Научная статья на тему 'Разработка и испытание мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для идентификации вирусов, вызывающих острые респираторные инфекции человека'

Разработка и испытание мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для идентификации вирусов, вызывающих острые респираторные инфекции человека Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
693
340
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ПЦР / ДИАГНОСТИКА РЕСПИРАТОРНЫХ ИНФЕКЦИЙ / ВИРУС ГРИППА ТИПА А / ВИРУС ГРИППА ТИПА В / РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНЫЙ ВИРУС / ACUTE RESPIRATORY INFECTIONS (ARI) / АДЕНОВИРУС / ОСТРЫЕ РЕСПИРАТОРНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ / MULTIPLEX PCR / DIAGNOSIS OF RESPIRATORY INFECTIONS / INFLUENZA VIRUS / RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS / ADENOVIRUS

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Сергеева Елена Игоревна, Терновой Владимир Александрович, Демина Ольга Константиновна, Демина Анна Владимировна, Корнеев Денис Владимирович

Разработана мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР) для идентификации четырех вирусов, вызывающих острые респираторные заболевания человека. Аналитическая чувствительность разработанной мультиплексной ПЦР-РВ для идентификации аденовируса, респираторно-синцитиального вируса, вирусов гриппа типа А и В, а также актуальных субтипов вируса гриппа типа А (сезонного и пандемического вариантов H1N1, сезонного H3N2 и патогенных для человека вируса гриппа птиц H5 и H7) составила 1х10 3 геномных эквивалентов в мл. Диагностическая чувствительность для вируса гриппа типа А и В, а также субтипов H1 (сезонного H1N1, пандемического варианта 2009 г H1N1), H3, H5 составила 1х10 3-10 4 вирусных частиц в мл. Разработанный метод обладает высокой специфичностью, не дает положительного сигнала в экспериментах с ДНК/кДНК человека и вирусными кДНК. С использованием разработанного набора нами было исследовано 50 проб. Этиологический агент был определен в 33 образцах.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Сергеева Елена Игоревна, Терновой Владимир Александрович, Демина Ольга Константиновна, Демина Анна Владимировна, Корнеев Денис Владимирович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Разработка и испытание мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для идентификации вирусов, вызывающих острые респираторные инфекции человека»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 578.832.1:578.53].083.2

Е.И. Сергеева, В.А. Терновой, О.К. Демина, А.В. Демина, Д.В. Корнеев, А.Н. Шиков,

С.А. Берилло, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев

разработка и испытание мультиплексной пцр в режиме реального времени для идентификации вирусов, вызывающих острые респираторные инфекции человека

ФБУН "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"", п. Кольцово, Новосибирская обл.

Разработана мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР) для идентификации четырех вирусов, вызывающих острые респираторные заболевания человека. Аналитическая чувствительность разработанной мультиплексной ПЦР-РВ для идентификации аденовируса, респираторно-синцитиального вируса, вирусов гриппа типа А и В, а также актуальных субтипов вируса гриппа типа А (сезонного и пандемического вариантов Н1М, сезонного И3М2 и патогенных для человека вируса гриппа птиц Н5 и Н7) составила 1*103 геномных эквивалентов в мл. Диагностическая чувствительность для вируса гриппа типа А и В, а также субтипов Н1 (сезонного Н1М, пандемического варианта 2009 г Н1М), Н3, Н5 составила 1*103-104 вирусных частиц в мл. Разработанный метод обладает высокой специфичностью, не дает положительного сигнала в экспериментах с ДНК/кДНК человека и вирусными кДНК. С использованием разработанного набора нами было исследовано 50 проб. Этиологический агент был определен в 33 образцах.

Ключевые слова: мультиплексная ПЦР, диагностика респираторных инфекций, вирус гриппа типа А, вирус гриппа типа В, респираторно-синцитиальный вирус, аденовирус, острые респираторные вирусные инфекции

В структуре общей инфекционной заболеваемости человека острые респираторные инфекции занимают первое место, являясь главной причиной временной нетрудоспособности, приводя к огромным экономическим потерям. По официальным данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в 2010 г. на территории Российской Федерации было официально зарегистрировано 28 265 634 случая острых инфекций верхних дыхательных путей, в том числе заболевание гриппом, в 2011 г. — 31 038 446 случаев [18]. Реальное число случаев заболевания респираторными инфекциями может быть больше, так как часть заболевших не обращаются за медицинской помощью и не попадают в статистические отчеты.

Основными этиологическими агентами острых респираторных вирусных инфекций человека являются вирусы, относящиеся к 6 семействам: Orthomyxoviridae (вирус гриппа), Paramyxoviridae (вирус парагриппа, метапневмовирус, респиратор-но-синцитиальный вирус), Picornaviridae (энтерови-рус, риновирус), Coronaviridae (коронавирусы 229Е, HKU1, Ж63, OC43, возбудитель ТОРС), Adenoviridae (аденовирус), Parvoviridae (бокавирус). Исходя из того что острые респираторные заболевания у человека способен вызывать широкий ряд инфекционных агентов, их дифференциальная диагностика требует затраты значительных материальных, временных и трудовых ресурсов. В связи с этим особенно актуальна разработка средств дифференциальной диагностики респираторных заболеваний в формате мультиплексной ПЦР [8]. Данная работа посвящена разработке и апробации набора реагентов для выявления генетиче-

ского материала 4 вирусов (вирусы гриппа типа А и В, респираторно-синцитиальный вирус и аденовирус), вызывающих наиболее тяжелые инфекции респираторного тракта человека.

Материалы и методы

Клинические образцы. Для проведения исследований использовали клинический материал (мазки из носо- и ротоглотки) от 30 пациентов в отсутствии симптомов ОРВИ. Исследование проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с "Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан" (ред. Указ Президента РФ от 24.12.1993 Т2288, Федеральные законы №30-ФЗ от 02.03.1998, № 214-ФЗ от 20.12.1999). Опрос респондента и взятие клинических образцов проводили после получения письменного информированного согласия. Порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом ГНЦ ВБ "Вектор" от 09 декабря 2011 г. Также исследовали 50 образцов от пациентов с симптомами ОРВИ, поступившие в ГНЦ ВБ "Вектор" в течение 2009—2010 гг. для верификационных исследований на наличие генетического материала пандемического вируса гриппа А/И1Ы1(2009) согласно приказу Роспотребнадзора от 17.03.2008 г. № 88 "О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней".

Вирусные штаммы. В работе использовали штаммы вируса гриппа типа А: A/Aichi/2/1968(H3N2), сезонный вариант вируса гриппа A/Novosibirsk/1/2009(H1N1), штаммы пандемического вируса гриппа A/Ekaterinburg/01/2009(H1N1)v, A/Tomsk/01/2009(H1N1)v, A/ Novosibirsk/02/2009(H1N1)v,A/Irkutsk/01/2009(H1N1)v, штамм высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N1), A/ garganey/Crimea/2027/2006(H7N8) и штаммы вируса гриппа типа В: В/ Chita/01/2010, В/^йа/02/2010, В/^йа/03/2010, В/^йа/04/2010, В/ Chita/05/2010. Штамм A/Aichi/2/1968(H3N2) был получен из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва. Штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N1) был получен из НИИ гриппа РАМН, г. Санкт-Петербург. Штаммы сезонного и пандемического вариантов вируса гриппа субтипа H1N1, а также вирус гриппа A/ garganey/Crimea/2027/2006(H7N8) были выделены в ГНЦ ВБ "Вектор". Штаммы вируса гриппа типа В были получены из ФГУЗ "ЦГиЭ в Читинской области". Штамм Long респираторно-синцитиального вируса (№ VR-26) и штамм Gomen аденовируса тип 7 (№ VR-7) были получены из Американской типовой коллекции клеточных культур (ATCC).

Штаммы вируса гриппа прошли в ГНЦ ВБ "Вектор" не более 3 пассажей на культуре клеток MDCK. Штамм респираторно-синцитиального вируса был наработан на перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки Vero, штамм аденовируса — на перевиваемой культуре модифицированных клеток почки человеческого эмбриона 293. Клетки получены из отдела клеточных технологий ГНЦ ВБ "Вектор". Культивирование инфицированных клеточных культур проводили при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2. Для поддержания культур клеток использовали питательную среду DМЕМ (ООО "Биолот", г. Москва) с добавлением 2 мМ на 1 литр глутамина ("Sigma-Aldrich", США) и антибиотиков: 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Праймеры и зонды. Для проведения работ по подбору праймеров и зондов были использованы нуклеотидные последовательности, полученные из международной базы данных GenBank. Для проведения выравнивания полученных последовательностей, а также анализа и расчета праймеров и зондов, изучения их специфичности использовали семейство компьютерных программ Vector NTI 9.0 ("Informax", США) и интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) в режиме онлайн.

Использованные в работе праймеры и зонды

Вирусный агент Референс-по-следовательность GenBank Ген Координаты Праймеры и зонды 5'^3' Tm, С°

ВГ-А CY037808.1 М 145— 188— 239— -165 207 222 AAGRCCAATMCTGTCACCTCT FAM-GTRTTCACGCTCACCGTGCC-BHQ1 RCGYCTACGYTGCAGTCC 51

ВГ-В CY037432.1 M 19— 49— 111 39 65 —93 GACACRATTGCCTACYTGCTT R6G-GARGAYGGRGAARGCAAAGYAGA-BHQ2 TCTTTYCCACCRAACCARC 51

А/Ы1Ш сез. CY002672.1 HA 213— 256— 279— -231 239 263 GCCCCMYTACAATTGGGTA ROX-CCAHCCGGCAAYGCTGCA-BHQ2 YCGCATTCTGGRTTYCCT 51

А/Ы1Ш панд. 2009 GQ457514.1 HA 822— 874— 925— 844 899 904 GGAAAGARATRCTGRATCTGGTA Cy5-TGCAAYACAACTTGTCAGACAYCCR-BHQ2 ATGGGAGRCTRGTRTTTATAGC 51

2А/Ы3 CY000941.1 HA 1544— 1596— 1621— -1569 -1574 -1599 TRTACAGARAYGARGCATTRAACA FAM-TCAACRCCTTTGATYTGRRAYCG-BHQ1 TAGRAYCCAATCYTTRTAYCCTG 51

А/Ы5 DQ360835.1 HA 1547— 1604— 1654— 1568 1626 1636 GARARGAAATAARTGGRGTRAAATT R6G-TTTATTCHACWGTRRCRAGYTCCCTARYA-BHQ2 RACCAGCYABCRTGATTGC 51

А/Ы7 AB558258.1 HA 977— 1051— 1102— 998 1073 -1084 CWACAGRAATGAARAAYGTYCC ROX-CTYTTYGGRGCRATTGCTGG-BHQ2 CRATGAGACCYTCCCAYCC 51

РСВ - F Будут опубликованы позже 51

АдВ - hexon Будут опубликованы позже 52

Положительные контрольные образцы. Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А-клонирования синтезированных ДНК-фрагментов, несущих вирусспецифическую вставку, в плазмиду pCR2.1 ("Invitrogen", США) с использованием клеток E. rnli линии TOP 10 ("Invitrogen", США) для трансформации.

Определение концентрации ДНК. Концентрацию плазмидной и геномной ДНК человека определяли при помощи коммерческого набора реагентов Quant-iT DNA HS ("Invitrogen", США) и флуориметра QUBIT ("Invitrogen", США).

Получение препаратов вируса гриппа и определение физического титра. Для определения концентрации вируса (физического титра) в образцах использовали препараты, приготовленные следующим образом: на 5-е сутки после заражения из культуральных сосудов отбирали культуральную вируссодержащую жидкость (КВЖ). Затем центрифугированием при 6000 g при 4°С в течение 10 мин удаляли клеточный дебрис, после чего к надосадочной жидкости добавляли ПЭГ 6000 до конечной концентрации 8% (масса/объем). Полученную суспензию перемешивали в течение 1 ч при 40С, затем центрифугировали 20 мин при 1000 g. Полученный осадок ресу-спендировли в STE-буфере (10 мМ Tris-HCl, pH 7,8, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA), после чего суспензию наносили на градиент из 10—60% (масса/объем) растворов сахарозы. Центрифугирование проводили в течение 4 ч при 150 000 g с использованием ультрацентрифуги Optima L-90K в роторе 90Ti ("Beckman Coulter", США). Фракции, содержащие по результатам реакции гемагглютинации максимальное количество вирионов гриппа, использовали для определения концентрации вируса с помощью электронного микроскопа JEM-1400 ("JEOL Ltd.", Япония). Суспензию с известной концентрацией вируса использовали для приготовления последовательных 10-кратных разведений и определения диагностической чувствительности разрабатываемого набора реагентов.

Экстракция вирусной и человеческой РНК/ДНК, проведение реакции обратной транскрипции. Вирусную и РНК/ДНК человека выделяли из 100 мкл клинического материала, КВЖ, цельной крови. Выделение осуществляли с использованием коммерческого набора реагентов "РИБО-преп" (ФБУН "ЦНИИЭ", Москва, Россия) согласно инструкции производителя. Синтез кДНК проводили в 20 мкл с использованием набора реагентов "Реверта-L" (ФБУН "ЦНИИЭ", Москва, Россия) согласно инструкции производителя. Полученную суспензию кДНК раз-

бавляли в 2 раза 1 х ТЕ-буфером (до 40 мкл). Контроль выделения нуклеиновых кислот и реакции обратной транскрипции проводили в отдельной пробе, с добавлением суспензии вируса гриппа — штамм А/ Tomsk/01/2009(H1N1)v.

ПЦР-амплификация. Реакцию амплификации проводили в 30 мкл смеси, содержащей 1 х Taq-буфер, 0,17 мМ каждого из дезокси-рибонуклеозидтрифосфатов, 1,5 активных единиц Smart-Taq-ДНК-полимеразы (все реактивы ООО "Лаборатория МЕДИГЕН", г. Новосибирск). В реакционную смесь добавляли 6 мкл исследуемого образца, 6 мкл 1 х ТЕ-буфера, содержащего 102 копий одной (в случае моноварианта ПЦР) или каждой (в случае мультиплексной ПЦР) из реком-бинантных плазмид pCR2.1 со вставкой вирусспецифического ДНК-фрагмента, в качестве положительного контрольного образца и 6 мкл 1 х ТЕ-буфера в качестве отрицательного контрольного образца. Реакцию проводили согласно температурно-временному профилю: активация Smart-Taq-ДНК-полимеразы при 950C — 5 мин, денатурация ДНК при 950C — 10 с, отжиг праймеров при 510C — 20 с, элонгация при 720C — 20 с. Первые 10 циклов амплификации флуоресцентный сигнал не детектировали, в последующих 30 циклах интенсивность флуоресценции определяли по четырем каналам —Green (FAM), Yellow (R6G), Orange (ROX), Red (Cy5) — на приборах Rotor Gene 6000 ("Corbet Research", Австралия) и iQ5 ("BioRad", США). Дополнительно проводили электрофорез продуктов ПЦР в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.

Верифицирующие ПЦР-тест-системы. Для верификации результатов дополнительно проводили исследование клинического материала с помощью коммерческих наборов реагентов для амплификации и идентификации кДНК вируса гриппа: "АмплиСенс Influenza virus A/B-FL" (вирусы гриппа типов А и В), "АмплиСенс Influenza virus А-тип-FL" (вирус гриппа А (H1N1, H3N2)), "АмплиСенс Influenza virus А/Ш-swine-FL" (пандемический вариант вируса гриппа H1N1(2009)), "АмплиСенс Influenza virus A H5N1-FL" (высокопатогенный вирус гриппа птиц субтипа H5N1), "АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL" (10 агентов ОРВИ человека) (ФБУН "ЦНИИЭ", Москва, Россия).

Результаты и обсуждение При создании набора для ПЦР в реальном времени, позволяющего провести идентификацию этиоло-

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

а п4 J

10^

/ /

/V 10/

1

0,8 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

о

: 5________

"^iqV

'"in2 ^

" ioV

--

--

Цикл

Цикл

0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0

в

^ /

/ л

/ 1СГ

/ 10/

/ / юЯ

' / /

/ /

—^ -

Цикл

Цикл

Рис. 2. Результат изучения чувствительности методом ПЦР в режиме реального времени. Чувствительность метода для вируса гриппа типа В (а), аденовируса (б) и респираторно-синцитиального вируса (в) составила 10 ГЭ в реакцию (103 ГЭ/мл). Диагностическая чувствительность для вируса гриппа типа А (г) составила 104 вирионов в мл.

гических агентов острых респираторных вирусных заболеваний человека, нами были выбраны 4 вируса: вирусы гриппа А и В, аденовирус человека, респи-раторно-синцитиальный вирус человека. В процессе работы были добавлены актуальные субтипы вируса гриппа А: сезонные варианты H1N1 и H3N2, пандемический вариант H1N1(2009), а также субтипы H5 и H7 вируса гриппа птиц, инфицирующие человека [5]. Таким образом, данная работа посвящена разработке ПЦР для выявления генетического материала (РНК/ ДНК) перечисленных вирусных патогенов, вызывающих респираторные заболевания у людей.

Из данных литературы известно, что наиболее консервативные участки геномов выбранных вирусов располагаются в гене М вирусов гриппа А и В, в гене гек-сона (hexon ген) аденовируса человека и F-гене (fusion protein ген) респираторно-синцитиального вируса человека. Субтипирование вируса гриппа А традиционно проводят по гену гемагглютинина (НА-ген).

Для типирования вирусов гриппа А и В, а также идентификации сезонного вируса гриппа АШШ1, пандемического вируса гриппа А/ШШ(2009), вируса гриппа А субтипов H3, H5 и H7 были взяты праймеры и зонды, рекомендованные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). Впоследствии рекомендованные ВОЗ олигонуклеотиды были переработаны и изменены с учетом полученных нами данных.

Из базы данных GenBank были отобраны как полные, так и фрагментарные нуклеотидные последовательности вирусных геномов, которые были детально проанализированы. Всего в ходе работы нами было проанализировано 1852 нуклеотидные последовательности 7-го сегмента (М-ген) генома вируса гриппа (1446 нуклеотидных последовательностей вируса

гриппа А и 406 последовательностей вируса гриппа В). Рассчитывая специфические праймеры и зонды для сезонного вируса гриппа АШШ1, пандемического вируса гриппа А/ШШ(2009), вируса гриппа А субтипов H3, H5 и H7, было проанализировано соответственно 1220, 1185, 714, 316, 78 нуклеотидных последовательностей 4-го сегмента генома вируса гриппа (НА-ген). Для респираторно-синцитиального вируса человека и аденовируса человека были подобраны оригинальные праймеры и зонды, нуклеотидные последовательности которых в связи с предстоящим патентованием будут опубликованы нами в более поздних работах. При расчетах были проанализированы 1562 нуклеотидные последовательности генома респираторно-синцитиального вируса и 1393 нуклео-тидные последовательности генома аденовируса се-ротипов 3, 4, 7, 14, 21 наиболее часто инфицирующих респираторный тракт человека [10; 15]. Праймеры и зонд для детекции респираторно-синцитиального вируса были подобраны внутри F-гена, для аденовируса — внутри гена гексона. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов представлены в таблице. Специфичность выбранных олигонуклеотидов на этапе расчетов была проанализирована с использованием программы nucleotide Blast NCBI. По результатам наших исследований выбранные праймеры и зонды не имели гомологии с человеческой ДНК, а также с агентами, которые могли бы встретиться в мазках из зева, носоглотки, ротоглотки, аспирате и других клинических материалах, отбираемых для диагностических исследований, а именно коронавирусами человека видов 229E, NL63, OC43, HKu1, коронавирусом, ассоциированным с тяжелым острым респираторным синдромом, вирусом герпеса человека типа 1—2, ци-

Смесь для ПЦР №1

/

\

к-

1*ТЕ

1

Образец К+

ДНК/кДНК рВГ-А (FAM) pBr-B(R6G) pA/H1N1ce3.(ROX) рА/Н1 N1 (2009)панд.(Су5)

Смесь для ПЦР №2

/

\

1

Образец К+ К-

ДНК/кДНК рВГ-А/НЗ (FAM) 1хТЕ рВГ-А/Н5 (R6G) pBf-A/H7(ROX)

Смесь для ПЦР №3

Г г г г г г г г г

Рис. 1. Схема проведения ПЦР в формате "мультиплекс" в режиме реального времени с использованием разработанного набора реагентов.

томегаловирусом, вирусом парагриппа человека типа 1—4, метапневмовирусом человека, риновирусом человека видов A—C, энтеровирусом человека видов A—D, бактериями рода Streptococcus, бактериями вида Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophilapneumonia, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila.

В качестве положительных контролей в разработанном наборе были использованы плазмидные конструкции со встройкой соответствующего вирус-специфического фрагмента ДНК. Полученные плазмидные конструкции (рВГ-А, рВГ-В, рА/ШШсез., рА/Н1Ш(2009)панд., pA/H3, pA/H5, pA/H7, рАдВ, рРСВ) были использованы для оптимизации условий реакции амплификации для каждого из инфекционных агентов в отдельности (моноплексная ПЦР). Были подобраны опытным путем оптимальные концентрации ионов Mg2+ (2,5 мМ MgCl2), прямого и обратного праймеров (10—12 пМ), флуоресцентного ДНК-зонда (6—8 пМ) для ПЦР в моноварианте.

На следующем этапе работ была оптимизирована и апробирована мультиплексная ПЦР, которую проводили в трех смесях (рис. 1). Первая смесь включала 4 пары праймеров и 4 ДНК-зонда, вторая — 3, третья — 2. Разработанный мультиплексный вариант ПЦР был также оптимизирован по содержанию ионов Mg2+ (2,5 мМ MgCl2), зонда (8 пМ), прямого и обратного праймеров, концентрации которых были выше, чем в моноплексном варианте ПЦР (15—17 пМ). Реакция амплификации в формате "мультиплекс" была оптимизирована для отжига праймеров при температуре 510C.

Полученные плазмидные конструкции были также использованы для оценки эффективности прохождения ПЦР в реальном времени, для чего были приготовлены последовательные 10-кратные разведения контрольной плазмидной ДНК, несущей ви-русспецифическую ДНК-вставку. Предел чувствительности метода для исследуемых инфекционных агентов составил 1*103 геномных эквивалентов в 1 мл (рис. 2, а—в).

Оценка чувствительности и специфичности разработанного набора была проведена как в моноварианте, так и в формате "мультиплекс". В экспериментах с образцами с известной концентрацией вируса (физи-

ческий титр) нами была определена диагностическая чувствительность для вируса гриппа А и В, сезонного вируса гриппа А/ЫШ1, пандемического вируса гриппа свиного происхождения А/Ы1Ш(2009), вируса гриппа А субтипов Ы3, Ы5, которая по результатам экспериментов составляет 1х103—104 вирионов в мл (см. рис. 2, г). Таким образом, полученные значения чувствительности разрабатываемого набора реагентов отвечают требованиям, предъявляемым к тест-системам, рекомендуемым для использования в лабораторной практике.

Разрабатываемый набор реагентов на первом этапе был апробирован с использованием вирусных штам-мовизколлекцииГНЦВБ "Вектор" (вирусгриппатипаА: А/АюЫ/2/1968(Н3Ш), A/Novosibirsk/1/2009(Ы1N1), А/АкЫ/2/1968(Н3Ш), A/Ekaterinburg/01/2009(Ы1N1) v, A/Tomsk/01/2009(Ы1N1)v, A/Novosibirsk/02/2009 (Ы1Ш)у, A/Irkutsk/01/2009(Ы1N1)v, A/chicken/ Kurgan/05/2005(Ы5N1), A/garganey/Crimea/2027/2006 (Ы7Ш); вирус гриппа типа В: В/Chita/01/2010, В/ Chita/02/2010, В/Chita/03/2010, В/Chita/04/2010, В/ Chita/05/2010; штамм респираторно-синцитиального вируса Long; штамм аденовируса тип 7 Gomen. Во всех экспериментах вирусные штаммы были идентифицированы. Неспецифический сигнал отсутствовал.

Важной характеристикой разработанного набора является специфичность, которая была нами оценена эмпирически. Разработанный набор реагентов не дает положительного сигнала при проведении ПЦР с добавлением в каждую смесь 3 мкг геномной ДНК/ кДНК человека. Неспецифический сигнал отсутствовал и в экспериментах с кДНК коронавируса, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдром штамм Frankfurt, вируса герпеса человека типов 1—2, цитомегаловируса, энтеровирусами человека видов A—D. Неспецифический сигнал не был выявлен ни в одном из 15 клинических образцов, содержащих РНК энтеровирусов. Не было обнаружено неспецифических взаимодействий с ДНК/кДНК нормальной микрофлоры полости носа и ротоглотки человека при исследовании 30 смывов от условно здоровых доноров в отсутствии симптомов респираторной инфекции.

При использовании разработанного набора на-

Рис. 3. Результат ПЦР-анализа в режиме реального времени клинических образцов от пациентов с симптомами ОРВИ. В пробах № 1, 2, 3, 4, 5, 7 обнаружена РНК вируса гриппа типа А; в пробе № 15 обнаружена РНК вируса гриппа типа А/Н3; в пробах № 6, 10 обнаружена РНК вируса гриппа типа В; в пробе № 4 обнаружена РНК сезонного варианта вируса гриппа А/ШШ; в пробах № 1, 2, 3, 7 обнаружена РНК

пандемического варианта вируса гриппа А/ШШ.

ми было исследовано 50 проб, поступивших в ГНЦ ВБ "Вектор" для исследований и выделения пандемического вируса гриппа А/НШ1(2009) (рис. 3). В 29 исследованных образцах была обнаружена РНК вируса гриппа А (58%), в 4 образцах была выявлена РНК вируса гриппа В (8%). В 27 образцах из 29 положительных в тесте на грипп А был выявлен вирус пандемического гриппа А/НШ1(2009) (93%), в единичных образцах были выявлены вирус гриппа А субтипа Н3 (3,5%) и Н1 (3,5%). Ни в одном из исследованных нами образцов не было обнаружено генетического материала вируса гриппа А субтипов Н5, Н7, респираторно-синцитиального вируса и аденовируса. Этиологический агент заболевания не был установлен в 17 образцах (34%). Полученный результат в 100% случаев совпал при исследовании 50 образцов клинического материала с использованием коммерческих наборов реагентов ФБУН "ЦНИИЭ".

Таким образом, нами проведена работа по созданию набора реагентов для идентификации 4 вирусных агентов, вызывающих респираторные инфекции человека, который позволяет идентифицировать 2 типа (А и В) и 5 актуальных субтипов вируса гриппа (сезонные варианты Н1Ш и Н3№, пандемический вариант НШ1(2009), а также субтипы птичьего Н5 и Н7 вируса гриппа). Была оценена диагностическая и аналитическая чувствительности набора. Было экспериментально показано, что

разработанный набор реагентов обладает высокой специфичностью, однако уже сейчас очевидна необходимость расширения спектра определяемых вирусных агентов.

Сведения об авторах:

Сергеева Елена Игоревна (Sergeeva Elena Igorevna) — мл. науч. сотр. отдела "Коллекция микроорганизмов" ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", e-mail: esergeeva@vector.nsc.ru.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Терновой Владимир Александрович (Ternovoy Vladimir Aleksandrovich) — зав. лаб. молекулярной эпидемиологии особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", канд. биол.наук, e-mail: tern@vector.nsc.ru.

Демина Ольга Константиновна (Demina Olga Konstantinovna)

— науч. сотр. отдела "Коллекция микроорганизмов" ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", e-mail: demina@vector.nsc.ru.

Демина Анна Владимировна (Demina Anna Vladimirovna)

— науч. сотр. отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", канд.мед.наук, e-mail: Deminaanna@mail.ru.

Корнеев Денис Владимирович (Korneev Denis Vladimirovich)

— мл. науч. сотр. отдела микроскопических исследований ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", e-mail: korneev_dv@vector.nsc.ru.

Шиков Андрей Николаевич (Shikov Andrey Nicolaevich) — науч. сотр. отдела "Коллекция микроорганизмов" ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", e-mail: shikov@vector.nsc.ru.

Берилло Сания Александровна (Berillo Saniya Aleksandrovna)

— мл. науч. сотр. отдела "Коллекция микроорганизмов" ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", e-mail: berillo@vector.nsc.ru.

Агафонов Александр Петрович (Agafonov Aleksandr Petrovich) — зам. генерального директора по научной работе ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", д-р биол. наук, e-mail: agafonov@ vector.nsc.ru.

Сергеев Александр Николаевич (Sergeev Aleksandr

Nicolaevich) — ген. директор ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", д-р мед. наук, проф., e-mail: an_sergeev@vector.nsc.ru.

ЛИТЕРАТУРА

1. Bonfanti J.F., Roymans D. Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 2009; 12: 479—87.

2. Collins P.L., Murphy B.R. Proc. Am. Thorac. Soc. 2005; 2: 166— 173.

3. CramerH. Expert Opin. Biol. Ther. 2005; 5: 207—20.

4. Falsey A.R., Walsh E.E., Capellan J. et al. J. Infect. Dis. 2008; 198: 1317—26.

5. Gillim-Ross L., Subbarao K. Clin. Microbiol. Rev. 2006; 19(4): 614—36.

6. MadaanA. Drugs Future. 2008; 33: 203—5.

7. MaggonK, BarikS. Rev. Med. Virol. 2004; 14: 149—68.

8. Mahony J.B., Blackhouse G., Babwah J. et al. J. Clin. Microbiol. 2009; 47(9): 2812—7.

9. Matheson N.J., Symmonds-Abrahams M., Sheikh A. et al. Cochrane Database Syst. Rev. 2003; 3: CD002744.

10. MetzgarD, OsunaM., YingstS. et al. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 5743—52.

11. NairH, NokesD.J., GessnerB.D. et al. Lancet. 2010; 375: 1545—55.

12. Power U.F., Nguyen T.N., Rietveld E. J. Infect. Dis. 2001; 184: 1456—60.

13. Rebelo-de-AndradeH., Pereira C., GiriaM. et al. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(4): 1391—6.

14. Tang R.S., MacPhail M, Schickli J.H. et al. J. Virol. 2004; 78: 11198—207.

15. Washington C., Metzgar D., Hazbon M.H. et al. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(6): 2217—22.

16. Waye M.M.Y., Sing C.W. Pharmaceuticals. 2010; 3: 3343—54.

17. ZambonM.C. Rev. Med. Virol. 2001; 11(4): 227—41.

18. Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январь—декабрь 2010. http://75.rospotrebnadzor. ru/content/svedeniya-ob-infektsionnykh-i-parazitarnykh-zabolevaniyakh-forma-1-za-yanvar-dekabr-2011-god

Поступила 14.11.12

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF THE REALTIME PCR ASSAY FOR THE IDENTIFICATION OF VIRAL AGENTS CAUSING ACUTE RESPIRATORY INFECTIONS IN HuMANS

E. I. Sergeeva, V. A. Ternovoi, O. K. Demina, A. V. Demina, D. V. Korneev, A. N. Shikov, S. A. Beryllo, A. P. Agafonov, and A. N. Sergeev

State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

The real time PCR assay targeting influenza A and B virus, 5 subtypes of influenza A virus (seasonal H1N1, pandemic H1N1 (2009), seasonal H3N2, pathogenic for human subtypes of avian influenza H5 and H7), respiratory syncytial virus, and adenovirus was developed. The analytical sensitivity of the developed assay was 1x103 genome equivalents per ml. The diagnostic sensitivity of the method was 1*103—104 viral particles per ml. Experiments with human DNA/cDNA and viral cDNA showed a markedly high diagnostic specificity of the developed PCR assay. In the assay of the developed PCR test, 50 nasopharyngeal swab specimens were tested. The etiology was identified in 33 samples.

Key words: multiplex PCR, diagnosis of respiratory infections, influenza virus, respiratory syncytial virus, adenovirus, acute respiratory infections (ARI)

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.