CC BY
99
НТП: животноводство и кормопроизводство
УДК 636.2:619:616.155.392
ВИРУСОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА BLV
П.Н. СМИРНОВ, доктор ветеринарных наук, зав. кафедрой
Н.В. БАТЕНЁВА, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
Новосибирский ГАУ E-mail: nauka@ngs.ru
Резюме. В статье отражены вирусогенетические аспекты лейкоза крупного рогатого скота (BLV), а также изложены гипотезы географического распространения вируса, особенностей течения этого заболевания у животных красной степной, голштинизированной черно-пестрой и айрширской пород, возможных связей между генотипом лейкоза и породой «хозяина» (носителя) вирусной инфекции. Установлены генотипы вируса лейкоза крупного рогатого скота по двум генам - gag и env, циркулирующие на поголовье скота хозяйств Краснодарского края и Новосибирской области. Представлены результаты ПЦР-диагностики и ПДРФ-анализа. Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота, gag ген, еnv ген, генотипирование, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
О болезни, названной «leukosis», впервые сообщил A. Leisering, который еще в 1871 г. описал наличие желтоватых узелков в селезёнке коровы [1, 2]. C тех пор ученые всего мира работают над изучением механизма «запуска» и течения болезни при хронической и острой формах [1, 3...5].
Однако эта проблема до сих пор не решена.
Крупный рогатый скот - естественный хозяин BLV. Существование диких резервуаров на сегодняшний день, остается спорным, но есть доказательства того, что вирус действительно сохраняется в организме многих видов животных: кроликов, крыс, кур, свиней, коз и овец [6, 7]. Однако только в организме овцы последовательно развиваются все стадии лейкоза, кроме опухолевой [1], а при экспериментальном вирус-индуцированном лейкозе у ягнят имеет место и опухолевая стадия.
Все больше внимания уделяется изучению структурных генов - gag, pol и env. Причем, по данным некоторых исследователей gag ген менее консервативен, чем env [3, 8].
Предметом нашего внимания были два структурных гена - gag и env, их разнородность, частота регистрации генотипов, причем, в зависимости от породной и территориальной принадлежности инфицированного крупного рогатого скота, у которого регистрировали провирус BLV.
Условия, материалы и методы. Методм ПЦР с праймерами на специфические участки env и gag гена, кодирующего структурный белок ВЛКРС, были исследованы соответственно 400 и 762 пробы крови, взятых от серопозитивных (РИД+) животных разной породной
принадлежности из хозяйств Новосибирской области и Краснодарского края.
Для исследований сорбентным методом из лейкоцитов крови была выделена ДНК провируса лейкоза.
Выбор оптимального режима амплификации (gag p24, env gp 51 BLV) проводили, исходя из длины ампли-фицируемых фрагментов. При постановке ПЦР использовали наборы фирмы Gene Pak. Олигонуклеотидные праймеры синтезировали в лаборатории «МедиГен».
Процедуру определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов предварительно оптимизировали (ПЦР — по критерию максимального выхода ампликона; ПДРФ — по полноте гидролиза; электрофоретическое разделение — по параметрам режима, обеспечивающим наибольшую четкость паттернов).
Для генотипирования с использованием ограниченной панели с ДНК от серопозитивных к BLV в РИД животных (по 10 образцов из каждой панели), образцы отбирали методом случайной выборки, в результате чего на панели располагались изоляты от особей разной породной и территориальной принадлежности.
Результаты и обсуждение. Длина области gag-гена, фланкированная специфичными праймерами, составила 347 п.н. [8...11] (рис. 1).
ПЦР-анализ наличия провирусной ДНК крупного рогатого скота с использованием специфических для
области env-гена праймеров показал (табл. 1), что доля РИД-серопозитивных животных с отрицательным результатом ПЦР составляет в зависимости от породы 5...20 %. Причем наибольшее количество животных с отсутствием сигнала в ПЦР регистрируется среди айрширской скота.
Отсутствие сигнала в ПЦР у серопозитивных животных объясняется в литературе несколькими причинами, в том числе отсутствием строгой комплементарности в области связывания с праймерами из-за мутационных изменений гена [4, 11]. Вероятно, несмотря на консервативность гена, с течением времени он все-таки претерпевала мутационные изменения, в то время как используемые праймеры не подвергали коррекции, как минимум с 1997 г. [12].
При диагностике с праймерами к gag гену доля серопозитивных животных с отрицательным результатом ПЦР в среднем составила 4,98 % (от 2,6 до 7,0 %), что значительно ниже, чем в случае использования праймеров к env гену. Таким образом, тест-система ПЦР с
Таблица 1. Анализ наличия провирусной ДНК (область гена env) BLV среди серопозитивных в РИД животных разной породной принадлежности
Порода Число животных, гол.
РИД+ РИД+, ПЦР+ РИД+, ПЦР-
Черно-пестрая голштини-
зированная 147 139 8
Красная степная 133 117 16
Айрширская 120 96 24
Всего 400 352 48
1к 2к Зк 4к 5к 6к 7к 16к 17к 18к 19к 20к 21к 22к 23к 24к 25к К- К+
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации гена gag провируса лейкоза, полученных с использованием ДНК животных, принадлежащих СПК «Колос» Динского района Краснодарского края в 2 % агарозном геле: 1к*-7к, 17к - 25к — опытные образцы 347 п.н., К(-) — отрицательный контроль, К(+) — положительный контроль (Gene Pak, gag 347 п.н. ).
Таблица 2. Анализ наличия провирусной ДНК (область гена gag) BLV среди серопозитивных в РИД животных разной породной принадлежности
Порода Число животных, гол.
РИД+ РИД+, ПЦР+ РИД+, ПЦР-
Черно-пестрая голштини-
зированная 284 263 21
Красная степная 255 244 11
Айрширская 223 217 6
Всего 762 724 38
праймерами к gag гену более чувствительна и ее можно рекомендовать для проведения оздоровительных мероприятий в стадах.
При гидролизе эндонуклеазой рестрикции Hae III визуализировалось не менее 8 групп паттернов, Fae I — 4 группы. То есть всего с использованием двух рестриктаз можно выделить не менее 11 условных генотипов, каждый из которых циркулирует на строго ограниченном поголовье скота. Так IV...VI генотипы наблюдались только у животных хозяйства «Агроном» (Краснодарский край). Подобную «избирательность» вируса, на наш взгляд, можно объяснить восприимчивостью или устойчивостью каждой породы животных к конкретному генотипу вируса. Однако эта гипотеза требует проведения дальнейших исследований в направлении вирус-организм-среда, поскольку многие факторы могут оказывать непосредственное влияние, как на вирус, так и на организм животного, который по тем или другим причинам элиминирует воздействие вируса. В результате последний либо находится в латентном состоянии, либо полностью уничтожается иммунной системой.
Результаты анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов области env гена менее разнообразны, однако не менее актуальны. Как на территории Новосибирской области, так и Краснодарского края породных различий в циркуляции вируса не выявлено. Однако в хозяйстве Краснодарского края обнаружен
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов гидролиза эндонуклеазой рестрикции HaeIII амликона (347 п.н.) гена gag вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV), полученных с использованием интегрированной ДНК, выделенной из лейкоцитов цельной крови животных, принадлежащих хозяйствам Краснодарского края - ПЗ «Им. В.И. Чапаева» - айрширский скот; СПК «Колос» - красная степная порода; ЗАО «Агроном» -черно-пестрый голштинизированный скот, в агарозном геле:
I — маркер молекулярных масс (ДНК-маркер 100 bp - ladder «МедиГен») 2-4 — опытные образцы.
II генотип, который ранее не был зарегистрирован на территории Российской Федерации.
Выводы. Учитывая результаты ПЦР и РИД сделан вывод о возможном изменении структуры вируса лейкоза КРС, в результате чего участок ДНК более не фланкируется выбранными праймерами. Это косвенно подтверждают результаты ПДРФ-анализа, согласно которым носители наибольшего количества генотипов вируса - животные айрширской породы, чаще реагировавшие в ПЦР отрицательно (РИД+ пробы).
Вирус BLV не однороден, как по gag, так и по env гену. На территории Краснодарского края обнаружено большее разнообразие генотипов вируса, чем в Новосибирской области по обоим генам.
Литература.
1. Da, Y., Shanks, R.D., Stewart, J. and Lewin, H.A. Milk and fat yields decline in bovine leukemia virus-infected holstein cattle with persistent lymphocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (2003) 6538-6541.
2. Иванов О.В., Федотов В.П., Крючкова Е.Н. Об эффективности серодиагностики лейкоза коров при трематодозной инвазии. Сельскохозяйственная биология, 2009, № 2, с.111-113.
3. Johnston E. R., Albritton L., Radke K. Envelope proteins containing single amino acid substitutions support a structural model of the receptor-binding domain of bovine leukemia virus surface protein. J. Virol., 2002, 76(21): 10861-10872.
4. Крикун В.А. Лейкоз крупного рогатого скота и иммунологическая толерантность / В.А.Крикун // Ветеринария. 2002. -№ 6. - С. 7-9. 13.
5. Смирнов П.Н. Болезнь века — лейкоз крупного рогатого скота. - Новосибирск, 2007.
6. Riebe R., Blankenstein P., Starick E., Bondzio A. Establishment of a new bovine leucosis virus producing cell line. J. Virol. Meth., 2004, 121(2): 239-246.
7. Yang D., Snanks R.D., Stewart J.A., Lewin H.A. Milk and fat yields decline in bovine leukemia virus-infected Holsten cattle with persistant lymphocytosis. PNAS USA, 1993, 90: 6538-6541.
8. M. R. Mohammadabadi. Detection of bovine leukemia virus proviral DNA in Yaroslavsl, Mongolian and Black pied cattle by PCA. CELL. MOL. BIOL. LETT, Vol. 9. No. 4A, 2004
9. Licursi M., Inoshima Y., Yokoyama T., Gonzales E., Sentsui H. Genetic heterogeneity bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts. Virus Res., 2002, 86: 101-110.
10. Петропавловский М.В., Донник И.М., Татарчук А.Т. Методология снижения инфицированности животных вирусом лейкоза в оздоравливаемых стадах крупного рогатого скота. Екатеринбург, 2009.
11. Чичинина С.В. Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу. Автореф. канд дис. Новосибирск, 2005.
12. Fechner H. Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) application in diagnosis of bovine leukaemia virus (BLV) infection in naturally infected cattle/H. Fechner, A. Kurg, L. Geue et al. / J. Am. Vet. Med. Assoc., 2003. - V. 222(7). - P. 983-5.
VIRUS-GENETIC ASPECTS OF BOVINE LEUKEMIA VIRUS (BVL)
P.N. Smirnov, N.V. Bateneva
Summary. In article are reflected hypotheses of geographical distribution of a virus and also are reflected viralgenetics aspects bovine leukemia virus. Features of a clinical course BLV at animals red steppe breed, holstein frisian breed and ayrshire breed of cows. Search of possible communication between a genotype BLV and breed of «owner» (carrier) of a virus infection. Virus genotypes BLV a horned cattle on two genes - gag and env, circulating on a livestock of cattle of economy of Krasnodar territory and the Novosibirsk region are established. Results of PCR-diagnostics and the RFLP -analysis are presented.
Key words. Bovine leukemia virus (BLV), gag gene, env gene, genotyping, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP).
