CC BY
16УДК 633.63:575:632.52.577.1
ПЦР-идентификация бактерий рода Azospirillum
A.A. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук, Н.В. БЕЗЛЕР, д-р c/хнаук, М.А. ШУЛЬГИНА, Д.Н. ФЕДОРИН, канд. биолог. наук ФГБНУ «Всероссийский НИИ сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова» (е-mail: [email protected])
Введение
Одним из основных предшественников сахарной свёклы являются полноценные компоненты зерно-паропропашного севооборота — зерновые культуры. Растения зерновых культур в природных условиях существуют в ассоциации с комплексом различных полезных микроорганизмов, оказывающих положительное влияние на рост и развитие растений. Симбиотические и ассоциативные микроорганизмы способствуют эффективному потреблению растениями минеральных веществ, снабжают их витаминами и регуляторами роста и защищают от фитопатогенов и вредителей. В настоящее время бактерии, обладающие совокупностью полезных свойств, являются перспективными объектами для использования в сельскохозяйственной практике. К ним относятся ризобактерии PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), способные повысить урожайность культур в зависимости от видов растений и среды обитания. В этом отношении важное значение имеют бактерии рода AzospiriUum [1]. Представители Azospirillum sp. относятся к аэробным, грамотрицательным а-протеобактериям. Считается, что стимуляция роста растений обусловлена также фиксацией азота штаммами этих бактерий, которые способствуют накоплению азота и для последующих культур севооборота, в частности сахарной свёклы. Azospirillum sp. используются в качестве биоудобрений и биопестицидов, что в последнее время стало крайне актуальным из-за необходимости сокращения химической нагрузки на поля [2].
Идентификация бактерий только на основании морфологических, культуральных, физиолого-био-химических признаков в настоящее время считается недостаточной, поскольку под воздействием различных факторов многие виды обладают высоким уровнем фенотипической изменчивости. Молекулярно-генетические методы идентификации зарекомендовали себя как надёжные и независящие от внешних факторов. Недавние достижения в области секвени-рования ДНК облегчили обнаружение и идентификацию целевых микробов [3]. Для разработки родо-специфичных праймеров к Azospirillum sp. был применён RAPD-анализ полиморфной ДНК бактерий
и секвенирование участка универсального для всех прокариот гена 16S рРНК (рДНК). На основании проведённых исследований иностранными авторами были сконструированы три пары родоспецифичных праймеров для быстрой и надёжной идентификации изолятов Azospirillum sp. методом ПЦР. Данный метод позволяет обнаружить даже малые количества искомой бактерии [4].
Целью данной работы являлось апробирование родоспецифичных праймеров и отбор молекулярно-ге-нетического маркера, позволяющего идентифицировать микроорганизмы — штаммы бактерий Azospirillum sp. в чистой культуре. Предложенный метод послужит полезным инструментом для выделения множества аборигенных изолятов бактерий рода Azospirillum из ризопланы и ризосферы зерновых культур.
Условия и методы исследований
В качестве материалов для проведения молеку-лярно-генетического анализа были использованы чистые культуры бактерий, выделенные из ризосферы и ризопланы зерновых культур (ячмень, озимая пшеница) на родоспецифической для Azospirillum sp. агаризованной среде. Для осуществления экспериментов экстрагировалась ДНК бактерий: 2 мл суточной культуры ресуспендировали в TE-буфере на водяной бане около 10 мин с дальнейшим применением 20 % SDS и 8М ацетата аммония. Полученный осадок бактериальной ДНК растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера. Концентрацию нуклеиновой кислоты определяли в 1 % агарозном геле [5, 6].
Для проведения ПЦР-амплификации были подобраны следующие параметры:
— предварительная денатурация: 95 ОС в течение 5 минут;
— 40 циклов: 94 ОС — 60 с; температура отжига — 60 с; 72 ОС - 120 с;
— финальный этап элонгации цепи: 72 ОС — 10 мин.
Качественный и количественный анализ ПЦР-
продуктов (ампликонов) проводился при помощи электрофореза в 1,8 % агарозном геле, в присутствии TBE буфера и бромистого этидия. Визуализация результатов происходила под УФ-лучами и фиксировалась гель-документирующей системой.
- 36 САХАР № 8 • 2018
эстер & Синекс МП 9flr*
^стоимость без НДС
Изоляты бактерий были протестированы с помощью следующих трёх пар родоспецифичных праймеров [4]:
1) Az16S В^ - 5, - GCGGTAATACGAAGGGGGCK - 3,
Az16S В ^ - 5, - GTAGCACGTGTGTAGCCCAAC - 3,
2) Az16S A /F - 5, - GCGGTAATACGAAGGGGGCK - 3, Az16S A ^ - 5, - CTTGTCACCGGCAGTTCCACCAG - 3,
3) Az16S C/F - 5, - GCGGTAATACGAAGGGGGCK - 3,
Az16S C/R - 5, - CATCCCCGCCTTCCTCCGGC - 3,
Результаты экспериментов и их анализ
Для проведения молекулярно-генетических исследований была экстрагирована ДНК из бактериальной суспензии. Визуально качество выделенной ДНК оценивалось на электрофореграмме (рис. 1).
Полученная относительно чистая, не деградированная ДНК была использована в дальнейшей работе.
В ходе работы проводилась амплификация ДНК-образцов трёх изолятов бактерий, предположительно относящихся к AzospmПum sp. Использовались три пары молекулярно-генетических маркеров (Az16S-A F/R, Az16S-B F/R, Az16S-C F/R).
Амплификация с парой праймеров Az16S-B F/R не обнаружила одиночных ампликонов ожидаемой длины ни у одного образца. Пара праймеров Az16S-C F/R выявила искомый ПЦР-продукт только у одного образца. Молекулярный маркер Az16S-A F/R позволил обнаружить ампликон длиной в 640 п. н. у всех трёх ДНК-образцов (рис. 2). Это подтверждает принадлежность изучаемых бактерий к роду Azospirillum.
Выводы
В результате проведённых молекулярно-генетиче-ских экспериментов модифицирован способ выделения ДНК бактерий из чистой культуры. Применяли протокол выделения нуклеиновой кислоты, включающий в себя ресуспензию бактериальной массы в ТЕ-буфере на водяной бане.
Апробированы три пары праймеров для идентификации аборигенных штаммов Azospirillum sp. в чистой культуре. Выбран молекулярный маркер Az16S-A F/R, проявляющий наиболее высокую комплементарность к нуклеотидной последовательности консервативного участка гена 16S рРНК, характерного для представителей данного рода. Указанный праймер рекомендуется для идентификации бактерий рода Azospirillum, что имеет важное теоретическое и практическое значение для микробиологических исследований.
Список литературы
1. Bashan, ZAzospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural and environmental advances / Y. Bashan, G. Holguin, L. De-Bashan // Can J Microbiol. - 2004. - V. 50. - P. 521 - 577.
2. Fukami, J. Azospirillum: benefits that go far beyond biological nitrogen fixation / J. Fukami, P. Cerezini, M. Hungria // AMB Express. - 2018. - V. 8. - P. 73-85.
3. Suaad, S. Microbiological and molecular identification of bacterial species isolated from nasal and oropharyngeal mucosa of fuel workers in Riyadh, Saudi Arabia / S. Suaad // Saudi J of Biological Sciences. - 2017. - V. 24. - № 6. -P. 1281-1287.
4. Shime-Hattori, A. A rapid and simple PCR method for identifying isolates of the genus Azospirillum within populations of rhizosphere bacteria / A. Shime-Hattori [and oth.] // Journal of Applied Microbiology. - 2011. -V. 111. - P. 915-924.
5. Mahuku, G.S. A simple extraction method suitable for PCR-based analysis of plant, fungal, and bacterial DNA / G.S. Mahuku // Plant Mol. Biol. Rep. - 2004. -Vol. 22. - Pp. 71-81.
6. Hussein, A.S. Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis / A.S. Hussein [and oth.] // Russian Agricultural Sciences. - 2014. - V. 40. - Issue 3. - Р. 177-178.
Рис. 1. Электрофореграмма образцов ДНК бактерий
Дорожки (образцы сахарной свёклы): 1-3 - ДНК по 5мкл.; 1-3 - ДНК по 3 мкл
Рис. 2. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов, полученных с помощью праймеров Az16S-CГ/Я, Az16S-BГ/Я, Az16S-A Г/Я. 1-3: ДНК бактерий. М-маркер молекулярных масс (Сибэнзим) 100-1500 п. н.
Аннотация. В работе представлены результаты апробирования и отбора родоспецифичной пары праймеров Az16S-A F / Az16S-A R, эффективной для надёжной идентификации изолятов бактерий рода Azospirillum. Выявлен ампликон длиной 640 п. н., специфичный для бактерий Azospirillum sp.
Ключевые слова: полимеразно-цепная реакция (ПЦР), праймеры, Azospirillum. Summary. In the work, the results of approbation and selection of the genus-specifc primers pair Az16S-A F / Az16S-A R that is effective for reliable identification of Azospirillum genus bacteria isolates are presented. An amplicon of 640 b. p. in length specific for Azospirillum sp. bacteria has been revealed. Keywords: polymerase chain reaction (PCR), primers, Azospirillum.
№ 8 • 2018 САХАР
37
