological resolution for duly performed and submitted sanitation and epidemiological expertise, investigations, research, examinations, experiments and other kinds of evaluations" // Rossiyskaya gazeta. - 2012. - October, 3rd . - 65 p.
9. «Poryadok ucheta, hraneniya, peredachi, i transportirovaniya mikroorganizmov I-IV grupp patogennosti» [A regulation on registration, storage, transfer, and transportation of microorganisms of I-IV groups of hazard]: Sanitation rules. SP 1.2.03695 // Best pravo: information and law portal. - 35 p.
10. «Ob utverzhdenii perechney vrednyh i (ili) opasnyh proizvodstvennyh factorov i rabot, pri vypolnenii kotoryh provodyatsya predvaritelniye i periodicheskiye meditsinskiye osmotry (obsledovaniya), i poryadka provedeniya predvaritelnyh i periodicheskih meditsinskih osmotrov (obsledovaniy) rabotnikov, zanyatyh na tyazhelyh rabotah i na rabotah s vrednymi i (ili) opasnymi uloviyami truda [On approving the list of hazardous or dangerous industrial factors and works demanding preliminary and periodical medical examination and Regulations of carrying out preliminary and periodical medical examination of the staff employed in heavy works or works in hazardous and /or dangerous conditions] The Russian Federation Ministry of Public Health and Social Development, Order №302н of 12th April, 2011. // Rossiyskaya gazeta. -2011. - October, 28th . - 2 p.
11. «Postroyeniye sistemy fizicheskoy zaschity gosudarstvennyh i issledovatelskih kollektsiy mikroorganizmov I-II grupp patogennosti» [developing the system of physical defense of state and investigation collection of microorganisms of I-II groups of pathogenicity]: methodical guideline МУК 3.1.2964-11 // Kodeks tehekspert: a group of companies "Informatsiya buduschego". - 13 p.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ИЗ ВАКЦИННОГО ШТАММА «ТК-А/К»
Н.И.Закутский - доктор ветеринарных наук, зав.сектором биотехнологии вакцин;
В.М.Балышев - доктор ветеринарных наук, гл.научный сотрудник; А.В.Луницин - кандидат ветеринарных наук, замдиректора; А.Г.Гузалова - кандидат биологических наук, завотделом;
С.Г.Юрков - доктор биологических наук, гл.научный сотрудник.
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» РАСХН (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии) (601125, Владимирская обл., Петушинский р-н., пос.Вольгинский, ул.Академика Бакулова, стр.1,е-таН:ШНЧЧМ@ту.реХивЬ.е1сот.ги).
Статья посвящена изучению эффективности инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахе-ита крупного рогатого скота, изготовленной на основе вакцинного штамма «ТК-А/К». Материалы и методы. В работе использовали вакцинный штамм «ТК-А/К» вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТКРС) лиофилизированный культуральный с инфекционной активностью 6,5-7,0 lg ТЦД50/см3; монослой-ную перевиваемую культуру клеток почки теленка (МDВК), выращенную в 3-литровых стеклянных бутылях рол-лерным методом, матрасах объемом 250 см3 и в пробирках в среде Игла МЕМ с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота. Инфекционную активность вируссодержащего материала определяли титрованием в культуре клеток МDВК по общепринятой методике. Полноту инактивации теотропином вируссодержащего материала -трехкратным пассированием в культуре клеток МDВК Безвредность инактивированной вакцины против ИРТ КРС из штамма «ТК-А/К» - на взрослых белых мышах. Антигенные и иммуногенные свойства штамма - по титру вируснейтрализующих антител (ВН-Ат). Инфекционную, антигенную и иммуногенную активность лиофилизиро-
УДК 619: 851.371
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫМ ЖУРНАЛ
№ 2/2016
ванного штамма «ТК-А/К» изучали через каждые 3 года хранения при минус 400С, а сохраняемость концентра-трированного вируссодержащего материала - через каждые 6 мес в течение 3 лет. Результаты исследований. Клонированием и селекцией из аттенуированного штамма «ТК-А» получен вакцинный штамм «ТК-А/К» вируса ИРТ КРС, отличающийся от исходного штамма более высокой иммунобиологической активностью. Показано, что полученный штамм на уровне 6-20 пассажей обладал высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью. Штамм на уровне 6 пассажа был лиофилизирован с активностью 6,5-7,01д ТЦД5/мл, прошел комиссионные испытания, охарактеризован в соответствии с требованиями МЭБ к вакцинным штаммам, паспортизирован и депонирован в коллекции микроорганизмов ВГБУ «ВГНКИ» с авторским наименованием «ТК-А/К». Этот штамм использован для производства коммерческой инактивированной вакцины против ИРТ КРС. Данный препарат после двукратной иммунизации в объемной дозе 2,0 мл с интервалом 14 дней индуцировал у телят и кроликов формирование ВН-антител в высоких титрах (1:16-1:64). Изготовленные коммерческие серии инактивированной вакцины против ИРТ КРС из этого штамма применяли для профилактики в различных регионах РФ, а также в Республике Беларусь. На штамм «ТК-А/К получен патент на изобретение (№ 2279474). Данный штамм стабилен при длительном хранении: высоконцентрированный вирус (концентрат антигена) при температуре минус 600С в течение 3 лет и в лиофилизированном состоянии при минус 400С в течение 9 лет сохранил свои исходные инфекционные и антигенные (иммуногенные) свойства. Заключение. Таким образом, получен клонированием и селекцией вакцинный штамм «ТК-А/К» на основе которого разработана эффективная инакти-вированная вакцина против ИРТ КРС, обеспечивающая защиту животных от вирулентного вируса. Коммерческие серии инактивированной вакцины против ИРТ КРС из штамма «ТК-А/К» применяли с положительными результатами в различных регионах РФ, а также в Республике Беларусь.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус ИРТ КРС, штамм «ТК-А/К», инфекционная антигенная, иммуногенная активность, стабильность, инактивированная вакцина.
Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ КрС) - остро протекающая контагиозная болезнь КРС вирусной этиологии. Вирус ИРТ КРС относится к семейству Негреву1г1Ьае,пора-жает респираторный (ринотрахеит), генитальный (пустулезный вульвовагинит, баланопостит) тракты, нервную систему (энцефаломиелит), слизистые оболочки и глазное яблоко у телят (конъюнктивит и кера-токонъюнктивит). Болезнь широко распространена во всем мире. Экономический ущерб, наносимый ИРТ КРС складывается из сниженияудоя в период болезни (до 50-60%), абортов, увеличения сервис-периода и яловости переболевших вагинальной формой коров со снижением выхода от них телят (5-10%), слабого развития инфицированного молодняка (50-70%) и значительного увеличения процента их гибели и выбраковки (20%) [1,2,3]. Возбудитель длительное время может персистировать в организме животных, вызывая при неблагоприятных условиях осложнения вторичной инфекцией у животных.
В комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с ИРТ КРС, ведущее место занимает вакцинопрофилактика. В ветеринарной практике применяют как живые, так и инактивированные вакцины, полученные на основе вируса, выращенного в различных культурах клеток [4,5,6]. Для этих целей в РФ используют вакцинные штаммы «ТК-А (ВИЭВ) - В 2» [7], «ТК-А» [8] и др., и вирулентные штаммы «4016» [9], "Щапово" [10], "ВНИИЗЖ" [11] и др. Вакцинные штаммы вируса ИРТ КРС после иммунизации остаются в организме в латентном состоянии и в отдельных случаях могут вызывать осложнения на иммунном фоне у ослабленных животных. Осложнения также могут произойти вследствие рекомбинации
вакцинного вируса с полевыми изолятами и его реактивации, обусловленной различными факторами, в том числе стрессами и инфицированием животных возбудителями других болезней [2,3,5]. Поэтому живые вакцины целесообразно применять в неблагополучных по ИРТ КРС хозяйствах или угрожаемых-зонах, главным образом на крупных предприятиях по откорму скота [2,3,5,6]. Так, в США, где болезнь весьма широко распространена, используют атте-нуированный штамм Я1_В - 106 вируса ИРТ КРС при производстве живых моно- и поливалентных вакцин, которые применяют интраназально для быстрого создания местного популяционного иммунитета в неблагополучных зонах с большим количеством поголовья [12,13]. Однако необходимо иметь в виду, что используемая при изготовлении живых вакцин сыворотка КРС может содержать контаминанты - вирусы и микоплазмы, которые отрицательно влияют на формирование иммунного ответа у привитых животных. В связи с вышеизложенным, в нашей стране в последние годы в ветеринарной практике для профилактики ИРТ КРС предпочтение отдается инактивированным вакцинам (2,3,4,5,6). В процессе изготовления инак-тивированных вакцин против ИРТ КРС из вирулентных штаммов, существует вероятность неполной инактивации вирусного сырья, что может привести к возникновению вспышек болезни. Поэтому в молочном животноводстве и на станциях искусственного осеменения, а также в благополучных по ИРТ КРС откормочных хозяйствах рекомендуется использование инактивированных вакцин, изготовленных на основе аттенуированных штаммов (2,3,5, 6).
Выращенные в чувствительных клеточных системах вакцинные штаммы вируса ИРТ КРС нередко
имеют относительно невысокий уровень антигеннои активности, что не позволяет получать необходимое количество антигена в прививной дозе и требует проведение предварительного концентрирования вирусного сырья [2,14].
Целью настоящей работы явилось изучение эффективности инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, изготовленнойна основе полученного клонированием и селекцией вакцинного штамма «ТК-А/К».
Материалы и методы. В работе использовали вакцинный штамм «ТК-А/К» вируса ИРТ КРС ли-офилизированный культуральный с инфекционной активностью 6,5-7,0 lg ТЦД50/см3; монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (МЭВК), выращенную в 3-литровых стеклянных бутылях роллерным методом, матрасах объемом 250 см3 и в пробирках в среде Игла МЕМ с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота. Инфекционную активность вируссодержащего материала определяли титрованием в культуре клеток МЭВК по общепринятой методике. Полноту инактивации теотропином вируссодержащего материала проверяли трехкратным пассированием в культуре клеток МЭВК. Безвредность инактивированной вакцины против ИРТ КРС из штамма «ТК-А/К» проверяли на взрослых белых мышах. Антигенные и иммуногенные свойства штамма на различных уровнях пассажей в культуре клеток МЭВК соответственно, оценивали по титру вируснейтрализующих антител (ВН-Ат) у привитых инактивированной вакциной против ИРТ КРС взрослых кроликов и телят 3-4 мес возраста, свободных от специфических ВН-антител (доза вируса в РН - 1000 ТЦД50/см3). Инфекционную, антигенную и имму-ногенную активность лиофилизированного штамма «ТК-А/К» изучали через каждые 3 года хранения при минус 40 0С, а сохраняемость концентратрирован-ного вируссодержащего материала - через каждые 6 мес. в течение 3 лет.
Результаты исследований. Путем клонирования и селекции из штамма «ТК-А» в культуре клеток МЭВК на уровне 6 пассажа был получен вариант вируса ИРТ КРС со стабильными культуральными характеристиками, инфекционная активность его на 2-3 сутки культивирования достигала 7,5-8,0 lg ТЦД50/ см3, что на 0,5-1,0 lg ТЦД50/см3 было выше, чем у исходного штамма. В процессе проведения последовательных пассажей клонированного вируса в перевиваемой культуре клеток МЭВК было установлено, что в течение 20 пассажей он сохранял свои исходные характеристики. При оценке иммуногенности вакцинных препаратов, приготовленных из этого вируса ИРТ КРС на уровне 10 и 20 пассажей различий не выявлено. После двукратной иммунизации телят с интервалом 14 сут титры ВН-антител составляли 1:32-1:64 (с 1000 ТЦД50/см3 вируса в РН).
Клонированный вирус ИРТ КРС на уровне 6 пас-
сажа с активностью 7,5-8,0 1д ТЦД50/см3 прошел контроль в ОБТК института с положительными результатами по основным показателям (биологическая, антигенная и иммуногенная активность, безвредность и стерильность) и был лиофилизирован с инфекционной активностью 6,5-7,0 1д ТЦД50/см3. Данный вирус испытан в соответствии с требованиями МЭБ, предъявляемым к вакцинным штаммам и был депонирован в ФГБУ «ВГНКИ» с авторским названием «ТК-А/К», на штамм получен патент на изобретение (И 2279474). При оценке на иммуногенность лиофилизи-рованный штамм «ТК-А/К» (с активностью 6,5±0,12 1д ТЦД50/см3) после двукратной иммунизации с интервалом 14 сут индуцировал накопление ВН-антител в сыворотках крови телят в титрах 1:16-1:32. В течение 9 лет при температуре минус 40 0С этот штамм сохранял на исходном уровне инфекционную активность, антигенность и иммуногенность.
Лиофилизированный штамм «ТК-А/К» был использован при изготовлении инактивированной вакцины против ИРТ КРС. С этой целью получали роллерным методом в культуре клеток МЭВК вирусное сырье с активностью не менее 7,5-8,0 1д ТЦД50/см3. Инак-тивированную вакцину против ИРТ КРС готовили по разработанной технологии, включающей следующие основные этапы: получение культуры клеток МЭВК, выращивание вируса ИРТ КРС в монослое этих клеток роллерным методом; инактивацию вируса теотропином и контроль полноты инактивации; приготовление вакцинного препарата и контроль вакцины. Препарат проверялив ОБТК института на отсутствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой, полноту инактивациивируса, безвредность, антиген-ность и иммуногенность. Вакцина была не контами-нирована, авирулентна и безвредна. При введении белым взрослым мышам подкожно в область спины по 0,5 см3 вакцины животные в течение 10 дней наблюдения оставались живыми.
Учитывая, что коэффициент корреляции между уровнями ВН-антител в сыворотках привитых кроликов и телят составлял 0,85-0,90 [2] оценку антигенной активности инактивированной вакцины проводили на кроликах. С этой целью четырем кроликам внутримышечно в область бедра вводили по 1,0 см3 двукратно с интервалом 14 сут инактивированного препарата. Через 14 сут после повторной иммунизации у животных отбирали пробы крови, полученную сыворотку исследовали на наличие ВН-антител к вирусу иРт КРС. Серию вакцины считали прошедшей контроль по антигенной активности, если титр ВН-антител к вирусу ИРТ КРС был не ниже 1:8-1:16 (минимальный защитный уровень - 1:4) [2,15]. Приведенные в таблице 1 результаты исследований, свидетельствуют о высокой антигенной активности инактивированной вакцины из штамма «ТК-А/К» вируса ИРТ КРС. После второй прививки уровень ВН-антител у кроликов составлял не менее 1:32.
10
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 2/2016
Таблица 1
Уровень ВН-антител в сыворотках крови кроликов, привитых инактивированной ГОА-сапониновой вакциной против ИРТ КРС из штамма "ТК-А/К"
Кролик Титр антител в сыворотке крови кроликов через 14 сут после инъекции
до введения после 1-й инъекции после 2-й инъекции
1 0 1:8-1:16 1:32-1:64
2 0 1:8-1:16 1:32-1:64
3 0 1:8 1:32
4 0 1:8 1:32
Результаты изучения иммуногенной активности инактивированной ГОА-сапониновой вакцины против ИРТ КРС на телятах приведены в таблице 2. Установлено, что у телят, привитых подкожно в объемной
дозе 2,0 см3, уже на 14 день после первого введения препарата формировался иммунный ответ, обеспечивающий образование гуморальных антител в защитных титрах.
Таблица 2
Уровень ВН-антител в сыворотках крови телят, привитых инактивированной ГОА-сапониновойвакциной
против ИРТ КРС из штамма «ТК-А/К»
Титры ВН-Ату привитых животных
Животное до вакцинации через 14 сут после 1-й прививки через 14 сут после 2-й прививки
1 0 1:8 1:32
2 1:2-1:4 1:8 1:32
3 0 1:8-1:16 1:32-1:64
4 0 1:8 1:32
5 1:2 1:8 1:32
6 0 1:8-1:16 1:32-1:64
7 0 1:8 1:32
8 1:2-1:4 1:16 1:32-1:64
9 0 1:8 1:32
10 1:2 1:16 1:32-1:64
11 1:2 1:2 1:2
12 0 0 0
Примечание: 1-10 привитые телята;. 2)11 и 12 - контрольные телята (не привитые).
После повторной прививки у животных отмечали четырехкратный прирост ВН-антител (1:32-1:64), что свидеде-тельствует о высокой иммуногенности препарата, приготовленного на основе штамма «ТК-А/К» вируса ИРТ КРС.
Таким образом, по перечисленным показателям инактивированная вакцина против ИРТ КРС, изготовленная из штамма «ТК-А/К», соответствовала требованиям, предъявляемым МЭБ к таким препаратам. Коммерческие серии инактивированной вакцины против ИРТ КРС, изготовленные из этого штамма применяли для профилактики в различных регионах РФ, а также в Республике Беларусь.
Учитывая, что вируссодержащие культуральные материалы в концентрированном состоянии при от-
рицательных температурах длительно сохраняют свои исходные свойства [2,14], а также возможность их использования для экспресс изготовления вакцинных препаратов, на основе штамма «ТК-А/К» были изготовлены образцы высококонцентрированного вируса, выращенного в культуре клеток мбВК. Полученный вакцинный вирус концентрировали полиэтиленгликолем (м.в. 6000) с последующим центрифугированием в 200 раз по объему для приготовления высококонцентрированного антигена, представляющего собой сиропообразную массу. Образцы концентрированного вирус-содержащего материала в течение 3 лет сохраняли при температуре минус 600С инфекционность на исходном уровне и были использованы для изготовлении ГО-
А-сапониновой инактивированной вакцины против ИРТ КРС. С этой целью концентрат вируса разбавляли средой до исходного объема, тщательно перемешивали, инактивировали теотропином, а в качестве адъюван-та добавляли ГОА и раствор сапонина в необходимом количестве. Для контроля образцы вакцины готовили из свежеприготовленного культурального вируса с активностью 7,5±0,15 1д ТЦД50/см3. Вакцину, полученную из разбавленного до исходного объема концентрата вируса, вводили внутримышечно 4 кроликам по 1,0 мл двукратно с интервалом 14 дней. Через 2 недели после повторной прививки исследовали сыворотку крови у животных на наличие ВН-антител. Приготовленная, на основе хранившегося при минус 600С в течение 3 лет концентрата, инактивированная вакцина обладала такой же антигенной активностью, что и инактивирован-ный препарат, полученный из свежеприготовленного вирусного сырья. Инактивированные вакцинные препараты при двукратном введении с интервалом 14 дней индуцировали образование у кроликов высокий уровень ВН-антител (1:16). Полученные данные свидетельствуют, что высококонцентрированный культуральный вируссодержащий материал, полученный на основе штамма «ТК-А/К» и хранившийся при минус 600С в те-
Литература
чение 3 лет может быть использован для экспресс изготовления инактивированной вакцины против ИРТ КРС.
Заключение. Получен клонированием и селекцией вакцинный штамм «ТК-А/К» вируса ИРТ КРС, обладающий более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, чем исходный штамм. Штамм «ТК-А/К» паспортизирован и депонирован в коллекции микроорганизмов ФГБУ «ВГНКИ». Данный штамм стабилен при длительном хранении: высо-концентрированный вирус (концентрат антигена) при температуре минус 600С в течение 3 лет и в лиофили-зированном состоянии при минус 400С в течение 9 лет сохранил исходные инфекционные и антигенные (им-муногенные) свойства.
На основе штамма «ТК-А/К» разработана эффективная инактивированная вакцина против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, обеспечивающая при двукратном введении телятам в дозе 2,0 мл с интервалом 14 дней высокий уровень накопления ВН-антител (1:32-1:64). Изготовленные коммерческие серии инактивированной вакцины против ИРТ КРС из штамма «ТК-А/К» применяли с положительными результатами в различных регионах РФ, а также в Республике Беларусь.
1. Юров, К.П. Герпесвирусы возбудителей массовых заболеваний крупного рогатого скота / К.П.Юров, А.Ф.Шуляк // Ветеринария. - 1998. - № 11. - С. 10-12.
2. Закутский, Н.И. Разработка и совершенствование инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахе-ита крупного рогатого скота: дис. ... д-ра вет. наук / Н.И.Закутский. - Покров, 1998. - 311 л.
3. Герпесвирусные болезни животных / Н.И.Закутский, И.Ю.Хухоров, Н.А.Лагуткин. - Владимир: Фолиант, 2003. -282 с.
4. Сывороточные и вакцинные препараты для профилактики и терапии инфекционных заболеваний животных / Е.В. Сусский [и др.]. - Армавир: Мир, 2013. - 238 с.
5. Штрауб, О.Х. Инфекции КРС, вызываемые вирусами герпеса / О.Х.Штрауб. - М.: Колос, 1981. - 207 с.
6. Проблема борьбы и профилактики инфекционного ринотрахеита - инфекционного пустулезного вульвовагинита крупного рогатого скота / Мищенко В.А. [и др.]. - Ветеринария Кубани. - 2012. - № 6. - С. 3-5.
7. А.с. 1789219 СССР, МПК5 А 61 К 39/118. Вакцина для профилактики респираторных заболеваний крупного рогатого скота / К.П.Юров, Ю.Д.Караваев, З.Ф.Зудилина [и др.] (СССР). - №4804352; заявлено 09.02.90; опубл. 21.03.93.
8. Пат. 2090210 РФ, МПК6 А 61 К 39/265, С 12 N 5/06, 7/00. Способ изготовления инактивированной культуральной вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота / Н.И.Закутский, В.И.Жестерев, И.Ф.Вишняков, С.Г.Юрков. - № 93056756/13; заявлено 21.12.1993; опубл. 20.09.97.
9. Пат. 2059415 РФ, МПК6 А 61 К 39/265.Инактивированная вакцина против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота / К.П.Юров, П.Н.Щербаков, А.С.Вечеркин, А.Ф.Шуляк. - № 9201 1555/13; заявлено 1 1.12.1992; опубл. 10.05.96.
10. Пат. 2221040 РФ, МПК7 А 61 К 39/265, С 12 N 7/00.Штамм "ВНИИЗЖ" вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота для изготовления вакцинных и диагностических препаратов / В.А.Мищенко, А.А.Гусев, О.И.Гет-манский, Н.В.Коропова, Ю.Е.Ручнов, Ю.А.Костыркин. - № 20021 17391/13; заявлено 28.06.2002; опубл. 10.01.2004.
11. Vaccination with a modified-live bovine viral diarrhea virus (BVDV) type 1a vaccine completely protected calves against challenge with BVDV type 1b strains / Wenzhi Xue [et al.] // Intervet Schering Plough Animal Health. - USA: Vaccine, 2010. - Р. 70-6.
12. Systematic review and meta-analysis of the effectiveness of commercially available vaccines against bovine herpes virus, bovine viral diarrhea virus, bovine respiratory syncytial virus, and parainfluenza type 3 virus for mitigation of bovine respiratory disease complex in cattle / E.Miles [et al.] // Journal of the American Veterinary Medical Association. - 2015. - Vol. 246, № 1. - P 126-142.
13. Гринин, А.С. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных / А.С.Гринин, И.Н.Титов. - М.: Колос, 1971. - 240 с.
14. Справочник по болезням с/х животных. - М.: Урожай, 1990. - 352 с.
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 2/2016
12
EFFICACY OF INACTIVATED VACCINE BASED ON "TK-A/K" STRAIN AGAINST INFECTIOUS BOVINE RHINOTRACHEITIS
ZakutskyN.I. - Doctor of Veterinary Medicine; Balyshev V.M. - Doctor of Veterinary Medicine;
Lunitsin A.V. - Candidate of Veterinary Science; Guzalova A.G. - Candidate of Biological Science;
Jurkov S.G. - Doctor of Biology.
Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology of Russia, SSI NRIVVaMR of RRAC
(tel. +7(4922)379251, e-mail: [email protected]).
The work was aimed at analysis of potency of an inactivated vaccine prepared from a strain"TK-A/K" against infectious bovine rhinotracheitis (IBR). Materials and methods: in this work, we used a freeze-dried culture IBR virus vaccine strain "TK-A/K" with an infectious activity level of 6.5 to 7.0 Ig TCID50/cm3; a monolayer continuous bovine kidney cell culture (MDBK) grown in 3-liter glass bottles using a roller method, in flasks of250 cm3, and/or tubes in Dulbecco MEM supplemented with 10% bovine blood serum. The infectious activity level of the virus-containing material was determined by titration in cell culture MDVK using standard methods. The completeness of teotropin inactivation of the virus-containing material was examined through a triple passage in MDBK cells. The IBR "TK-A/K" strain inactivated vaccine was tested for innocuity in adult white mice. The antigenic and immunogenic features of the strain were determined by reference to virus-neutralizing antibodytiters. Results: the freeze-dried strain "TK-A/K" infectious, antigenic and immunogenic activity levels were examined every 3 years of storage at -400C, and the storability of the concentrated virus-containing material was examined every 6 months within 3 years. Using some cloning and selection techniques, from an attenuated strain "TK-A/K" we obtained the IBR virus vaccine strain "TK-A/K" that differed from the original strain in its higher immunobiological activity. The derived strain was shown to be sustainable at passages 6 to 20 for it showed high infectious, antigenic and immunogenic activity levels. The strain was freeze-dried at passage 6 and exhibited biological activity levels of 6.5 to 7.0 lg TCD50/ml, successfully passed the commissioning tests, is characterized in compliance with OIErequirements for vaccine strains, certified, and deposited in the collection of microorganisms of the All-Russian State Research Institute of Control, Standardization, and Certification of Veterinary Preparations (VGNKI) with its authorial denomination of "TK-A/K". The above strain is used for production of a commercial inactivated vaccine against IBR. The preparation induced virus-neutralizing antibody formation at high titers of 1:16 to 1:64 in calves after a double immunization at a doze of 2.0 ml with a 14-day interval. The commercial series of the inactivated vaccine prepared from this strain were used for prophylaxis purposes in a number of regions of the Russian Federation and the Republic of Belarus. For strain "TK-A/K", an invention patent No 2279474 was issued. This strain remains sustainable during prolonged storage periods; thus, when stored in its high-concentrated form (the antigen concentrate) for 3 years at -600C, or in a freeze-dried form for 9 years at -400C, the virus kept its original infectious and antigenic (i.e., immunogenic) properties. Conclusion: thus, through cloning and selection approaches, we obtained the vaccine strain "TC-A/K" that was used to develop an effective inactivated anti-IBR vaccine that provided animal protection from virulent viruses. Commercial series of the inactivated anti-IBR vaccine prepared from strain "TC-A/K" were used in various regions of the Russian Federation and the Republic of Belarus, and gave positive results.
KEYWORDS: IBR virus, strain "TC-A/K", infectious antigenic and immunogenic activity, sustainability, inactivated vaccine.
References
1. Yurov, K.P. Gerpesvirusy vozbuditeley massovykh zabolevaniy krupnogo rogatogo skota [Herpesviruses causing mass diseases in cattle herds] / K.P.Yurov and A.FShulyak // Veterinariya. - 1998. - Vol.11. - P. 10-12.
2. Zakutskiy, N.I. Razrabotka i sovershenstvovanie inaktivirovannoy vaktsiny protiv infektsionnogo rinotrakheita krupnogo rogatogo skota [Development and improvement of inactivated vaccine against infectious bovine rhinotracheitis]: Doctoral Dissertation in Veterinary/ N.I.Zakutsky. - Pokrov, 1998. - 31 1p.
3. Gerpesvirusnye bolezni zhivotnykh [Animal diseases caused by Herpesvirus] /N.I.Zakutskiy, I.Yu.Huhorov, N.A. Lagutkin. - Vladimir: «Foliant», 2003. - 282 p.
4. Syvorotochnye i vaktsinnye preparaty dlya profilaktiki i terapii infektsionnykh zabolevaniy zhivotnykh [Serum and vaccine dtugs for prevention and treatment of animal infections] / E.V.Susskiy [et al.] - Armavir: Mir, 2013. - 238 p.
5. Infektsii KRS, vyzyvaemye virusami gerpesa [Cattle infections caused by herpes viruses] / O.Kh.Shtraub. - Moscow: kolos, 1981. - 207p.
6. Problema borby i profilaktiki infektsionnogo rinotraheita - infektsionnogo pustuleznogo vulvovaginita krupnogo rogatogo skota [The problem of control and prevention of infectious bovine rhinotracheitis - cattle infectious pustular vulvovaginitis] / Mishchenko V.A. [et al.] - Veterinariya Kubani. - 2012. - Vol.6.-P.3-5
7. A. s. №1789219 SSSR, IPC5 A 61 K 39/118 Vaktsina dlya profilaktiki respiratornyh zabolevaniy krupnogo rogatogo skota
ЕГЕПШАРНЫЙ
Врач
[Vaccine to prevent cattle respiratory diseases] / K.P.Yurov, YU.D.Karavaev, Z.FZudilina [et al.] (the USSR).-№4804352, applied on 09.02.90, published on 21.03.93.
8. Patent 2090210 RF IPC6 A 61 K 39/265, S 12 N 5/06, 7/00. Sposob izgotovleniya inaktivirovannoy kulturalnoy vaktsiny protiv infektsionnogo rinotraheita krupnogo rogatogo skota [The method of producing inactivated culture vaccine against infectious bovine rhinotracheitis] / N.I.Zakutskiy, V.I.Zhesterev, I.FVishnyakov, S.G.Yurkov - №.93056756/13, applied on 21.12.1993; published on 20.09.97.
9. Patent 2059415 RF, IPC6 A 61 K 39/265, Inaktivirovannaya vakcina protiv infekcionnogo rinotraheita krupnogo rogatogo skota [Inactivated vaccine against infectious bovine rhinotracheitis] / K.P.Yurov, P. N.Shcherbakov, A.S.Vecherkin, A.F.Shulyak - № 92011555/13, applied on 1 1.12.1992, published on 10.05.96.
10. Patent 2221040 RF IPC 7 A 61 K 39/265, S 12 N 7/00, Shtamm "VNIIZZH" virusa infektsionnogo rinotraheita krupnogo rogatogo skota dlya izgotovleniya vaktsinnyh i diagnosticheskih preparatov [Using the "ARRIAH" strain of infectious bovine rhinotracheitis for production of vaccine and diagnostic drugs ] / V.A.Mishchenko, A.A.Gusev, O.I.Getmansky, N.V.Koropova, YE.Ruchnov, YU.A.Kostyrkin - № 2002117391/13, applied on 28.06.2002., published on 10.01.2004.
11. Vaccination with a modified-live bovine viral diarrhea virus (BVDV) type 1a vaccine completely protected calves against challenge with BVDV type 1b strains /Wenzhi Xue// Intervet Schering Plough Animal Health, 35500 W 91st Street, De Soto, KS 66018, USA Vaccine 29:70-6. 2010
12. Systematic review and meta-analysis of the effectiveness of commercially available vaccines against bovine herpesvirus, bovine viral diarrhea virus, bovine respiratory syncytial virus, and parainfluenza type 3 virus for mitigation of bovine respiratory disease complex in cattle / E. Miles et al.// Journal of the American Veterinary Medical Association. 2015, Vol. 246, N1. -P. 126-142.
13.Grinin, A.S. Ochistka, kontsentrirovanie i fraktsionirovanie virusov zhivotnykh [Purification, concentration, and fractionation of animal viruses] /A.S.Grinin, I.N.Titov. - Moscow: Kolos, 1971. - 240p.
14.Spravochnik po boleznyam s/h zhivotnykh [A reference book on farm animal diseases]. - Moscow: Urozhay, 1990.-352p.
ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В СУХИХ ОБРАЗЦАХ СЫВОРОТКИ КРОВИ, ПОЛУЧЕННЫХ НА ПОРИСТЫХ МЕМБРАННЫХ НОСИТЕЛЯХ НОВОГО ФОРМАТА
1С.О.Белецкий - соискатель;1 И.Г.Каримуллина - кандидат биологических наук, ст.научный сотрудник;1А.Ф.Авзалова - кандидат ветеринарных наук, ст.научный сотрудник;
М.А.Ефимова - доктор биологических наук, завлабораторией; 1А.Н.Чернов - доктор биологических наук, замдиректора; 2Н.Ю.Саушкин - аспирант; 2Ж.В.Самсонова - кандидат химических наук, ст.научный сотрудник; 3А.П.Осипов - кандидат химических наук, ст.научный сотрудник; 2С.Э.Кондаков - доктор фармакологических наук, вед.научный сотрудник.
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, Казань, Научный городок-2, тел. +7(843) 239-53-20, e-mail: [email protected]).
Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, г.Москва (119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 11, тел.+7(495) 939-16-71,e-mail:[email protected]).
3нНациональный исследовательский технологический университет "МИСиС", г.Москва (119991, Москва, Ленинский проспект, д.6, тел. +7(499) 237-22-22, e-mail: [email protected]).
В животноводческих хозяйствах Российской Федерации, по данным отечественных авторов вирусами герпеса инфицировано от 17% до 43% животных. Важным этапом контроля и искоренения инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота является лабораторная диагностика путем выявления антител в сыворотках крови вакцинированных, инфицированных и переболевших животных, а также вирусного антигена.В случае отдаленного расположения специализированных лабораторий хранение и доставка большого количества отобранных для анализа жидких образцов может представлять определенную проблему. Отбор, транспортировка и анализ образцов биологических жидкостей в виде сухих пятен помогает решить эти проблемы минимальными средствами. Цель данной работы - изучить возможность применения технологии получения биологических жидкостей в виде сухих пятен на новом формате пористых мембранных носителей для пробоподготовки и анализа сывороток крови крупного рогатого скота при определении титра антител к вирусу инфекционного ринотрахеита. Материалы и методы. В работе использовали приготовленные стандартным методом сыворотки крови крупного рогатого скота и образцы сухих пятен сыворотки крови, нанесенные на опытные образцы карточек с мембранными носителями. Сыворотки крови в жидком виде и сухие образцы, элюированные с мембранного носителя карто-
УДК 619.616.98+543.544.943.3
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫМ ЖУРНАЛ
№ 2/2016
