CC BY
39УДК 633.63:575:632.52.577.1
ПЦР-идентификация гена азотфиксации nifH у Azotobacter sp.
А.А. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук (е-mail: arpnal@rambler.ru)
Н.В. БЕЗЛЕР, д-р c/х. наук
И.В. ЧЕРЕПУХИНА, канд. биолог. наук
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»
Введение
Биологическая фиксация азота играет большую роль в поддержании гомеостаза биосферы и является основным источником азота, доступного для сельскохозяйственных культур. Фиксация азота — одно из наиболее интересных проявлений жизнедеятельности микробных сообществ. Диазотрофы, как свободно-живущие, так их ассоциативные формы, встречаются в самых разных средах обитания. Микроорганизмы катализируют биологическую азотфиксацию с помощью фермента нитрогеназы, которая практически не изменилась в процессе эволюции. Нитрогеназы состоят из двух белков: динитрогеназы и динитроге-наз-редуктазы. Динитрогеназа, также называемая белком MoFe или компонентом 1, является продуктом деятельности генов т/Б и т/К. Динитрогеназ-ре-дуктаза, также называемая белком Fe или компонентом 2, является продуктом экспрессии гена т/Н [1, 2].
Разнообразие генов азотфиксации было исследовано путём амплификации фрагмента гена т/Н, который кодирует белок Fe комплекса нитрогеназы. С использованием полимеразно-цепной реакции и вырожденных олигонуклеотидных праймеров были обнаружены высококонсервативные области т/Н. Далее сегмент ДНК т/Н был амплифицирован и про-секвенирован. После проведённых исследований по выравниванию последовательностей и филогенетического анализа был разработан родоспецифичный праймер т/Н^1, позволяющий выявлять наличие гена азотфиксации, характерный именно для бактерий рода ЛгоОЬа^ег. Примечательно, что кодирующий динитрогеназ-редуктазу т/Н-ген эволюционно консервативен и часто используется для обнаружения азотфиксирующих микроорганизмов, а именно ЛгоОЬа^ег sp. в природных микробных сообществах [3, 4].
Азотобактер является свободноживущей азотфик-сирующей бактерией, которая используется в качестве биоудобрения при выращивании большинства культур. Он вызывает большой интерес у учёных, которые работают над поддержанием высокого уровня эффективного плодородия почвы. Полевые испыта-
ния показали, что при определённых условиях окружающей среды инокуляция азотобактером оказывает благоприятное воздействие на урожайность растений из-за увеличения фиксированного содержания азота в почве и микробной секреции стимулирующих гормонов, таких как гиббереллины, ауксины и цито-кинины. Лго^Ьа^ег sp. имеет очень высокую частоту дыхания, и его способность фиксировать N2 в экстремальных условиях является объектом исследований в течение многих лет [5, 6].
Внедрение молекулярно-генетических методов, в частности ПЦР-анализа, значительно облегчило изучение диазотрофов в бактериальных сообществах. Многочисленные исследования показали результативность использования различных ПЦР-праймеров, высокоспецифичных для сегментов т/Н (структурного гена, кодирующего динитрогеназ-редуктазу), для амплификации частичных последовательностей т/Н из различных образцов окружающей среды и из чистых культур диазотрофов [7—9].
Целью данной работы являлось апробирование ро-доспецифичного праймера, позволяющего выявлять ген азотфиксации в штаммах бактерий Лго^Ьа^ег sp. в чистой культуре.
Условия и методы исследований
В 2010 г. на опытном поле ВНИИСС был заложен многолетний стационарный полевой опыт с запашкой соломы озимой пшеницы и ячменя в зернопа-ропропашном севообороте с чередованием культур: пар — озимая пшеница — сахарная свёкла — ячмень. Почва опытного участка — чернозём типичный тяжелосуглинистый малогумусный на покровных лёссовидных суглинках.
Общая площадь полевого опыта составила 1209,6 м2, площадь делянки — 75,6 м2. Повторность опыта четырёхкратная. Доза внесения соломы — 4—5 т/га (при запашке соломы после уборки зерновых культур из расчёта их средней урожайности). Дополнительные компоненты (целлюлозолитический микромицет, минеральное удобрение и питательную добавку) вносили вручную непосредственно перед вспашкой.
В качестве удобрения, содержащего азот, была использована АФК из расчёта 40 кг д.в/га. В качестве питательной добавки (ПД) применяли патоку, которая была использована при разведении 1 : 1000. Расход рабочей жидкости — 200 л/га. Целлюлозолитиче-ский микромицет вносили на делянки в виде иноку-люма (344 тыс. КОЕ/м2), предварительное компостирование проводили согласно методу инфицирования почвы [10].
Схема опыта, варианты:
1 — контроль (без внесения соломы);
2 — солома озимой пшеницы и ячменя (в соответствии с севооборотом);
3 — солома + минеральное удобрение (солома + N);
4 — солома + минеральное удобрение + Humi-colafuscoatra ВНИИСС 016 + патока (солома + N + H. fuscoatra + ПД).
Почвенные образцы отбирали в посевах сахарной свёклы в мае, июле, сентябре с глубины 0—15 см. Был проведён учёт численности свободноживущих в них диазотрофов методом обрастания почвенных комочков на родоспецифичной для Azotobacter sp. агаризо-ванной среде Эшби с маннитом.
Наиболее активные штаммы были отобраны для поддержания в коллекции чистых культур и затем стали материалом для проведения молекулярно-ге-нетического анализа.
Для проведения экспериментов экстрагировалась ДНК бактерий: 2 мл суточной культуры ресуспенди-ровали в TE-буфере на водяной бане около 10 мин с дальнейшим применением 20 % SDS и 8М ацетата аммония. Полученный осадок бактериальной ДНК растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера. Концентрацию нуклеиновой кислоты определяли в 1%-м агарозном геле [11].
Для проведения ПЦР-амплификации были подобраны следующие параметры:
1) предварительная денатурация: 95 оС в течение 5 мин;
2) 40 циклов: 94 оС — 1мин; температура отжига 60 оС - 1мин; 72 оС - 60 с;
3) финальный этап элонгации цепи: 72 оС — 10 мин.
ПЦР-анализ проводили на амплификаторе Genius
(Великобритания).
Анализ ПЦР-продуктов (ампликонов) проводили при помощи электрофореза в 1,8%-м агарозном геле, в присутствии TBE буфера и бромистого этидия. Визуализация результатов происходила под УФ-лучами и фиксировалась гель-документирующей системой Vilber.
Изоляты бактерий были протестированы с помощью следующей пары праймеров [6]:
NifH-g1 F: 5/-GGTTGTGACCCGAAAGCTGA-3/
NifH-g1 R: 5/-GCGTACATGGCCATCATCTC-3/
Результаты экспериментов и их анализ
Результаты исследований показали, что доля комочков почвы, на которых были идентифицированы бактерии Ат.оМа^ег с^оососсыт, составляла 29—30 % и не менялась с глубиной. При внесении соломы их количество практически не изменилось и в среднем за вегетационный период 2018 г. составило 28—30 %. Использование дополнительного азота при запашке соломы способствовало увеличению в почве А. С^оососсыт, а доля комочков почвы с этими бактериями составила 38—47 % (рис. 1).
Максимальное их количество отмечено при использовании соломы с целлюлозолитическим микроми-цетом (НыткоЬ ^соаШ ВНИИСС 016) в среднем за вегетационный период в слое 0—15 см — 56 %, в слое 15—30 см — 55 %. Однако, несмотря на большое количество исследуемого рода диазотрофов, стоит отметить невысокую скорость их роста в сравнении с предыдущим годом исследований.
Для поддержания в коллекции чистых культур были отобраны наиболее активные штаммы, которые зафиксированы в коллекции под № 1, 2, 3. Все они были отобраны в почве варианта с использованием соломы и целлюлозолитического микромицета; № 1 и 2 выделены в июле, № 3 — в сентябре (рис. 2, 3).
В ходе работы проводилась амплификация ДНК-образцов трёх изолятов бактерий, предположительно
о/ %
60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00
2 3 0-15 см
2 3 15-30 см
Рис. 1. Изменение численности А1о(оЬа&ег с^оососсыт в почве за вегетационный период 2018 г., %: 1 — контроль, 2 — солома, 3 — солома + N, 4 — солома + N + + Ныт1со1а^соаШ+ПК
\
Л
^ н
\v53frj г
Рис. 2. Рост чистой культуры через две недели
8 САХАР № 9 • 2019
Рис. 3. Рост чистой культуры через 10 недель
относящихся к Azotobacter sp. Использовалась пара молекулярно-генетических маркеров NifH-gl F / NifH-gl R.
Амплификация с данной парой праймеров позволила обнаружить ожидаемый ампликон длиной в 400 п. н. только у одного ДНК-образца (рис. 4). Это подтверждает наличие гена азотфиксации у данного штамма, а также его принадлежность к роду Azotobacter.
Рис. 4. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов, полученных с помощью пары праймеров NifH-g1 F /NifH-g1 R.1 — 3: ДНК бактерий; К — контроль (-) (ПЦР-смесь без ДНК-образца); М — маркер молекулярных масс (сибэнзим) 100-1500 п. н.
Выводы
В результате проведённых молекулярно-генетиче-ских экспериментов апробирована пара праймеров (NifH-gl F / NifH-gl R)для обнаружения гена азотфиксации у аборигенных штаммов Azotobacter sp. в чистой культуре. Так как указанный праймер является родоспецифичным, его можно рекомендовать для предварительной опосредованной идентификации бактерий рода Azotobacter в природных бактериальных сообществах, что имеет важное практическое значение для рутинных микробиологических исследований.
Список литературы
1. Dixon, R. Genetic Regulation of Biological Nitrogen Fixation / R. Dixon, D. Kahn // Nature Microbiol (Reviews). — 2004. - Vol. 2. - Р. 621-631.
2. Rubio, Luis M. MINIREVIEW Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle / Luis M. Rubio, Paul W. Ludden // Journal of Bacteriology. - 2005. - Vol. 187. - No. 2. -Р. 405-414.
3. Betancourt, D. Characterization of Diazotrophs Containing Mo-Independent Nitrogenases, Isolated from Diverse Natural Environments / D. Betancourt [and oth.] // Environmental Microbiology. - 2008. - Vol. 74. - № 11. - Р. 3471-3480.
4. Satoko, N. Nitrogen Fixation Genes Expressed in the Symbiotic Microbial Community in the Gut of the Termite Coptotermes formosanus / N. Satoko, M. Ohkuma, T. Kudo // Microbes Environ. - 2002. - Vol. 17. - Р. 139-143.
5. Aquilanti, L. Comparison of different strategies for isolation and preliminary identification of Azotobacter from soil samples / L. Aquilantia, F. Favillib, F. Clementia // Soil Biology & Biochemistry. - 2004. - Vol. 36. - Р. 1475-1483.
6. Rajeswari, K. Molecular characterization of Azotobacter spp. nifH gene Isolated from marine source / K. Rajeswari, G.M. Kasthuri // African Journal of Biotechnology. - 2009. - Vol. 8 (24). - P. 6850-6855.
7. Church, M. Temporal Patterns of Nitrogenase Gene (nifH) Expression in the Oligotrophic North Pacific Ocean / M. Church [and oth.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol. 71. -Р. 5362-5370.
8. Charles, R. Molecular Analysis of Diazotroph Diversity in the rhizosphere of the smooth Cordgrass, Spartina alterniflora / R. Charles [and oth.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. -Vol. 66. - Р. 3814- 3822.
9. Lei, Z. Design and Application of an Oligonucleotide Microarray (nifH-Phylochip) for nifH Gene-Based Detection of Nitrogen-FixingProkaryotes//UniversityofBremen, Germany. -Thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of philosophy in (natural) science. -2004. - 185 pp.
10. Колесникова, М.В. Формирование плодородия чернозёма выщелоченного при интродукции аборигенного штамма целлюлозолитического микромицета и дополнительных компонентов при запашке соломы озимой пшеницы / М.В. Колесникова, Н.В. Безлер, Б.Л. Агапов // Агрохимия. - 2014. - № 8. - С. 17-25.
11. Налбандян, А.А. ПЦР-идентификация бактерий рода Azospirillum / А.А. Налбандян [и др.] // Сахар. - 2018. -№ 8. - С. 36-38.
Аннотация. В работе представлены результаты апробирования родоспецифичной пары праймеров NifH-g1 F / NifH-g1 R, позволивший выявить ген азотфиксации у изолятов бактерий рода Azotobacter. Выявлен ампликон длиной 400 п. н., специфичный для бактерий Azotobacter sp. Ключевые слова: полимеразно-цепная реакция (ПЦР), праймеры, Azotobacter sp.
Summary. In the work the results of approbation of the NifH-g1 F / NifH-g1 R genus-specific primers pair that have enabled determination of nitrogen-fixation gene in Azotobacter genus bacteria isolates are presented. An amplicon of 400 b. p. in length specific for Azotobacter sp. bacteria has been revealed. Keywords: polymerase chain reaction (PCR), primers, Azotobacter sp.
