CC BY
40УДК: 632.3.01/.08
Ожог листьев и гниль корнеплодов сахарной свёклы, вызванные Pseudomonas syringae pv. aptata в Российской Федерации
A.Н. ИГНАТОВ, д-р биолог. наук, зам. ген. директора по научной работе (e-mail: a.ignatov@phytoengineering.ru) Ю.С. ПАНЫЧЕВА, аспирант (e-mail: j.panycheva@phytoengineering.ru)
М.В. ВОРОНИНА, научн. сотрудник (e-mail: m.khodykina@phytoengineering.ru) ООО Исследовательский центр «ФитоИнженерия»
B.О. ГРЕСИС, сотрудник
ООО «Ариста ЛайфСайенс Рус» (e-mail: Valeriya.Gresis@arysta.com) Е.Н. ПАКИНА, канд. биолог. наук, доцент (e-mail: e-pakina@yandex.ru) ФГАОУВО «Российский университет дружбы народов»
По прогнозу на 2017/18 г., в мире будет произведено около 185 млн т сахара. Среди крупнейших мировых производителей сахара из сахарной свёклы Российская Федерация занимает 9-е место*. В последние годы в нашей стране вместе с ростом валовых сборов из-за высокой насыщенности севооборотов сахарной свёклы усиливается вредоносность болезней, в том числе вызываемых бактериями, поражающими свёклу. Бактериальные патогены вызывают болезни различной этиологии: от «корончатого галла» («рака») корней до листовой пятнистости. В южных регионах распространилось новое заболевание сахарной свёклы (Beta vulgaris var. saccharifera L), которое приводит к поражению листового аппарата и корнеплодов растений, а затем к гибели растений в поле (Селиванова, 2013). В связи с усилением вредоносности бактериальных болезней сахарной свёклы необходима точная идентификация патогенов и разработка мер борьбы, ограничивающих распространение и обеспечивающих снижение ущерба от бактериальных болезней.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы 20 изо-лятов фитопатогенных псевдомо-
* (http://мниап.рф/analytics/Mirovoj-rynok-sahara/)
над были выделены в 2017—2018 гг. сотрудниками ИЦ «ФитоИнженерия» из поражённых растений сахарной и столовой свёклы в Краснодарском крае и Московской области.
Выделение ДНК. Чистые культуры бактерий культивировали на агаризованной среде Кинга Б (Lelliott et al., 1966). Препараты суммарной клеточной ДНК выделяли из свежих культур на вторые-третьи сутки роста с использованием метода сорбции на магнитных частицах (набор «Минипреп», ООО «Силекс», Россия) согласно инструкции производителя.
Фенотипический анализ. Морфологические, физиологические и биохимические характеристики бактериальных культур определяли, руководствуясь методами фе-нотипической дифференциации рода Pseudomonas (тесты LOPAT и др.), описанными в руководстве по идентификации фитопатоген-ных бактерий (Schaad et al., 2001).
ПЦР-амплификацию и секвени-рование для MLST-анализа проводили с использованием ранее разработанных праймеров (см. табл.) для 20 представительных штаммов Pseudomonas syringae pv. aptata по методу Hwang et al. (2005). Темпе-ратурно-временной профиль реакции был следующим: первоначальная денатурация при 94 оС — 2 мин; затем 30 циклов: 94 оС —
30 с, 55,7 оС или 61 оС - 30 с, 72 оС -1 мин; окончательная элонгация — 5 мин при 72 оС. ПЦР-фрагменты выявляли при помощи электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3130xl ABI («Applied Biosystems», США) согласно инструкции производителя. Каждая последовательность была секвенирована как минимум в двух повторностях в обоих направлениях для каждого штамма.
Анализ нуклеотидных последовательностей. Первичный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, полученных в данной работе и представленных в базе данных ГенБанк, проведён при помощи программы NCBI BLAST (Zhang et al., 2000). Выравнивание последовательностей проводили с использованием программы CLUSTALW 1.75v. Software (Thompson et al., 1994). Филогенетические деревья на основе каждого проанализированного гена были построены в программе MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 и version 7.0) (Tamura et al. 2013; Kumar et al. 2016) при помощи метода объединения ближайших соседей (NJ) (Rzetsky A., Nei 1992). Статистическую значимость порядка ветвления
14 САХАР № 7 • 2018
F^O ЩЕЛКОВО IfQrOTIIUlf RPH Для обработки сахарной свеклы в период вегетации, борьбы
ПЩП ДГРПУ1/1М ПШ ИI МгВПу Dill с кагатными гнилями на корнеплодах при закладке на хранение
AI гили IVI зоо г/л бензойной кислоты в виде органической соли ЗйШ.Шли c-J'jÜ чфктопц
россиискии аргумент защиты r J J^ j-J J
полученных деревьев рассчитывали с использованием бутстрэп-анализа путём построения 1 тыс. альтернативных реплик, или деревьев (Felsenstein J., 1985).
Результаты
Симптомы заболевания и экономическое значение в Российской Федерации. Симптомы бактериоза проявляются на всех надземных частях растений сахарной свёклы: округлые или продолговатые некротические пятна на листьях, продолговатые некрозы на черешках и побурение сосудов ксилемы и ожоги на листьях между поражёнными жилками. Патоген проникает из сосудов поражённых листьев в корнеплод, вызывая слабое побурение сосудистых пучков. В большинстве случаев заражение начинается с места откладки яиц долгоно-сиком-стеблеедом (Lixus subtilis Sturm) и зоны питания вышедших личинок этого вредителя. Частота инфицирования составляет не более 10 % от общего числа инфицированных вредителем черешков растения, что, возможно, указывает на неперсистентность возбудителя в организме вредителя. Также вероятно, что возбудитель бактериоза проникает в место прокола спо-
Праймеры, использованные для мультилокусного генотипирования штаммов российской
популяции Pseudomonas syringae по Hwang et al. (2005)
Ген Праймер Последовательность олигонуклеотида '5—3' ПЦР-фрагмент, п.о. Температура отжига, °С
gapA gapAF CCG GCS GAR CTG CCS TGG 633 57,5
gapAR GTG TGR TTG GCR TCG AAR ATC GA
gltA gltAF GCC TCB TGC GAG TCG AAG ATC ACC 980 57,8
gltAR CGA AGA TCA CGG TGA ACA TGC TGG
gyrB gyrBF TCB GCR GCV GAR GTS ATC ATG AC 780 55,7
gyrBR TTG TCY TTG GTC TGS GAG CTG AA
rpoD rpoDF CAG GTG GAA GAC ATC ATC CGC ATG 1098 56,4
rpoDR CCG ATG TTG CCT TCC TGG ATC AG
верхности листа, где присутствует в виде эпифитной популяции.
Пятна на листьях круглой или неправильной формы, от 5 до 20 мм в диаметре. Цвет пятен — от светло- до тёмно-коричневого. Поражения листьев могут быть окружены тёмной каймой или пропитанным водой кольцом (рис. 1а). Симптомы бактериальной листовой пятнистости напоминают церкоспороз (Cercospora beticola Sacc.), а симптомы ожога — начальное развитие фузариозно-го увядания. Сходство этих симптомов с поражением растений Fusarium oxysporum, F. acuminatum, F. avenaceum, F. solani и F. moniliforme (рис. 1б) (Hanson, Jacobsen, 2009) на сахарной свёкле может частично
а б
Рис. 1. Симптомы поражения сахарной свёклы в поле возбудителем бактериального ожога Pseudomonas syringaepv. aptata (а) и фузариоза (б). Рисунок 1б приведён с разрешения автора — Х. Шварца (Университет Колорадо, Bugwood. org)
объяснить, почему бактериальный ожог не был идентифицирован в России ранее. Заметные потери от этого заболевания были описаны практически ежегодно начиная с 2010 г. В ряде хозяйств Краснодарского края в 2017 г. отмечалось поражение не менее 7 % растений в июне и более 50 % растений к концу вегетации в августе.
Патоген. Выделенные из поражённых растений (листьев, черешков листьев и корнеплодов) на начальном этапе развития заболевания бактерии в подавляющем большинстве (более 90 %) были представлены псевдомонадами (Pseudomonas spp.), вирулентными для сахарной и столовой свёклы, подсолнечника, тыквы, дыни, кабачка, фасоли, баклажана и картофеля. Результаты анализа физиологических признаков 20 штаммов возбудителя, выделенных в основном в Краснодарском крае в 2017 г. (17 шт.) и в Московской области в 2018 г. (3 шт.) соответствовали признакам Pseudomonas syringae pv. aptata. Как известно, этот вид включает в себя как флуоресцирующие, так и нефлуоресцирующие штаммы (Bultreys et al., 2001).
Все полученные в Краснодаре штаммы были нефлуоресцирующие на среде Кинга Б, а в Московской области — наоборот, флуоресцирующие. Все штаммы вызвали сверхчувствительную реакцию на табаке, гидролизовали эску-лин, оксидазо-отрицательными, аргинин-дегидролаза — отрицательными, леван-положительные.
№ 7 • 2018 САХАР
15
CVS
controlled vegetation system
СИСТЕМА УПРАВЛЕНИЯ ВЕГЕТАЦИЕИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ: эффективные ХСЗР, агрохимикаты, высококачественные семена, полный цикл агросопровождения
m ЩЕЛКОВО
Ыу агрохим
www.betaren.ru
3-3-1 2-8-1 2018-7 2-3-4
2-7-1 2-1-1
HG000141.1 Psyringae pv. syringae strain Ю 959 KM282358.1 Psyringae pv. aptata strain P31 KM282361.1 Psyringae pv. aptata strain P50
3-1-4 2-3-5
KM282356.1 Psyringae pv. aptata strain P18 2018-4 98
_82jKX571937.1 Psyringae pv. aptata strain 17-1 I KX571936.1 Psyringae pv. aptata strain NC
I Psyringae pv. aptata s
2018-1
KM282357.1 Psyringae pv. aptata strain P26
2-1-5
2-4-1
2-1-4
KM282360.1 Psyringae pv. aptata strain P49 KM282362.1 Psyringae pv. aptata strain P52 2-1-2 2-1-7 2-3-1
KM282359.1 Psyringae pv. aptata strain P40
2-4-4
AY610698.1 Psyringae pv. aptata 601
3-1-1 3-2-4
NCPPB3539
I KM282355.1 Psyringae pv. aptata strain P12 3-2-1
■ AY610697.1 Psyringae pv. aptata G733
-CP008742 1 P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335
0,001
Рис. 2. Филогенетическое дерево 34 последовательностей гена gltA (611 нуклеотидов) включая 20 российских штаммов вида P. syringae и 14 типовых штаммов бактерий вида Pseudomonas syringae c использованием алгоритма ME. Цифрами указана статистическая значимость порядка ветвления (%), определённая с помощью бутстрэп-анализа 1 тыс. альтернативных деревьев, в анализе использовали 759 нуклеотидов. Штаммы с 2-1-2 по 3-2-4 выделены в Краснодарском крае, штаммы 2018-1 по 2018-7 — в Московской области
Колонии на среде YDC были серо-белые, круглые, в форме яичницы-глазуньи. Примерно 50 % штаммов обладали слабой пектолити-ческой активностью на ломтиках картофеля или на среде с пектатом натрия. В целом штаммы принадлежали группе А (P. syringae) по схеме LOPAT (Lelliott et al., 1966).
Для молекулярной идентификации бактерий были амплифи-цированы фрагменты генов gapA, gltA, gyrB, и rpoD длиной около 500 п. о., как было описано ранее (Hwang et al., 2005; Dong et al., 2011) и секвенированы. Последовательности генов для 20 штаммов были высокогомологичны, и лишь незначительно отличались от типовых штаммов этого вида. Поиск гомологов в Генбанке при помощи программы BLASTn 2.3.1 выявил, что все последовательности имели 99-100%-ное сходство с соответствующими генами P. syringae pv. aptata (str. DSM 50252) (рис. 2).
Патовариант Pseudomonas syringae pv. aptata входит в филогруппу 2 (подгруппа 2b) вида P. syringae, который включает в себя наибольшее число штаммов, выделяемых из самых разных мест обитания. В группу входят также патовары P. s. pv. aceris, P. s. pv. atrofaciens, P. s. pv. avellanae, P. s. pv. coryli, P. s. рv. dysoxyli, P. s. pv japónica, P. s. pv. lapsa, P. s. pv papulans, P. s. pv pisi, P. s. pv. solidagae, P. s. syringae и три генетические подгруппы (клады) 2a, 2b и 2c, описанные ранее (Berge et al., 2014). В состав подгруппы 2b входят типовые штаммы таких распространённых фитопатоге-нов, как P. syringae pv. syringae, P. s. pv. atrofaciens. В целом штаммы филогруппы 2 отличаются наивысшей частотой проявления РСЧ на растениях табака, поражения проростков пшеницы и подсолнечника, синтеза сиринготок-сина. В России данная филогруп-па представляет более 56 % всех изученных штаммов, выделенных из зернобобовых, подсолнечника, зерновых злаков, огурца и винограда (Игнатов, не опубликовано).
Заражение растений сахарной свёклы Pseudomonas syringae pv. aptata в качестве первичного патогена вызывает быстрое накопление вторичной патогенной и сапрофитной микрофлоры, в том числе представленной видами Pectobacterium carotovorum, Pseudomonas marginalis, Bacillus mesentericus и Pantoea agglomerans, описанных ранее как возбудители сосудистого бактериоза сахарной свёклы (Селиванова, 2013).
Распространение болезни в мире. Распространение болезней растений (свёклы, подсолнечника, тыквенных культур), вызываемых Pseudomonas syringae pv. Aptata, было отмечено во Франции в 1995-1997 гг. (Morris et al., 2000). В Сербии с 2013 г. в провинции Воеводина заболевание наблюдается на полях сахарной свёклы с встречаемостью от 0,1 до 40 % (Stojsin et al., 2015). В ноябре 2015 г. типичные симптомы бактериального ожога зафиксированы на листьях растений сахарной свёклы в штате Орегон, США (Arabiat et al., 2016).
В декабре 2012 г. отмечена вспышка болезни штате Джорджия (США), причём заболеванием были охвачены до 35 % растений в поле в декабре 2012 г. примерно в 35 % случаев (Dutta et al., 2014). С 1999-го по 2003 г. этот патоген вызывал массовое заболевание мангольда (Beta vulgaris subsp. cicla) в долине Салинас в Калифорнии (США) (Koike et al., 2003).
Хотя бактериальный ожог сахарной свёклы и бактериальная пятнистость тыквенных культур, вызванные P. syringae pv. Aptata, встречаются во многих странах, в Российской Федерации патоген вызывает потери в первую очередь из-за неизвестности возбудителя и отсутствия эффективных мер борьбы. Во вторую очередь, заболевание сахарной свёклы распространено в регионе, где интенсивно выращивают тыквенные культуры и подсолнечник — растения-хозяева для P. syringae pv. aptata. Фитопатогенные бактерии обычно выживают в почве в непе-регнивших растительных остатках
16 САХАР № 7 • 2018
ЩЕЛКОВО IfQrOTIIUlf RPH Для обработки сахарной свеклы в период вегетации, борьбы
ПЩП ДГРПУИМ ПШ ИI МгВПу Dill с кагатными гнилями на корнеплодах при закладке на хранение
AI гили IVI зоо г/л бензойной кислоты в виде органической соли ЗйШ.Шли c-J'jÜ чфктопц
россиискии аргумент защиты r J J^ j-J J
и, таким образом, совместное использование в севообороте подсолнечника и сахарной свёклы приводит к накоплению инфекции. Неоднократно бактерии P. syringae pv. aptata выделяли также из зерновых культур (Maraite, Weyns 1997). В последнюю очередь, семена сахарной свёклы не тестируют на заражённость этим патогеном, а фунгициды-протравители не защищают всходы от семенной бактериальной инфекции или раннего заражения от других источников. Проведённый нами скрининг разрешённых для использования на сахарной свёкле пестицидов пока не выявил веществ, эффективных против бактерии P. syringae pv. aptata (Ю. Па-нычева, не опубликовано).
Известно, что Pseudomonas syringae pv. aptata сохраняется в поливной воде, которая также может служить источником первичного заражения даже в отсутствие других причин (Riffaud and Morris, 2002). Кроме того, установленный нами факт заражения растений Pseudomonas syringae pv. aptata при откладке яиц свёкловичным долгоносиком-стеблеедом Lixus subtilis Sturm (Игнатов и др., не опубликовано) требует дальнейшего изучения источников заражения вектора, и его выживаемости в заражённом состоянии в течение зимнего и летнего сезонов.
В завершение мы провели оценку устойчивости 54 образцов сахарной свёклы к патогену и установили, что при низких концентрациях инокулюма патогена многие изучаемые генотипы сахарной свёклы были устойчивы и средне-восприимчивы, что даёт надежду на использование генетической устойчивости к новому заболеванию (Панычева, 2017).
Список литературы
1. http://мниап.рф/analytics/Mirovoj-rynok-sahara/ Дата обращения 22.12.2017.
2. Панычева, Ю.С. Селекция растений сахарной свёклы на устойчивость к бактериозам: проблемы и пути решения // Матер.
Междунар. научно-практич. конф. «Проблемы экологии и сельское хозяйство в XXI веке», посв. 130-летию со дня рождения Н.И. Вавилова. Россия, Большие Вязёмы, 21-22 сентября 2017 г. - С. 56-61.
3. Селиванова, Г.А. Причины широкого распространения корневых гнилей в ЦЧР / Сахарная свёкла. - 2013. - № 5. - С. 27-30.
4. Arabiat, S. First Report of Pseudomonas syringae pv. aptata Causing Bacterial Blight of Sugar Beet (Beta vulgaris) in Oregon / S. Arabiat [and oth.] // Plant Disease. - 2016. -V. 100. - № 11. - P. 2334.
5. Berge, O. A user's guide to a data base of the diversity of Pseudomonas syringae and its application to classifying strains in this phylogenetic complex / O. Berge [and oth.] // PLoS One. - 2014. - V. 3. - № 9. -P. e10554720.
6. Dong, Q. The microbial communities in male first catch urine are highly similar to those in paired urethral swab specimens / Q. Dong [and oth.] // PloS one. - 2011. -V. 6. - № 5. - e19709.
7. Dutta, B. First report of bacterial blight of sugar beet caused by Pseudomonas syringae pv. aptata in Georgia, USA / B. Dutta [and oth.] // Plant Disease. - 2014. - V. 98. - № 10. -P. 1423.
8. Hanson, L.E. Fusarium yellows / L.E. Hanson, B.J. Jacobsen // Compendium of Beet Diseases and Pests, 2nd ed. R.M. Harveson, L.E. Hanson, and G.L. Hein, eds. American Phytopathological Society, St. Paul, MN. - 2009. - С. 28-29.
9. Hwang, M.S. / M.S. Hwang [and oth.] // Appl Environ Microbiol. - 2005. - V. 71. -№ 9. - P. 5182-5191.
10. Koike, S.T. First Report of Bacterial Leaf Spot of Swiss Chard Caused by Pseudomonas syringae pv. aptata in California / S.T. Koike [and oth.] // Plant Disease. - 2003. - V. 87. -№ 11. - P. 1,397.2.
11. Lelliott, R.A. A Determinative Scheme for the Fluorescent Plant Pathogenic
Pseudomonads / R.A. Lelliott, E. Billing, A.C. Hayward // Journal of Applied Bacteriology. - 1966. - № 29. - P. 470-489.
12. Maraite, H. Pseudomonas syringae pv. aptata and pv. atrofaciens, specific pathovars or members of pv. syringae? / H. Maraite, J. Weyns // Pseudomonas syringae pathovars and related pathogens. - Springer Netherlands.
- 1997. - C. 515-520.
13. Morris, C.E. The relationship of host range, physiology, and genotype to virulence on cantaloupe in Pseudomonas syringae from cantaloupe blight epidemics in France / C.E. Morris [and oth.] // Phytopathology. -2000. - V. 90. - P. 636-646.
14. Riffaud, C.M.-H. Detection of Pseudomonas syringae pv. aptata in Irrigation Water Retention Basins by Immunofluorescence Colony-staining /
C.M.-H. Riffaud, C.E. Morris // European Journal of Plant Pathology. - 2002. - V. 108. -№ 6. - P. 539-545.
15. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. 3rd edition. N.W. Schaad, J.B. Jones, W. Chun [editors] // APS Press, St. Paul MN. - 2001. - P. 151-174.
16. Stojsin, V. First Report of Pseudomonas syringae pv. aptata Causing Bacterial Leaf Spot on Sugar Beet in Serbia / V. Stojsin, J. Balaz,
D. Budakov // Plant Disease. - 2015. - V. 99.
- № 22. - P. 281.
17. Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences / Z. Zhang [and oth.]. -J Comput Biol 2000; 7 (1-2):203-14.
18. Thompson, J.D. CLUSTAL WP / J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson // Nucl Acids res. - 1994. - V. 22. - P. 4673-4680.
19. Tamura, K. / K. Tamura [and oth.] // Molecular Biology and Evolution P. - 2013. -V. 30. - P. 2725-2729.
20. Rzetsky, A.. / A. Rzetsky, M. Nei // Mol. Biol. Evol. - 1992. - V. 9. - P. 945-967.
21. Kumar, S. / S. Kumar, K. Tamura, M. Nei // Briefings in Bioinformatics. - 2004. -V. 5. - P. 150-163.
Аннотация. С начала 2010-х гг. бактериозы сахарной свёклы стали важной причиной потерь урожая в южных регионах Российской Федерации. Впервые в России была идентифицирована группа штаммов Pseudomonas syringae pv. aptata. Для изучения эпидемиологии этого заболевания и разработки стратегий борьбы с бактериальными болезнями мы выявили источники инфекции, факторы, способствующие развитию заболевания, оценили устойчивость бактерий к бактерицидам и источники устойчивости к болезни среди сортов сахарной свёклы. На основе наших наблюдений и описания вспышек этого заболевания в других странах мира мы представляем обзор факторов, важных для развития эпифитотий, и анализ потенциальной эффективности различных стратегий борьбы с ним.
Ключевые слова: сахарная свёкла; бактериозы, диагностика, вредоносность. Summary. Since the early 2010's bacterial blight and root rot of sugar beet has emerged as an important disease of the crop in Russian Federation, particularly in the southern regions. The pathogen was identified as Pseudomonas syringae pv. aptata. To investigate the epidemiology of this disease and to develop disease control strategies, we have attempted to identify sources of inoculum in the field, factors contributing to the explosive development of the disease, resistance of the bacterium to pesticides, and sources of disease resistance in Beta vulgaris. Based on our observations and on the description of possible outbreaks of this disease elsewhere in the world, we report here a hypothetical scenario of the critical factors triggering disease development and of the potential efficiency of different control strategies. Keywords: sugar beet; bacterial diseases, diagnostics, economic losses.
№ 7 • 2018 САХАР 17
СИСТЕМА УПРАВЛЕНИЯ ВЕГЕТАЦИЕЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ: эффективные ХСЗР, [Щ ЩЕЛКОВО
W агрохимикаты, высококачественные семена, полный цикл агросопровождения АГРОХИМ
controlled vegetation system WWW.betaren.rU
