CC BY
582. Altynbekov, O.M. Korrekciya syvorotochnykh immunoglobulinov novorozhdennykh telyat [Correction of serum immunoglobulins in newborn calves] / O.M.Altynbekov, A.V.Andreeva // Prioritetnye vektory razvitiya promyshlennosti I selskogo khozyaistva: materialy I Mezhdunar. nauch.-prakt. konf. [Priority vectors of industrial and farm development: proceedings from the 1-st International scientific and practical conference]. - Voronezh: Izd-vo Voronezhskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta im. Imperatora Petra I, 2018. - P. 11-14.
3. Andreeva, A.V. Dinamika morfologicheskikh pokazateley krovi pri korrekcii specificheskogo immuniteta [Dynamics of morphological parameters of blood at correction of specific immunity] / A.V.Andreeva, O.N.Nikolaeva // Morfologiya. - 2018. - Vol. 153, № 3. - P. 20.
4. Profilaktika rota- I koronavirusnykh enteritov novorozhdennykh telyat [Prevention of rota-and coronavirus enteritis of newborn calves] / A.E.Zelenov [et al.] // Veterinariya. - 2004. - № 4. - P. 8-9.
5. Pleshakova, V.I. Primenenie immunomodulyatorov Vestin I Provest dlya profilaktiki virusnykh respiratornykh infekciy telyat [The use of immunomodulators Vestin and Provest for the prevention of viral respiratory infections of calves] / V.I.Pleshakova, V.S.Vlasenko, I.A.Lukyanova // Veterinariya Kubani. - 2012. - № 4. - P. 7-9.
6. Sidorov, M.A. Osnovy profilaktiki zheludochno-kishechnykh zabolevaniy novorozhdennykh zhivotnykh [Basics of prevention of gastrointestinal diseases in newborn animals] / M.A.Sidorov, V.V.Subbotin // Veterinariya selskokhozyaystvennykh zhivotnykh. - 2008. - №. 3. - P. 8-12.
7. Spiridonov, G.N. Zheludochno-kishechnye zabolevaniya novorozhdennykh telyat v usloviyakh promyshlennykh kompleksov I razrabotka lechebno-profilakticheskikh meropriyatiy (Smeshannaya infekciya) [Gastrointestinal diseases of newborn calves in industrial complexes and development of therapeutic and preventive measures (Mixed infection)] / G.N.Spiridonov // Veterinarny vrach. - 2007. - Spetsvypusk. - P. 26-29.
УДК: 577.2:619:616.98:578.828.11
ПОВЫШЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ПЦР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ, КОДИРУюЩИХ БЕЛКИ P24 И GP51, В ПЦР-РВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ВЛКРС
Р.Ф.Сафина - аспирант; Г.Р.Лукманова - аспирант; К.В.Усольцев - кандидат ветеринарных наук, вед.н.с.; Н.И.Хаммадов - кандидат биологических наук, вед.н.с.;
Т.Х.Фаизов - доктор ветеринарных наук, профессор, зав. лабораторией.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»,
г. Казань (420075, Казань, Научный городок-2, e-mail: [email protected].
Лейкоз крупного рогатого скота - это хроническая инфекционная, медленно протекающая болезнь опухолевой природы. Установлено, что геном ВЛКРС (вирус лейкоза крупного рогатого скота) представлен 8,7 тыс. нуклеотидами. Вирусный геном состоит из двух идентичных одноцепочечных позитивных молекул РНК. Так же геном вируса может существовать в виде ДНК, которая синтезируется на вирусной РНК и затем интегрируется в хромосому клетки-хозяина в виде провируса. Цель работы - повышение чувствительности и специфичности метода ПЦР для диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота. Для осуществления вышеуказанной цели, был проведен анализ эффективности прохождения ПЦР при использовании различных групп комбинаций олигонуклеотидных затравок для ПЦР-РВ (полимеразная цепная реакция в реальном времени). Были разработаны комбинации праймеров и зондов, комплементарные генам ВЛКРС кодирующих капсидный белок p24 и гликопротеин gp51, по 3 комбинации на каждый ДНК-маркер. В результате исследования установлено, что все вышеперечисленные праймеры и зонды были работоспособны, а наиболее эффективными олигонуклеотидными затравками оказались праймеры и зонд «комбинация 2.2» к гену env. Олигонуклеотиды «комбинация 2.2» инициировали синтез ампликонов на более ранних циклах ПЦР, что позволяет выявить более низкие концентрации провирусной ДНК ВЛКРС. Этот факт говорит о том, что за счёт использования данной комбинации праймеров ПЦР имеет более высокую чувствительность при индикации провирусной ДНК ВЛКРС. Таким образом, повышена чувствительность и специфичность ПЦР с использованием ДНК-маркеров, кодирующих белки p24 и gp51, в ПЦР-РВ для индикации ВЛКРС.
КЛюЧЕВЫЕ СЛОВА: полимеразная цепная реакция (ПЦР), энзоотический лейкоз, p24 и gp51, вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС).
DOI: 10.33632/1998-698X.2019-2-8-14
Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, основной причиной которой является злокачественный рост клеток с нарушением их созревания, в результате чего происходит диффузная инфильтрация органов перерожденными клетками и образование опухолей [1, 2]. Эти злокачественные клетки и опухоли препятствуют физиологически оправданной (нормальной) трофике организма, но являются короткоживущими и распадаются с образованием большого количества токсичных веществ, отравляющих организм, вызывая гибель животного [3, 4, 5]. Этиологическим агентом лейкоза КРС является Bovine leukemia virus, относящийся к классу Delta retro virus,семейству Retro viridae [6, 7, 8].
Геном возбудителя лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) представлен 8,7 тыс. нуклеотида-ми [9] и имеет следующую генетическую структуру: 5'LTR -gag-pol-env-pXBL-3'LTR. Вирусный геном состоит из двух идентичных одноцепочечных позитивных молекул РНК, которые нековалентно связаны друг с другом вблизи 5'-концов. Так же геном вируса может существовать в виде ДНК, которая синтезируется на вирусной РНК и затем интегрируется в хромосому клетки - хозяина в виде провируса.
На обоих концах молекулы провирусной ДНК содержатся последовательности нуклеотидов, называемые LTR (Long Terminal Repeat) длинные концевые повторы, которые состоят из трех регионов: U3 (358 п.н.), R (100 п.н.) и U5 (180 п.н.). Транскрипция геномной РНК начинается с первого нуклеотида в R-рай-оне 5' LTR и заканчивается последним нуклеотидом в R-районе 3' LTR.
Геном ВЛКРС так же содержит gag, pol и env структурные и регуляторные гены, необходимые для синтеза вирусной частицы [10] и Х-регион [11, 12], локализованные между env и 5'-концом длинного концевого повтора (LTR).
Для эффективного прохождения любой ПЦР необходим тщательный подбор праймеров, который, во-первых, зависит от нуклеотидной последовательности целевого гена, во-вторых, от химического состава праймеров, который влияет на образование вторичных структур (образования «шпилек» и димеров). В данной статье представлены результаты анализа эффективности прохождения ПЦР при использовании комбинаций праймеров и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов. Первая группа комплементарна к гену негликолизированного нуклеокапсид-ного белка р24 вируса лейкоза КРС, а вторая -к участку гена env, участвующего в синтезе белка gp 51 вирусной оболочки ВЛКРС.
Целью представленной работы было повышение чувствительности и специфичности ПЦР с использованием ДНК-маркеров, кодирующих белки p24 и gp51, в ПЦР-РВ для индикации ВЛКРС.
Материалы и методы. Исследования проведены в лаборатории биохимии и молекулярно-генетическо-го анализа ФГБНУ «Федеральный центр токсикологи-
ческой, радиационной и биологической безопасности» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») с использованием 56 образцов цельной крови крупного рогатого скота, ото-браных из хозяйств Апастовского района РТ, неблагополучного по ВЛКРС. Из них была экстрагирована ДНК с использованием готового набора ДНК-сорб В (Ампли Прайм, Россия), согласно инструкции производителя. Амплификацию ДНК, выделенной из проб крови крс, проводили на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad, США) с использованием следующих групп комбинаций праймеров и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов, специфичных к участкам генома возбудителя энзоотического лейкоза.
Первая группа комбинаций праймеров комплементарна к участку гена, кодирующего нуклеокапсидный белок р24. Вторая группа комбинаций специфична к участку гена env, отвечающий за синтез поверхностного вирусного белка gp 51 ВЛКРС. Следует добавить, что одна комбинация праймеров (1.3) из 1-ой группы была ранее нами разработана и запатентована [13]. Разработку вышеперечисленных праймеров и зондов осуществляли с использованием программного обеспечения Vector NTI 9.1 (Thermo Fisher Scientific, США). При дизайне праймеровизондов также пользовались ресурсами National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Синтез праймеров был осуществлён в ООО «НПФ Синтол». Состав ПЦР-сме-си на 1 реакцию (10 кратный ПЦР-буфер (ООО «НПФ Синтол») 1,5 мкл; 2,5 мМ смесь нуклеозидтрифосфатов (ООО «НПФ Синтол») 1,5 мкл; 25 мМ MgCl2 (ООО «НПФ Синтол») 1,5 мкл; Taq-полимераза (5 ед/мл) (ООО «НПФ Синтол») 0,5 мкл; FP (10 pM раствор) 0,5 мкл; RP (10 pM раствор) 0,5 мкл; probe (10 pM раствор) - 0,5 мкл). Объём вносимой ДНК - 8 мкл. Общий объём реакционной смеси 15 мкл. Программа ПЦР: 3 мин при 950С; 45 циклов 15 сек при 950С и 30 сек при 610С или 600С (в зависимости от температуры «отжига» праймеров). В качестве положительного контрольного образца (ПКО) использовали сборную пробу ДНК, выделенную из образцов крови положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии коров. В данной сборной пробе методом ПЦР определена высокая концентрация прови-русной ДНК ВЛКРС.
Результаты исследований. С целью разработки специфичной комбинации праймеров к геному ВЛКРС был осуществлен поиск консервативных участков генома вируса лейкоза крс. Было найдено 6 локусов ДНК: 3 локуса в гене, кодирующем капсид-ный белоф24 и 3 локуса - в гене гликопротеина gp51 (ген ENV). Далее к этим локусам генома ВЛКРС был выполнен подбор праймеров и олигонуклеотидных зондов. Причём подбор старались осуществлять таким образом, чтобы свести к минимуму количество вторичных структур (димеры, шпильки). В результате были разработаны комбинации праймеров и зондов, которые представлены в таблице 1.
Таблица 1
Разработанные праймеры и флуоресцентно-меченные зонды
Название Нуклеотидная последовательность 5 ^ 3' Расчётная температура отжига Количество димеров Количество «шпилек»
FP ENV cgcccacaaccgatcatcaga 60,3 3 отсутствуют
RP ENV gcctcttggttatatgctgtcatccatt 60,6 8 3
probeENV ROX-taagtctcactctcactctcctcgctctctgtc- BHQ2 64,6 4 2
FP ENV2 attgcgagccccgatgcc 60,3 отсутствуют отсутствуют
RP ENV2 tgacattgtttgagatgcaggaataaaatc 60,6 15 6
probe ENV2 ROX- tatgtgggggcagatcggttcgact -BHQ2 65,1 4 1
FP ENV3 tgttcaatgtttctcaaggcaacgc 61,1 4 2
RP ENV3 aggtgagtctctgatggctaagggc 60,6 2 отсутствуют
probe ENV3 ROX- cctcctatctccctggttaatctctctacggc BHQ2 65,6 1 отсутствуют
FP P24 II ccaattatatctgaaggaaatcgcaacc 60,2 5 1
RP P24 II gttctaggtcagcaggagtagggtcg 59,6 3 1
probe P24 II ROX- cgcttgggcactccgagaattacaag -BHQ2 64,5 5 1
FP P24 III cggcccacatgaccagccta 60,3 4 1
RP P24 III gttctaggtcagcaggagtagggtcg 59,6 3 1
probe P24 III ROX- cggcgttgggctgagctgattg -BHQ2 65,4 3 отсутствуют
FP P24* ggcaccgggttcgcaagtatg 61 3 отсутствуют
RP P24* ccgttaggctggtcatgtgggc 62,2 1 отсутствуют
probe P24* ROX-5' tgatcgaccggggaagcaatatattggca 3'-BHQ2 69,2 6 отсутствуют
Примечание: * ранее запатентованная комбинация праймеров и зондов [13].
Также установлено, что самое минимальное количество вторичных структур у олигонуклеотидов РР ЕШ, ЯР ЕШ и 1 ЕШ и которое равно 9. Этот результат свидетельствует о том, что данная комбинация праймеров возможно более предпочтительна в ПЦР, т.к. чем меньше число димеров и «шпилек», тем эффективнее протекает реакция.
После того как были получены от ООО «НПФ Син-тол» синтезированные праймеры и зонды, которые представлены в таблице 1, были проведены испытания работоспособности в ПЦР данных олигонуклеотидов с применением расчётных температур отжига. В результате исследования установлено, что все вышеперечисленные праймеры и зонды были работоспособны, т.е. позволяли обнаруживать провирусную ДНК ВЛКРС при применении расчётных температур отжига, однако наиболее эффективными олигонуклеотидными затравками оказались праймеры и зонд «комбинация 2.2» к гену епу (РР ЕШ, ЯР ЕШ и 1 ЕШ). Данная комбинация при использовании ПКО дала более ранний старт реакции (значение С! равно 16,76) по сравнению с другими праймерами. Результаты данного исследования представлены в таблице 2.
Далее были проведены эксперименты по оценке эффективности прохождения ПЦР в зависимости от применяемой комбинации праймеров при использовании ДНК, выделенной из образцов крови КРС.
В результате проведенного исследования, в анализируемых образцах установлено наличие прови-русной ДНК в 29 пробах как с использованием первой (ДНК-маркер «p24»), так и с использованием второй группы праймеров/зондов (ДНК-маркер «ENV»). Это исследование показало работоспособность оцениваемых комбинаций праймеров и зондов в ПЦР при индикации провирусной ДНК ВЛКРС. Однако с помощью праймеров и зондов «комбинации 2.2» удалось определить наличие провирусной ДНК на более ранних циклах ПЦР (разность значений Ct проб ДНК в среднем составила 15,13 цикла). Этот факт свидетельствует о том, что за счёт использования данной комбинации праймеров полимеразная цепная реакция будет иметь более высокую чувствительность при индикации провирусной ДНК ВЛКРС. Повышение чувствительности метода достигнуто за счёт уменьшения количества вторичных структур праймеров и зондов. Результаты данного исследования представлены на рисунке и в таблице 3.
Таблица 2
Условные обозначения применяемых олигонуклеотидов
Название олигонуклеотидов Комбинация праймеров и зонда Значение С ПКО
FP ENV2 комбинация 2.1 34,15
RP ENV2
probe ENV2
FP ENV3 комбинация 2.2 16,76
RP ENV3
probe ENV3
FP ENV комбинация 2.3 33,11
RP ENV
probe ENV
FP P24 II комбинация1.1 35,38
RP P24 II
probe P24 II
FP P24 III комбинация1.2 33,52
RP P24 III
probe P24 III
FP P24* комбинация1.3 23,46
RP P24*
probe P24*
Примечание: * ранее запатентованная комбинация праймеров и зондов [13].
Рис. Графики кривых флуоресценции амплифицированных образцов ДНК, выделенных из крови коров и содержащих провирусную ДНК ВЛКРС.
На представленном рисунке показаны графики из рисунка наиболее ранние старты ПЦР наблюда-накопления флуоресценции при постановке ПЦР с ются при использовании комбинации «2.2». различными комбинациями праймеров. Как видно
Таблица 3
Результаты амплификации образцов ДНК, выделенных из крови коров и содержащих
провирусную ДНК ВЛКРС
Проба Ct (1.1 комбинация) Ct (1.2 комбинация) Ct (1.3 комбинация) Ct(2.1 комбинация) Ct(2.2 комбинация) Ct(2.3 комбинация)
1 35,54 37,48 26,95 34,19 21,01 37,06
2 33,19 38,41 21,66 37,1 19,96 35,22
3 39,08 33,47 26,81 36,52 20,39 34,71
4 37,05 34,83 22,48 33,79 19,95 35,14
5 34,27 35,96 21,63 33,97 20,66 36,68
6 37,14 36,4 21,26 37,45 18,91 33,73
7 38,09 37,14 22,91 34,36 19,42 34,69
8 39,47 38,77 23,97 37,95 19,41 33,76
9 35,11 36,24 28,93 35,94 20,07 36,83
10 39,41 38,4 31,34 38,99 19,46 37,59
11 37,18 39,42 22,43 37,63 18,79 36,46
12 34,29 35,73 20,02 34,78 18,46 35,2
13 36,47 36,02 21,12 35,17 20,16 37,88
14 37,84 36,93 21,26 35,37 19,02 34,51
15 39,1 34,11 20,83 33,79 18,88 38,04
16 38,95 36,87 20,46 34,73 19,08 35,77
17 39,13 40,09 24,32 39,95 19,97 38,99
18 40,33 37,46 20,64 38,87 18,70 36,49
19 38,44 36,79 19,85 39,46 18,60 35,1
20 40,08 39,01 20,99 40,86 18,93 38,57
21 39,78 40,68 23,39 37,19 19,14 34,97
22 38,7 39,37 20,62 38,49 20,08 35,93
Среднее значение 37,82 37,53 23,46 36,87 19,32 36,58
± среднее значение 2,1389 2,0204 3,8343 2,0786 0,7676 1,881
Разность средних значений 01 (1.1 комбинация и 2.2 комбинация) равна 18,5 циклам. Разность средних значений И (1.2 комбинация и 2.2 комбинация) равна 18,21 циклам. Разность средних значений 0Ц1.3 комбинация и 2.2 комбинация) равна 4,14 циклам. Разность средних значений 0Ц2.1 комбинация и 2.2 комбинация) равна 17,55 циклам. Разность средних значений 0Ц2.3 комбинация и 2.2 комбинация) равна 17,26 циклам.
Заключение. В результате анализа генома ВЛКРС была разработана специфичная для этого возбудителя комбинация праймеров и флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда. Данная комбинация является важным специфичным компонентом ПЦР в режиме реального времени для индикации провирусной ДНК ВЛКРС. При использовании этой комбинации происходили более ранние старты полимеразной цепной реакции, чем при использовании других комбинаций праймеров как
при использовании положительного контрольного образца, так и при применении образов ДНК, выделенных из крови крупного рогатого скота. Этот факт свидетельствует о более высокой эффективности прохождения ПЦР при использовании данной комбинации олигонуклеотидов, что опосредовано повышает чувствительность метода. Это очень важно для обнаружения возбудителя лейкоза крупного рогатого скота на ранних стадиях заражения, с целью своевременной изоляции инфицированных животных
от здорового поголовья. Таким образом, повышена зованием ДНК-маркеров, кодирующих белки p24 и чувствительность и специфичность ПЦР с исполь- gp51, в ПЦР-РВ для индикации ВЛКРС.
Литература
1. Глазунов, Ю.В. Лейкоз крупного рогатого скота в Тюменской области / Ю.В.Глазунов, Л.А.Глазунова // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 3. - С. 611.
2. Иванов, О.В. Качество серологической диагностики гарантия оздоровления стада от лейкоза крупного рогатого скота / О.В.Иванов, О.Ю.Иванова // FarmAnimals. - 2014. - № 3 (7). - С. 26-29.
3. Верховский, О.А. Лейкоз крупного рогатого скота / О.А.Верховский, Т.И.Алипер // Руководство по вирусологии: Вирусы и вирусные инфекции человека и животных; под ред. акад. РАН Д.К. Львова. - М.: Медицинское информационное агентство, 2013. - С. 869-873.
4. Инфекционная патология животных. Том. 1 / под ред. А.Я.Самуйленко [и др.]. М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 910 с.
5. Мониторинг эпизоотической ситуации и применение молекулярно-генетической диагностики в оздоровительных мероприятиях при лейкозе крупного рогатого скота / Н.Г.Козырева, Л.А.Иванова, Т.В.Степанова, М.И.Гулюкин // Достижение науки и техники АПК. - 2014. - № 1. - С. 47-51.
6. Изучение генотипического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота, циркулирующего в популяции животных в регионе Северного Кавказа (Ставропольский край) / С.С.Абакин [и др.] // Вестник АПК Ставрополья. - 2015. - № 3 (19). - С. 60-64.
7. Генджиева, О.Б. Филогенетическое сравнение вируса лейкоза крупного рогатого скота / О.Б.Генджиева // Вестник Калмыцкого университета. - 2012. - № 2 (14). - С. 10-16.
8. Донник, И.М. Синцитиальный метод при ранней идентификации вируса лейкоза крупного рогатого скота / И.М.Донник, М.В.Петропавловский // Ветеринария Кубани. - 2015. - № 4. - С. 8-10.
9.Rossler, Н. Influence of different culture conditions on BLV expression in permanently infected PLK cell lines / H.Rossler, KBurkhardt, S.Rosental. - Folia biol. (CSSR). - 1985. - Vol. 31, № 4. - Р. 273-283.
10. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: Its evolutionary relationship to other retroviruses / N.Sagata [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1985. - № 82. - Р. 677-681.
11. Comparison of the entire genomes of bovine leukemia virus and human T-cell leukemia virus and characterization of their unidentified open reading frames / N.Sagata [et al.] // EMBO J. - 1984. - Vol. 3. - Р. 3231-3237.
12. Bovine leukemia virus: unique structural features of its long terminal repeats and its evolutionary relationship to human T-cell leukemia virus / N.Sagata [et al.] // Proc Natl Acad Sci. - 1984. - Vol. 81. - Р. 4741-4747.
13. Пат. 2644233 Рос. Федерация, МПК C 12 Q 1/66. Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота / А.И.Никитин, К.В.Усольцев, Т.Х.Фаизов, А.Н.Чернов, И.И.Усольцева, М.Е.Семенова, Н.И.Хаммадов, З.З.Алеева, Ф.А.Хусниев, Р.М.Ахмадеев, Ш.З.Валидов, Э.А.Шуралев; заявитель и патентообладатель ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». - № 2016109396; заявл. 15.03.16; опубл. 08.02.18, Бюл. № 4.
USING DNA MARKERS ENCODING P24 AND GP51 PROTEINS IN PCR-RT TO INCREASE SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE PCR METHOD FOR INDICATION OF BLV
Safina R.F. - postgraduate student; Lukmanova G.R. - postgraduate student;
Usoltsev K.V. - Candidate of Veterinary Sciences; Khammadov N.I. - Candidate of Biological Sciences;
Faizov T.Kh. - Doctor of Veterinary Sciences, professor.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: [email protected]).
Bovine leucosis is a chronic, infectious, slow-flowing cattle disease with development of tumor. The genome of the causative agent of BLV (bovine leukemia virus) is found to be represented by 8.7 thousands nucleotides. The viral genome consists of two identical single-stranded positive RNA molecules. The virus genome can also exist as DNA, which is synthesized on viral RNA and then integrated into the chromosome of the host cell as a provirus. The purpose of this work was to increase the sensitivity and specificity of the PCR method for the diagnosis of bovine leukemia virus. For this purpose, the analysis for the efficiency of PCR was made when using various combinations groups of oligonucleotide
primers for PCR-RT (polymerase chain reaction in real time). Combinations of primers and probes complementary to the BLV genes encoding the capsid protein p24 and the glycoprotein gp51 were developed, 3 combinations for each DNA marker. As a result of the study, all the above-mentioned primers and probes are found to be efficient, and the most effective oligonucleotide primers to be the primers and the "combination 2.2" probe to the gene env. Oligonucleotides "combination 2.2" initiated the synthesis of amplicons at earlier PCR cycles, which allows detecting lower concentrations of the proviral BLV DNA. This fact suggests that PCR has a higher sensitivity when indicating the proviral BLV DNA due to the use of this combination of primers. Thus, sensitivity and specificity of the PCR are increased when using DNA markers encoding the p24 and gp51 proteins in PCR-RT to detect BLV.
KEY WORDS: polymerase chain reaction (PCR), enzootic leukemia, p24 and gp51, bovine leukemia virus (BLV).
References
1. Glazunov, Yu.V. Leykoz krupnogo rogatogo skota v Tyumenskoy oblasti [Bovine leukemia in Tyumen Region] / Yu.V.Glazunov, L.A.Glazunova // Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. - 2015. - № 3. - P. 611.
2. Ivanov, O.V. Kachestvo serologicheskoy diagnostiki - garantiya ozdorovleniya stada ot leykoza krupnogo rogatogo skota [The quality of serologic diagnosis is a guaranty of herd recovery from bovine leukemia] / O.V. Ivanov, O.Yu.Ivanova // Farm Animals. - 2014. - № 3 (7). - P. 26-29.
3. Verkhovskiy, O.A. Leykoz krupnogo rogatogo skota [Bovine leukemia] / O.A.Verkhovskiy, T.I.Aliper // Rukovodstvo po virusologii: Virusy i virusnye infekcii cheloveka i zhivotnykh; pod red. akad. RAN D.K.Lvova; [Manual on virusology: Viruses and viral infections of human and animals; edited by akad. RAS D.K.Lvov]. - M.: Medicinskoe informacionnoe agentstvo, 2013. - P. 869-873.
4. Infekcionnaya patologiya zhivotnykh. Tom. 1 / pod red. A.Ya.Samuylenko [i dr.] [Infectious pathology of animals. Vol. 1; edited by A.Ya.Samuylenko [et al.]. - M.: IKC «Akademkniga», 2006. - 910 p.
5. Monitoring epizooticheskoy situacii i primenenie molekulyarno-geneticheskoy diagnostiki v ozdorovitelnykh meropriyatiyakh pri leykoze krupnogo rogatogo skota [Monitoring of epizootic situation and using molecular and genetic diagnosis in recovery measures at bovine leukemia ] / N.G.Kozyreva, L.A.Ivanova, T.V.Stepanova, M.I.Gulyukin // Dostizhenie nauki i tekhniki APK. - 2014. - № 1. - P. 47-51.
6. Izuchenie genotipicheskogo raznoobraziya virusa leykoza krupnogo rogatogo skota, cirkuliruyushchego v populyacii zhivotnykh v regione Severnogo Kavkaza (Stavropolskiy kray) [Study of genotypical diversity of bovine leukemia virus circulating in animal population in the North Caucasus Region (Stavropol Territory)] / S.S.Abakin [et al.] // Vestnik APK Stavropolya. - 2015. - № 3 (19). - P. 60-64.
7. Gendzhieva, O.B. Filogeneticheskoe sravnenie virusa leykoza krupnogo rogatogo skota [Phylogenetic comparison of bovine leukemia virus] / O.B.Gendzhieva // Vestnik Kalmytskogo universiteta. - 2012. - № 2 (14). - P. 10-16.
8. Donnik, I.M. Sincitialny metod pri ranney identifikacii virusa leykoza krupnogo rogatogo skota [Syncytial method used in early identidication of bovine leukemia virus] / I.M.Donnik, M.V.Petropavlovskiy // Veterinariya Kubani. - 2015. -№ 4. - P. 8-10.
9. Rossler, H. Influence of different culture conditions on BLV expression in permanently infected PLK cell lines / H.Rossler, H.Burkhardt, S.Rosental. - Folia biol. (CSSR). - 1985. - Vol. 31, № 4. - P. 273-283.
10. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: Its evolutionary relationship to other retroviruses / N.Sagata [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1985. - № 82. - P. 677-681.
11. Comparison of the entire genomes of bovine leukemia virus and human T-cell leukemia virus and characterization of their unidentified open reading frames / N. Sagata [et al.] // EMBO J. - 1984. - Vol. 3. - P. 3231-3237.
12. Bovine leukemia virus: unique structural features of its long terminal repeats and its evolutionary relationship to human T-cell leukemia virus / N.Sagata [et al.] // Proc Natl Acad Sci. - 1984. - Vol. 81. - P. 4741-4747.
13. Pat. 2644233 Ros. Federaciya, MPK C 12 Q 1/66. Sposob ekspress-diagnostiki leykoza krupnogo rogatogo skota / A.I.Nikitin, K.V.Usolcev, T.Kh.Faizov, A.N.Chernov, I.I.Usolceva, M.E.Semenova, N.I.Khammadov, Z.Z.Aleeva, F.A.Khusniev, R.M.Akhmadeev, Sh.Z.Validov, E.A.Shuralev; zayavitel i patentoobladatel FSBRI «FCTRB-VNIVI». -№ 2016109396; zayavl. 15.03.16; opubl. 08.02.18, Byul. № 4.
