CC BY
45УДК 633.63:575:632.52.577.1
ПЦР-идентификация бактерий Pantoea agglomerans
A.A. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук
A.C. ХУССЕЙН, канд. биолог. наук, Г.А. СЕЛИВАНОВА, канд. биолог. наук ФГБНУ «Всероссийский НИИ сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова» (е-mail: biotechnologiya@mail.ru)
Введение
В последние годы бактериальные заболевания сахарной свёклы стали проявляться всё чаще и при интенсивном развитии причинять огромный ущерб, приводя к большим экономическим потерям. Особо опасным является сосудистый бактериоз, вызываемый комплексом фитопатогенных бактерий родов Pseudomonas, Pectobacterium и Pantoea. Бактерия Pantoea agglomerans pv. betae в составе бактериально-грибного комплекса патогенов приводит к увяданию корнеплодов сахарной свёклы, очаговому поражению растений. Бактерии развиваются в сосудах ксилемы, нарушая транспорт воды и питательных веществ к листьям и обратный отток продуктов фотосинтеза в корнеплод, при этом выделяя токсичные для растения вещества в процессе своей жизнедеятельности. Болезнь обладает высокой вредоносностью, поскольку часть урожая сгнивает в поле, другая часть — инфицированное свекловичное сырьё — сгнивает в полевых буртах и кагатах сахарных заводов [1, 3].
Целью данной работы являлся поиск и отбор мо-лекулярно-генетических маркеров, позволяющих идентифицировать фитопатогенные микроорганизмы — штаммы бактерий Pantoea agglomerans в чистой культуре. В связи с важностью проблемы поражения сахарной свёклы бактериозами необходимо разработать комплекс мероприятий, позволяющих достоверно выявлять и осуществлять скрининг патогенных микроорганизмов молекулярно-генетическими методами.
Условия и методы исследований
В качестве материалов для исследований были использованы чистые культуры бактерий. Выделение возбудителей проводилось из сосудистых пучков и прилегающих к ним тканей потерявших тургор корнеплодов на свекловичную и картофельно-глю-козную агаризованные питательные среды и селективные среды Кинг-Б, WBC и YDC, позволяющие провести первичную идентификацию бактерий. Выделенные изоляты проверялись на патогенность методом замачивания семян сахарной свёклы в бак-
териальных суспензиях с последующим их проращиванием во влажной камере и наблюдением за ростом проростков. Изоляты бактерий, угнетающие рост проростков и вызывающие потемнение их корешков, отбирались для дальнейшего молекулярно-генетиче-ского анализа.
Для проведения экспериментов была произведена экстракция суммарной ДНК бактерий с применением 8М ацетата аммония [4, 5].
Качественный и количественный анализ ПЦР-продуктов проводился при помощи электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, в присутствии TBE буфера и бромистого этидия. Визуализация результатов происходила под УФ-лучами.
Для осуществления амплификации были подобраны следующие параметры:
— предварительная денатурация: 95 оС в течение 5 мин;
— 40 циклов: 94 оС — 60 сек; температура отжига 68 оС - 60 сек; 72 оС - 120 сек;
— финальный этап элонгации цепи: 72 оС — 10 мин.
Изоляты бактерий были протестированы с помощью
следующих видоспецифических праймеров [2, 6]:
1. PagB/F — 5, -TGCATTTGAAACTGGCAGGC — 3, PagB/R — 5, -AGCGTCAGTCTTTGTCCAGG — 3
2. PagRrt/F — 5, -ACGGTGCGTTCCGCAATA — 3, PagRrt/R — 5, -GGCGCCGGGAAAACATAC — 3
3. 8 F — 5, -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG — 3, 1525 R — 5, -ACGGCTACCTTGTTACGACTT — 3.
Результаты экспериментов и их анализ
Для идентификации штаммов фитопатогенных бактерий в чистой культуре был оптимизирован процесс выделения суммарной ДНК из их биомассы, в частности, исключено использование высокотоксичных агентов — фенол-хлороформной смеси. Известно, что фенол является высокотоксичным аллергеном. Мы исключили его применение и инактивировали белки 20%-ным додецилсульфатом натрия (SDS). Затем осаждали их 8М ацетатом аммония. Увеличено было также количество промывки супернатанта.
48 САХАР № 7 • 2017
В ходе работы проводилась амплификация ДНК-образцов трёх бактерий, выделенных из корнеплодов сахарной свёклы. Использовались три пары прайме-ров (PagRrt F/R, 8 F/1525 R и Pag В F/R). Праймер 8 F/1525 R не выявил принадлежность образцов к роду Pantoea, так как на электрофореграмме не было обнаружено ПЦР-продуктов ожидаемой длины 900 п.н.
При дальнейшем тестировании образцов было установлено: номер КП 8 характеризуется продуктом амплификации длиной 126 п.н., что соответствует ожидаемому размеру при работе с праймером PagB F/R (рис. 1).
Амплификация с видоспецифическим прайме-ром PagRrt F/R выявила у изолята под номером 2 (П2-Ю4) ампликон длиной 60 п.н., что соответствует ожидаемому размеру при работе с данным праймером (рис. 2).
Выводы
В результате молекулярно-генетических исследований модифицирован способ выделения ДНК бактерий из чистой культуры.
Апробированы и отобраны видоспецифические праймеры к Pantoea agglomerans (PagRrt2 F/R, PagB F/R), позволившие выявить два образца данных фи-топатогенов в чистой культуре. Вместе с тем данные исследования являются поисковыми и будут продолжены в плане увеличения количества изучаемого материала и используемых праймеров для подтверждения заявленных фитопатогенных микроорганизмов в чистой культуре и определения их видовой принадлежности.
Список литературы
1. Селиванова, Т.А. Методика учёта распространённости и развития сосудистого бактериоза сахарной свёклы / Г.А. Селиванова // Сахарная свёкла. — 2016.
- № 5. - С. 20-21.
2. Deletoile, A. Phylogeny and Identification of Pantoea Spesies and Typing of Pantoea agglomerans Strains by Multilocus Gene Sequencing / A. Deletoile [and oth.] // Journal of Clinical Micribiology. - 2009. - Р. 300-310.
3. Edens, D. Ferst Report of Pantoea agglomerans Causing a Leaf Blight and Bulb Rot / D. Edens, R. Gitaitis, F. Sanders // Plant Disease. - 2006. - V. 90. - № 12. -P. 1551.
4. Hussein, A.S. Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis / A.S. Hussein [and oth.] // Russian Agricultural Sciences. - 2014. - V. 40. - Issue 3. - Р. 177-178.
5. Rogers, S. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues / S. Rogers, A. Bendich // Plant Molecular Biologi. - 1985.
- V. 5. - P. 67-69.
M 1 2 3
Рис. 1. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов, полученных с помощью праймера Pag B F/R: 1 - Ш-3, 2 - П2-Ю4, 3 - КП 8, М - маркер молекулярных масс (сибэнзим) 100—3 000 п.н.
1 2 3 М
Рис. 2. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов, полученных с помощью праймера Pag Rrt2 F/R: 1 - III-3, 2 - П2-Ю4, 3 - КП 8, М - маркер молекулярных масс (сибэнзим) 100-3 000п.н.
6. Braun-Kiewnick, A. Development of species-, strain-and antibiotic biosynthesis-specific quantitative PCR assays for Pantoea agglomerans as tools for biocontrol monitoring / A. Braun-Kiewnick [and oth.] // Journal of Microbiological Methods. - 2012. - V. 90. - P. 315-320.
Аннотация. В статье приведены результаты ПЦР-анализа по подбору видоспецифических праймеров для идентификации бактерий Pantoea agglomerans. В соответствии с характеристиками используемых праймеров оптимизированы условия проведения ПЦР. С помощью PagRrt2 F/R и PagB F/R выявлены 2 образца фитопатогенов. Ключевые слова: полимеразно-цепная реакция (ПЦР), праймеры, сахарная свёкла.
Summary. In article, the results of using PCR-analysis method of selection of species-specific primers to identify Pantoea agglomerans bacteria are presented. Conditions of polymerase chain reaction conduction were optimized in concordance with characteristics of the used primers. With the PagRrt2 F/R and PagB F/R primers allowed revealing 2 samples of phytopathogens.
Keywords: polymerase chain reaction (PCR), primers, sugar beet.
№ 7 • 2017 САХАР 49
