CC BY
21
IDENTIFICATION OF FGF21 GENE POLYMORPHISM IN HOLSTEIN CATTLE POPULATION OF TATARSTAN
Safina N.Yu., Shakirov Sh.K., Gaynutdinova E.R., Zinnatova F.F.
Summary
The present study is dedicated to genotyping of Holstein cattle whit using PCR-RLFP method and cattle pituitary-specific transcription factor-1gene allele and genotype diversity monitoring in the different breeds. 148 Holstein cows of Integrated Agricultural Production Centre «Stud farm named after Lenin» of Atninsky district of Republic of Tatarstan were genotyped for the study. Blood sample DNA testing showed that the FGF21 gene is polymorphic for the population under the research. In the course of work the following allelic variants and genotypes were identified: C -0.642 and T - 0.358; CC - 28.4 % (42 animals), TC - 71.6 % (106 animals), TT - 0.0 % (0 animals). The chi-square method testing between the observed and expected genotype distribution indicates a violation of genetic equilibrium in the population under study.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-242-2-153-158 УДК 579.62:577.212.3
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ LTR, P24, GP51, POL В КАЧЕСТВЕ ДНК-МАРКЕРОВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ПЦР-РВ
Сафина Р.Ф. - аспирант
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция (ПЦР), энзоотический лейкоз Keywords: polymerase chain reaction (PCR), enzootic bovine leukemia
Инфекционные заболевания домашних животных оказывают существенное влияние на их продуктивность, жизнеспособность и рыночную ценность. Одним из таких заболеваний является лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь с длительным латентным периодом, поражающая органы кроветворной системы. Заболевание характеризуется патологически усиленной пролиферацией лимфоидных клеток в местах их возникновения и за их пределами, выбросом этих клеток в циркулирующую кровь, появлением злокачественных образований в кроветворных и других органах и тканях [1]. Подсчитано, что животные, инфицированные вирусом лейкоза, имеют молочную продуктивность на 12,7 % и содержание жира в молоке на 0,09 % ниже, чем серо-негативные [2].
Лейкоз крупного рогатого скота вызывается вирусом лейкоза крупного рога-
того скота (ВЛ КРС), который является этиологическим агентом бычьего лейкоза и получил название «вирус лейкоза крупного рогатого скота» или Bovine Leukemia Virus (BLV). Он относится к семейству Retroviridae, подсемейству Oncoviridae. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV) представляет собой B-лимфотропный онкогенный член семейства Retroviridae, который инфицирует крупный рогатый скот во всем мире и является возбудителем энзоотического лейкоза крупного рогатого скота (ЭЛ КРС), опухолевой пролиферации B-клеток [3, 4]. BLV-инфекция характеризуется длительным периодом вирусной латентности и отсутствием виремии. Считается, что это связано с репрессией транскрипции вирусной экспрессии in vivo [5]. Латентность, вероятно, является вирусной стратегией, позволяющей избежать иммунного ответа хозяина, тем самым способствуя развитию
опухоли [6, 7]. Фактически, B-лимфоциты, несущие интегрированный провирус, не продуцируют определяемые уровни вирусной РНК или белков [8]. Тем не менее, когда эти клетки выделяют и культивируют in vitro, происходит заметное увеличение вирусной транскрипции, что свидетельствует о том, что провирус сохраняется на репрессированной стадии in vivo [9].
Что касается организации генома, то, как и у всех ретровирусов, BLV имеет структурные гены gag, pro, pol, env (от 5 до 3 генома), необходимые для продукции инфекционных вирионов [10]. В дополнение к этим генам геном ВЛ КРС содержит X-область, расположенную между геном env и 3-длинным концевым повтором (3-LTR) [11], как это также наблюдается в других дельтаретровирусах [12]. Этот регион содержит открытые рамки считывания четырех регуляторных белков: тран-сактиваторного белка tax [13], белка rex, который стабилизирует и позволяет экспортировать через цитоплазму вирусную РНК и два вспомогательных белка R3 и G4, чьи маленькие открытые рамки считывания расположены в области между геном env и генами tax или rex.
Для диагностики вирусных и бактериальных заболеваний методом ПЦР эффективного прохождения данной реакции, необходим тщательный подбор олигонук-леотидных затравок (праймеров, зондов), который, во-первых, зависит от нуклео-тидной последовательности целевого гена, во-вторых, от химического состава прай-меров, который влияет на образование вторичных структур (образования «шпилек» и димеров). Например, имеются сообщения о применении метода ПЦР для геноидентификации бактерии B.anthracis, штаммы которой способны вызвать бактериальное заболевание - сибирскую язву [14, 15].
В данной статье представлены результаты анализа эффективности прохождения ПЦР при использовании различных комбинаций праймеров и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов.
Целью представленной работы было повышение чувствительности и специфич-
ности метода ПЦР для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Материал и методы исследований. Для проведения представленных в статье экспериментальных работ были отобраны 96 образцов цельной крови крупного рогатого скота, принадлежащего одному из сельхозпредприятий Лаишев-ского района РТ, неблагополучного по ВЛ КРС.
Из исследуемых образцов экстрагирована ДНК с использованием готового набора ДНК-сорб В (Ампли Прайм, Россия), согласно инструкции производителя. Амплификацию ДНК, выделенной из проб крови КРС, проводили на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad, США) с использованием следующих комбинаций олигонуклеотид-ных затравок, специфичных к участкам генома возбудителя энзоотического лейкоза: первая комбинация комплементарна к участку гена gag, кодирующего нук-леокапсидный белок р24; вторая комбинация специфична к участку гена env, отвечающего за синтез поверхностного вирусного белка gp 51 ВЛ КРС; третья комбинация соответствует последовательности, кодирующей длинный концевой повтор LTR - LONG TERMINAL REPEAT; четвертая комбинация праймеров соответствует структурному гену pol, кодирующему полипептиды, обладающие ревер-тазной (РНК-зависимой ДНК - полимераз-ной) активностью.
Нуклеотидные последовательности комбинаций олигонуклеотидных затравок, представлены в таблице 1.
Объём вносимой ДНК - 8 мкл. Общий объём реакционной смеси 15 мкл. Программа ПЦР: 3 мин при 95°С; 45 циклов 15 сек при 95°С и 30 сек при 61°С или 60°С (в зависимости от температуры «отжига» праймеров). В качестве положительного контрольного образца (ПКО) использовали сборную пробу ДНК, выделенную из образцов крови коров, положительно реагирующих в реакции иммуно-диффузии.
В данной сборной пробе методом ПЦР определена высокая концентрация провирусной ДНК ВЛ КРС.
Таблица 1 - Разработанные праймеры и флюоресцетно-меченые зонды
Название Нуклеотидная последовательность 5'-3' Расчетная температура отжига, °С
fp LTR gagttagcggcaccagaagcgtt 60,6
rp LTR cgcggtggtctcagccga 60,6
probe LTR ROX- ccctcgtgctcagctctcggttctg-BHQ2 65
fp p24 ccgttaggctggtcatgtgggc 61
rp p24 ggcaccgggttcgcaagtatg 61
probe p24 ROX-tgatcgaccggggaagcaatatattggca- BHQ2 65
fp env3 tgttcaatgtttctcaaggcaacgc 60,5
rp env3 aggtgagtctctgatggctaagggc 60,5
probe env3 ROX-cctcctatctccctggttaatctctctacggc-RTQ2 60,5
fp pol aacgcctccaggcccttcaa 60,3
rp pol accgggaagactggattattgcct 60,3
probe pol ROX-tctggaggcaggttatatctccccctgg-BHQ2 65
b kappa f cttggcaggcacagtatttgaca 60,3-61
b kappa r attactaccaacagaaaccagttgcac 60,3-61
b kappa p CY5-ttgaagaatttgggcaggtgacctaactg-BHQ3 65
Помимо крупного рогатого скота по такому же алгоритму и с такими же олиго-нуклеотидными затравками исследовали образцы ДНК лошади, барана, свиньи, козла, крысы, мыши, кролика, штаммы (вакцинные) бруцеллеза и сибирской язвы. У лошади, барана, свиньи был изъят методом биопсии кусочек мышц; у крысы, кролика, мыши взяли кровь из сердечной мышцы; штаммы бруцеллеза и сибирской язвы были предоставлены лабораторией музея штаммов. В начале произвели гомогенизацию определенных исследуемых образцов: кусочки мышц лошади, барана, свиньи по отдельности растерли в фарфоровой ступке с помощью пестика, предварительно добавив физиологический раствор хлорида натрия 0,9 % до состояния однородной массы (суспензии). Из исследуемых образцов экстрагирована ДНК с использованием готового набора ДНК-сорб В (Ампли Прайм, Россия), согласно инструкции производителя. Амплификацию ДНК, выделенной из проб крови мыши, крысы, кролика; кусочков мышц лошади, барана, свиньи и козла; вакцинных штаммов бруцеллеза и сибирской язвы проводили на амплификаторе CFX 96 (BioRad, США) с использованием комбинаций олигонуклеотидных затравок, специфичных к участкам генома возбудителя энзоотического лейкоза - LTR, p24, gp 51, pol.
Результаты исследований. В результате проведенного исследования с ис-
пользованием разработанных комбинаций праймеров к следующим ДНК-маркерам ВЛ КРС: gag, pol, LTR, env, установлено наличие провирусной ДНК в 58 исследуемых пробах крови КРС. Это исследование показало работоспособность данных комбинаций праймеров и зондов в ПЦР при индикации провирусной ДНК ВЛ КРС.
Также следует отметить, что при исследовании 32 проб наблюдалось совпадение результатов обнаружения провируса по всем четырём ДНК-маркерам (gag, pol, LTR и env). В 15 пробах наблюдали совпадение лишь по двум или трем маркерам. Были пробы, которые были положительными только по одному из представленных маркеров. Так образцы № 3, № 42, № 43 - по ДНК-маркеру gag (p24), по маркеру env - пробы № 24, № 37; по маркеру pol три пробы - № 1, № 33, № 48.
Полученные данные о несовпадении результатов обнаружения провируса по разным ДНК-маркерам подвели к следующему предположению, что возможно инфицированные лимфоциты могут содержать не только целиком всю провирус-ную ДНК, но и отдельные фрагменты генома вируса лейкоза крупного рогатого скота. Согласно сформулированной гипотезе, в одном лимфоците могут содержаться отдельные гены, кодирующие определенные белки ВЛ КРС (например, как в пробах № 1 - pol, № 3 - p24, № 24 - env, № 185 - LTR), гены, кодирующие два-три
белка (как в пробах № 2 - p24, pol; № 10 -LTR, p24, pol; №13 - LTR, env), или гены, кодирующие все 4 основных белка ВЛ КРС (пробы № 5, № 6, № 9, № 14 - LTR, p24, gp 51, pol). Однако представленная гипотеза должна быть подтверждена более глубокими исследованиями, такими как полногеномное секвенирование генома инфицированных клонов лимфоцитов.
Также в ходе проведенных исследований были выявлены некоторые особенности разработанных комбинаций олиго-нуклеотидов. Так с помощью праймеров и зондов ДНК-маркера «LTR» (3 комбинация олигонуклеотидов) удалось определить наличие провирусной ДНК на более ранних циклах ПЦР по сравнению с другими комбинациями. Так разность значений Ct проб ДНК составила между 1 и 3 комбинациями 0,528 цикла, между 2 и 3
комбинациями - 1,296 цикла, между 3 и 4 комбинациями - 1,118 цикла (Таблица 2). Этот факт говорит о том, что за счёт использования комбинации праймеров к ДНК-маркеру «LTR» полимеразная цепная реакция будет иметь более высокую чувствительность при индикации провирус-ной ДНК возбудителя энзоотического лейкоза. Повышение чувствительности метода достигнуто за счёт уменьшения количества вторичных структур и димеров праймеров и зондов в процессе их дизайна, а также вследствие того, что маркерная последовательность LTR встречается дважды в начале и конце генома ВЛ КРС. Диагностика по четырем локусам увеличивает специфичность реакции и позволяет выявлять все известные типы и изоляты вируса, исключая возможность получения ложноот-рицательных результатов.
аблица 2 - Разность средних значений Ct между комбинациями олигонуклеотидов
Показатель gag (p 24) env (gp 51) LTR pol
(1 комб.) (2 комб.) (3 комб.) (4 комб.)
Среднее значение 27,528 28,296 27,000 28,118
Разность средних значений ^ (1 комбинация) 0
Разность средних значений ^ (2 комбинация) -0,768 0
Разность средних значений 0,528 1,296 0
^(3 комбинация)
Разность средних значений -0,590 0,178 -1,118 0
^ (4 комбинация)
В результате исследования образцов гетерогенной ДНК, полученной из биологического материала от лошади, барана, свиньи, козла, крысы, мыши, кролика, бактериальных культур вакцинных штаммов возбудителей бруцеллеза и сибирской язвы значение цикла (Ct) не определено, т.е. данные образцы ДНК в ПЦР с использованием специфичных праймеров для индикации провирусной ДНК ВЛ КРС не прореагировали. Это произошло по причине отсутствия сколько-нибудь идентичного нуклеотидного участка в исследованных образцах гетерогенной ДНК к целевым последовательностям, кодирующим белки LTR, P24, GP51, POL ВЛ КРС. Это исследование подтверждает результаты биоин-
формацинного анализа последовательностей праймеров и зондов для индикации генома ВЛ КРС, представленных в таблице 1, с использованием онлайн-утилиты BLAST Национального Центра Биоинформатики (NCBI) [16], где было показано что анализируемым олигонуклеотидам ВЛ КРС не было найдено сколько-нибудь идентичных последовательностей других организмов. Результаты BLAST-анализа и экспериментальные данные подтверждают высокую специфичность разработанных олигонуклеотидов для индикации прови-русной ДНК ВЛ КРС.
Заключение. Использование различных ДНК-маркеров и комбинаций оли-гонуклеотидных затравок для амплифика-
ции этих маркеров значительно влияет на чувствительность и специфичность ПЦР-РВ. Наиболее высокая чувствительность метода ПЦР при индикации провирусной ДНК ВЛКРС была достигнута при использовании ДНК-маркера, который кодирует LTR-концевой участок генома. Уникальность выбранных нуклеотидных последовательностей доказана в результате BLAST-анализа и путем проведения ПЦР с использованием разработанных праймеров к ДНК-маркерам, кодирующим белки LTR, P24, GP51, POL ВЛ КРС на гетерогенных образцах ДНК.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Авилов, В.М. Проблемы оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза / В.М. Авилов, В.М. Нахмансон // Ветеринария. - Казань - 1995. - № 11. - С. 3-6.
2. Галиуллин, А.К. Ветеринарно-санитарные мероприятия в стационарно неблагополучном сибиреязвенном пункте /А.К. Галиуллин // Ветеринарный врач. -Казань. -2006. - № 2. - С.18-19.
3. Гулюкин, М.И. Обзор эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота / И.М. Гулюкин, Г.А. Симо-нян, Н.А. Ажиркова // Ветеринарная жизнь. - 2005. - № 6. - С. 38.
4. Крикун, В.А. Эффективность серологического метода диагностики при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных хозяйствах по лейкозу крупного рогатого скота / В.А. Крикун, В.П. Шишков, Б.З. Иткин [и др.] // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных: Тез. докл. Всесоюзн. конф. - Ташкент. - 1984. - C. 155.
5. Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев Б.В. [и др.]. - М., 1998. - 928 с.
6. Фаизов, Т.Х. Геноидентификация B.anthracis и почвенных сапрофитов методом ПЦР/ Т.Х. Фаизов, А.К. Галиуллин, А.М. Алимов // Ветеринария. - Казань. -1995. - № 5 - С. 8-12.
7. Burny, A. Bovine leukemia: facts and hypothesis derived from the study of an infectious cancer / Burny A., Cleuter Y., Kettmann R. [et al.] // Cancer Surv. - 1987. -№ 6. - P.139-159.
8. Kettmann, R. Leukemogenesis by bovine leukemia virus: proviral DNA integration and lack of RNA expression of viral long terminal repeat and 3' proximate cellular sequences / Kettmann R., Deschamps J., Cleuter Y. [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. - 1982.
- № 79. - P. 2465-2469. (doi:10.1073/pnas.79.8.2465).
9. Mammerickx, M. Genomic integration of bovine leukemia provirus: comparison of persistent lymphocytosis with lymph node tumor from of enzootic/ Mammerickx M., Meunier-Rotival M., Bernardi G. [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. - 1980. - № 77. -P. 2577-2581. (doi:10.1073/pnas.77.5.2577).
10. Pierard, V. DNA cytosine meth-ylation in the Bovine Leukemia Virus promoter is associated with latency in a lympho-ma-derived B-cell line / Pierard V., Guiguen A., Colin L. [et al.] // The Journal of Biology Chemistry. - 2010. - V. 285. - P. 1434-1449. (doi: 10.1074/jbc.M110.107607).
11. Merimi, M. Complete suppression of viral gene expression is associated with the onset and progression of lymphoid malignancy: observations in Bovine Leukemia Virus-infected sheep / Merimi M., Klener P., Szynal M. [et al.] // Retrovirology. - 2007. - № 4. -P. 51. (doi: 10.1186/1742-4690-4-51).
12. Lagarias, D.M. Transcriptional activation of bovine leukemia virus in blood cells from experimentally infected, asymptomatic sheep with latent infections / D.M. Lagarias, K. Radke // Journal of Virology. -1989. - № 63. - P. 2099-2107.
13. Radke, K. Transcription of bovine leukemia virus in peripheral blood cells obtained during early infection in vivo / K. Rad-ke, T. Sigala, D. Grossman // Microb Pathog.
- 1992. - V. 12. - P. 319-331. (doi:10.1016/0882-4010(92)90095-6).
14. Gaudray G., Gachon F., Basbous J. The complementary strand of the human T-Cell leukemia virus type 1 RNA genome encodes a bZIP transcription factor that down-regulates viral transcription / G. Gaudray, F. Gachon, J. Basbous [et al.] // The Journal of Virology. - 2002. - V. 76. - P. 12813-12822. (doi: 10.1128/JVI.76.24.12813-12822.2002).
15. Sagata, N. Comparison of the entire genomes of bovine leukemia virus and human T-cell leukemia virus and characteri-
zation of their unidentified open reading al.] // European Molecular Biology Organiza-
frames/ N. Sagata, T. Yasunaga, K. Ohishi [et tion Journal. - 1984. - V. 3. - P. 3231-3237.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ LTR, P24, GP51, POL В КАЧЕСТВЕ ДНК-МАРКЕРОВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ПЦР-РВ
Сафина Р.Ф.
Резюме
Целью представленной работы было повышение чувствительности и специфичности метода ПЦР для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Для осуществления данной цели были разработаны и синтезированы комбинации праймеров и зондов, специфичные к генам ВЛ КРС, кодирующим капсидный белок p24, гликопротеин gp51, длинный концевой повтор LTR, структурный белок pol. Проведен анализ эффективности прохождения ПЦР при использовании разработанных комбинаций олигонуклеотидных затравок для ПЦР-РВ В результате исследования установлено, что все разработанные комбинации праймеров и зондов позволяют с помощью метода ПЦР-РВ идентифицировать провирусную ДНК ВЛ КРС в образцах крови. Наиболее эффективными оказались праймеры и зонд к участку LTR генома вируса лейкоза КРС, при их использовании ПЦР стартует раньше по сравнению с другими использованными комбинациями олигонуклеотидов (p24, gp51, pol), что значительно повышает чувствительность метода. Данное исследование служит одним из этапов создания наиболее эффективной экспресс тест-системы для точного обнаружения возбудителя лейкоза в скотоводческих хозяйствах России.
DNA MARKERS ENCODING THE PROTEINS LTR, P24, GP51, POL TO INDICATE THE CAUSATIVE AGENT OF BOVINE LEUKEMIA IN PCR-RT
Safina R.F.
Summary
The aim of the present work was to increase the sensitivity and specificity of the PCR method for the diagnosis of cattle leukemia. To achieve this goal, combinations of primers and probes were developed and synthesized that are specific for Bovine Leukemia Virus (BLV) overhead gene coding for p24 capsid protein, gp 51 glycoprotein, LTR long terminal repeat, pol structural protein. The analysis of the effectiveness of PCR using the developed combinations of oligonucleotide primers for PCR-Real Time is carried out. As a result of the study, it was found that all the developed combinations of primers and probes allow using the PCR-Real Time method to identify the proviral DNA of BLV in blood samples. The primers and the probe to the LTR region of the cattle leukemia virus genome were the most effective; when using them, PCR starts earlier than other oligonucleo-tide combinations used (p24, gp51, pol), which significantly increases the sensitivity of the method. This study is one of the stages in creating the most effective rapid test system for the accurate detection of the causative agent of leukemia in cattle farms in Russia.
