CC BY
24
ПРАВОВЫЕ ОСНОВЫ АНАЛИЗА РИСКА В ВЕТЕРИНАРИИ
Орехов Д.А., Каштанова Д.В. Резюме
Наличие глобальных угроз и опасностей, рискогенности в современном обществе обуславливает необходимость использования методов оценки и управления рисками практически во всех сферах жизни. В работе предпринята попытка обобщения и анализа изменений в ветеринарном законодательстве России, опирающихся на подходы, включающие элементы риска. Проведен анализ нормативных правовых документов, содержащих обязательные требования в отношении введения процедур анализа и управления рисками при производстве продукции, определении зоосанитарного статуса хозяйств, проведении регионализации территории, в сфере государственного ветеринарного надзора (контроля).
LEGAL BASIS OF RISK ANALYSIS IN VETERINARY MEDICINE
Orekhov D.A., Kashtanova D.V. Summary
Global threats and dangers, as well as risk existence in modern society determine the necessity of using risk assessment methods and risk management in almost all spheres of life. In the paperwork an attempt to generalize and analyze changes in Russian veterinary legislation, based on approaches involving elements of risk, was made. The analysis of regulatory legal documents containing mandatory requirements for the imposition of risk analysis and management procedures in the production of products, determining the status of zoo-farms, regionalization of the territory, in the field of state veterinary supervision (control).
DOI 10.31588/2413-4201-1883-236-4-150-155 УДК:578.52; 577.113
АНАЛИЗ ГЕНОМОВ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ БИОПАТОГЕНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ОПТИМИЗАЦИЯ ЕДИНЫХ УСЛОВИЙ ПЦР
ДЛЯ ИХ ИНДИКАЦИИ
Осянин К.А. - к.б.н., Хаммадов Н.И. - к.б.н., Фахрутдинов Н.А. - студент, Фаизов Т.Х. - д.в.н., профессор, *Магдеева Э.А. - к.в.н.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» *ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: инфекционный ринотрахеит, парагрипп-3, вирусная диарея, геномика, ПЦР, КРС.
Key words: infectious rhinotracheitis, parainfluenza-3, viral diarrhea, genomics, PCR,
cattle.
Респираторные заболевания крупного рогатого скота - группа болезней, в которую входят: инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея-болезнь слизистых, парагрипп-3, аденовирусная, ротавирус-
ная, коронавирусная инфекции. Особенность респираторных заболеваний состоит в том, что они протекают в виде смешанных инфекций [1,2]. Инфекционный ринотрахеит-остропротекающая конта-
гиозная вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, общим угнетением, конъюнктивитом и, в основном, ката-рально-некротическим поражением респираторного тракта и генитальных путей. В зависимости от локализации вирус инфекционного ринотрахеита может вызывать аборт, конъюнктивит, энцефалит и поражения желудочно-кишечного тракта [3]. Вирусная диарея крупного рогатого скота -болезнь, характеризующаяся анорексией, диареей, прогрессирующим исхуданием, нередко с лихорадкой, респираторными расстройствами, хромотой, поражением глаз, язвенным воспалением пищеварительного тракта, язвенно-эрозивным стоматитом и ринитом [4]. Парагрипп-3 крупного рогатого скота (ПГ-3 КРС) (транспортная лихорадка крупного рогатого скота, параинфлюэнца-3) - остро протекающая контагиозная вирусная болезнь, главным образом телят, характеризующаяся лихорадкой, конъюнктивитом и катаральным воспалением верхних дыхательных путей, в тяжелых случаях с поражением легких [5].
Для подтверждения диагноза на эти инфекции используются специфические лабораторно-инструментальные методы исследования: выделение вирусов и токсинов (цитопатическое действие на культуру клеток); серологическая диагностика и по-лимеразная цепная реакция (ПЦР) или специфическая амплификация. Минусы при выделении вирусов на культуре клеток (низкая чувствительность, не всегда можно по цитопатическому действию (ЦПД) точно определить вид вируса, ЦПД может и не быть, большие трудности связаны с контаминацией культуры клеток другими биопатогенами и сапрофитными организмами) [6]. Минусы серологической диагностики (низкая чувствительность (РА, ПР, РСК), низкая специфичность (ИФА с цельным вирусным антигеном), не всегда есть возможность дифференциации вакцинного иммунитета от патологического процесса) [7]. Индикация респираторных заболеваний крупного рогатого скота долгий и трудоемкий
процесс, а на практике зачастую требуется быстрое и точное определение биопатогена циркулирующего в хозяйстве, чтобы своевременно предпринять меры по профилактике и лечению возникшей болезни. Наиболее точным и быстрым методом диагностики является ПЦ, особенно при одновременной амплификации нескольких маркерных областей.
Целью данной работы являлась разработка олигонуклеотидных затравок для индикации и дифференциации наиболее часто встречающихся респираторных вирусов КРС в одной мультиплексной ПЦР
Материал и методы исследований. При дизайне праймеров и зондов для геноиндикации пользовались ресурсами национального центра биологической информатизации (NCBI), BLAST и программой VectorNTI 9.1.0. (Invitrogen Corporation). При этом ставились следующие задачи: минимальное количество димеров и вторичных структур, одинаковая температура отжига праймеров, минимум гуанинов и цитозинов на 3' конце каждого из праймеров, для положительного контроля требуется только абсолютная комплемен-тарность к праймерам и зонам с нужной последовательностью, с возможностью синтеза ПЦР-продукта длинной около 100 пар нуклеотидов, зонд для ПЦР не должен содержать гуанин на 5' конце зонда.
С целью применения в мультиплексной ПЦР сконструировали уникальный положительный контроль, содержащую комплиментарную нуклеотидную полледовательность ко всем олигонуклио-тидным затравкам искомых вирусов. Выделение ДНК для положительного контроля не требуется, перед ПЦР положительный контроль разбавяли в 100000 раз.
Результаты исследований. Для
анализа генетического полиморфизма и поиска консервативных участков геномов возбудителей инфекционного рино-трахеита, парагриппа-3, и вирусной диареи был создан собственный банк геномов, включающий от 7 до 14 изолятов каждого вида вируса. В результате выравнивания
олигонуклеотидных последовательностей каждого из вирусов установлены консервативные участки.
Для вируса инфекционного рино-трахеита в геноме HV тип 1 штамм Cooper
Для вируса вирусной диареи, изолят Carlito консервативный локус находится на участке 84-204 bp. Локализация последовательностей актуальна для варианта «Consensus», при выравнивании нуклео-тидных последовательностей. Нуклеотид-ный состав наиболее перспективных в плане специфичности последовательностей указан в таблице 1.
В результате дизайна праймеров и зондов для ПЦР были определены нуклеотидные последовательности, кроме того, был произведен дизайн праймеров и зонда для возможного использования в качестве внутреннего контроля ампли-
консервативный локус находится на участке 4716 - 4846 bp. Для вируса парагриппа-3, изолят Egypt 2014 консервативный локус находится на участке 2820 - 2910 bp.
фикации последовательность гена каппа-казеина. Температура отжига всех праймеров составляет 56°С, что позволяет реализовать возможность сочетания тест-систем в мультиплексном формате. Для контроля амплификации (в качестве положительного контроля) был произведен дизайн, и синтез кольцевых молекул ДНК (плазмид), включающих в себя амплифи-цируемые последовательности ДНК. Реакционная смесь и условия проведения реакции, обеспечивающие эффективное накопление продуктов амплификации для всех выявляемых вирусов указаны в таблице 2 и 3 соответственно.
Компонент Кол-во, мкл
dNTP 1,5
10 Х ПЦР буфер Б 1,5
Syn Taq ДНК-полимераза 0,5
MgCl2 1,5
dd H2O 3,5
флуоресцентный зонд (типа Taq Man), 10 пкмоль/мкл 0,5
смесь праймеров, 10 пкмоль/мкл Каждого по 0,5
MMLV ревертаза 0,2
Образец ДНК 5
Таблица 1 - Маркерные участки геномов вирусов
Вирус Консервативный локус
парагрипп-3 acaaguaagaaaaacuuaggauuaacgggaauuauccaauccggagacggagggacaaauccag aauccacccacgaccaaccaaaccaaagauucauggaaaacaaugcuaaagacaaucaaaucaugg auucuugggaagagggaucaggagacaagucaucugacaucucaucggcccucgacauc
вирусная диарея agcgaaggccgaaaagaggcuagccaugcccuuaguaggacuagcaaaacaaggaggguagcaa caguggugaguucguuggauggcugaagcccugaguacaggguagucgucagugguucgacgc uuugugcgacaagccucgagaugccacguggacgagggcaugcccacagcacaucuua
инфекционный ринотрахеит ctgtgcccgtgcgtgtagacaggcaagtagcggctcatggcctcggcgacgatgcccttgagcgtgggg
Таблица 2 - Реакционная смесь, в расчёте на одну пробирку:
Таблица 3 - Условия проведения ПЦР состояли из следующих этапов:
1. 37°С 30 мин
2. 95°С 300 сек
3. 95°С 5 сек
4. 56°С 30 сек., детекция, переход на шаг №3 (40 повторов)
Таким образом, все условия и пропорциональный состав ПЦР тест-систем для индикации каждого из выявляемых биопатогенов методом одиночной ПЦР в режиме реального времени с одновременной обратной транскрипцией вирусной РНК, в той же реакционной смеси были одинаковы. Чувствительность тест-систем определялась путем десятикратных разведений препарата плазмидной ДНК для индикации вирусной диареи КРС, инфек-
ционного ринотрахеита и парагриппа-3, стабильная амплификация наблюдалась при разведении 1:1010, что составило 1 геном эквивалент на мкл плазмидной ДНК.
Основываясь на результатах создания моно-тест-систем для индикации вирусов ИРТ, ВД, ПГ-3 было выявлено, что максимальной эффективностью амплификации ДНК мишени обладают следующие комплексы олгонуклеотидных затравок: BPG32; BVDV1 и ВИУП.
Таблица 4 - Соотношение количества олигонуклеотидных затравок для амплификации ДНК-матриц респираторных вирусов крупного рогатого скота в мультиплексном варианте.
выявляемая инфекция прямой праймер, мкл обратный праймер, мкл зонд, мкл
вирусная диарея КРС 0,2 0,2 0,3
парагрипп - 3 0,3 0,3 0,4
инфекционный ринотрахеит 0,3 0,3 0,4
Так наиболее удачное соотношение ния каждого из искомых вирусов, указано
олигонуклеотидных затравок, для выявле- в таблице 4.
Amplification ^
Рисунок 1 - Амплификация ДНК-маркеров легочных заболеваний к.р.с. вирусной природы в режиме реального времени.
Обозначения: 1 - мультиплексная реакционная смесь, в качестве ДНК-матрицы выступает плазмидная ДНК со вставкой специфичной для вируса парагриппа-3; 2 -мультиплексная реакционная смесь, в качестве ДНК-матрицы выступает ДНК вируса инфекционного ринотрахеита; 3 - мультиплексная реакционная смесь, в качестве ДНК-матрицы выступает плазмидная ДНК со вставкой специфичной для вирусной диареи к.р.с.
В полученную реакционную смесь вводится 5 мкл препарата нуклеиновых кислот. В проведенных опытах установлена специифическая амплификация целевых праймеров на ДНК-матрице положительного контрольного образца в мультипраймерной реакционной смеси, результат амплификации представлен на рисунке 1.
Заключение. Таким образом, в результате проведенной полимеразной цепной реакции установлено, что смесь оли-гонкулеотидных затравок при взаимодействии с одним из ДНК-маркеров не препятствует накоплению специфических продуктов амплификации. Каждому биологическому патогену соответствует индивидуальная флуоресцентная метка, так для вирусной диареи к.р.с. это канал R6G, для парагриппа-3 - канал Fam, а для инфекционного ринотрахеита Су5, что позволяет дифференцировать искомые биопатогены в одной реакции.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Гумеров, В.Г. Определение оптимальной прививочной дозы вакцины против ПГ-3, ИРТ, ВД-БС и хламидиоза крупного рогатого скота инактивирован-ной эмульсионной на кроликах / В.Г. Гумеров, А.И. Никитин, Л.А. Барбарова, Г.И. Хусаинова, И.Г. Каримуллина, И.Р. Акба-шев, В.В. Евстифеев // Ветеринария и кормление. - 2016.- №: 2. - С. 58-60.
2. Котенева, С.В. Частота выявления генома вируса инфекционного рино-трахеита у крупного рогатого при патологии воспроизводства в хозяйствах молочного направления / С.В. Котенева, О.В.
Семенова, Т.И. Глотова, А.Г. Кощаев, И.А. Родин, А.Г. Глотов // Ветеринария Кубани. -2017.- № 5. - С. 8-11.
3. Красиков, А.П. Серологический мониторинг контроля за эпизоотической ситуацией по инфекционным болезням крупного рогатого скота / А.П. Красиков И.Г. Трофимов, И.Г. Алексеева // Вестник Омского государственного аграрного университета. - 2016.- № 4. - С. 165-172.
4. Красочко, П.А. Этиология и меры борьбы с конъюнктивитами крупного рогатого скота / П.А. Красочко, Л.С. Кашко, П.П. Красочко, Н.И. Ревенцова // Ветеринарный врач. - 2016. - № 6. - С. 1217.
5. Кудряшов, А.А. Диагностика инфекционного ринотрахеита и пастерел-лёза телят в агрохозяйствах/ А.А. Кудряшов, В.И. Балабанова, Е.В. Беляева // Международный вестник ветеринарии. -2017. - № 1. - С. 7-12.
6. Нефедченко, А.В. Комплексный подход к определению этиологической структуры респираторных болезней крупного рогатого скота в молочных хозяйствах / А.В. Нефедченко, Т.И. Глотова, А.Г. Глотов // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. -2017. - № 1(124). С. 65-71.
7. Семенова, О.В. Частота выявления посредством ОТ-ПЦР и выделения в культуре клеток вируса диареи крупного рогатого скота в Сибири / О.В. Семенова, Т.И. Глотова, А.Г. Глотов, А.В. Нефедченко // Российский ветеринарный журнал. - 2017.- № 1.- С. 24-27.
АНАЛИЗ ГЕНОМОВ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ БИОПАТОГЕНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ОПТИМИЗАЦИЯ ЕДИНЫХ УСЛОВИЙ
пцр для их индикацИи
Осянин К.А., Хаммадов Н.И., Фахрутдинов Н.А., Фаизов Т.Х., Магдеева Э.А.
Резюме
В результате проведенной полимеразной цепной реакции установлено, что смесь олигонкулеотидных затравок при взаимодействии с одним из ДНК-маркеров не препятствует накоплению специфических продуктов амплификации. Каждому биологическому патогену
соответствует индивидуальная флуоресцентная метка, так для вирусной диареи к.р.с. это канал R6G, для парагриппа-3 - канал Fam, а для инфекционного ринотрахеита Су5.
ANALYSIS OF THE GENOMICS OF RESPIRATORY VIRAL BIOSOPHAGENS OF LARGE CATTLE AND OPTIMIZATION OF UNIFORM PCR CONDITIONS FOR THEIR INDICATION
Osyanin K.A., Khammadov N.I., Fakhrutdinov N.A., Faizov T.H., Magdeeva E.A.
Summary
Thus, as a result of the conducted polymerase chain reaction, it has been established that the mixture of oligonucleotide primers when interacting with one of the DNA markers does not interfere with accumulation of specific amplification products. Each biological pathogen corresponds an individual fluorescent marker for bovine viral diarrhea channel R6G, for parainfluenza-3 - channel Fam, and for infectious rhinotracheitis Cy5.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-236-4-155-159 УДК 636.59
ДИАГНОСТИКА СКРЫТОЙ ФОРМЫ ГИПОМИКРОЭЛЕМЕНТОЗА ПЕРЕПЕЛОВ
Полковниченко П.А. - аспирант, Полковниченко А.П. - к.б.н., доцент, Воробьев Д.В. - д.б.н., профессор, Воробьев В.И. - д.б.н., профессор
ФГБОУ ВО «Астраханский государственный университет»
Ключевые слова: перепел, биогеохимия, гипомикроэлементозы, адаптация, йод, селен Key words: quail, biogeochemistry, hypomicroelementoses, adaptation, iodine, selenium.
Опыт промышленного разведения перепелов диктует необходимое решение проблемы научно-обоснованного обогащения кормов птиц различными минералами, в т.ч. микроэлементами, т.к. в отдельных регионах наблюдается низкий уровень ряда микроэлементов. При дефиците физиологически важных микроэлементов в среде и кормах понижается резистентность организма перепелов, возникает явление постоянно действующего кормового стресса, которое ведет к окси-дативному стрессу, развивающемуся в организме птиц и пролонгирующего синдром скрытой формы гипомикроэлементоза перепелов и цесарок, что вызывает глубокие расстройства общего метаболизма, гемо-поэза [4,5].
Изменяются также процессы свободно-радикального окисления, анти-оксидантной защиты и, наконец, снижаются интегративные функции продуктив-
ности перепелов и цесарок, что нередко вызывает даже гибель разводимой птицы.
К сожалению, в литературе очень мало данных о комплексных системных исследованиях, проблемы диагностики и профилактики синдрома скрытой формы гипомикроэлементоза птиц и особенно перепелов, которых фермеры в последние годы активно перевозят в центральные области России, в т.ч. в регион Нижней Волги, где установлен низкий уровень селена, йода и кобальта в наземных экосистемах [4,11].
Вышеизложенное предопределило необходимость проведения комплексных клинико-диагностических исследований с целью дальнейшей разработки системы диагностических, лечебных и профилактических ветеринарных мероприятий при скрытой форме комбинированного гипомикроэлементоза, снижающего адаптацию и продуктивность птиц в
