CC BY
151
ФАРМАКОЛОГИЯ
УДК 619:615.28
Противовирусная активность нового химического соединения
Т.И. Глотова1, В.Н. Сильников2, Л.С. Королева2, О.В. Кунгурцева, В.Л. Тихонов, А.Г. Глотов
1 ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии (Новосибирск).
2 ГНУ Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).
Ключевые слова: вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек, культура клеток, противовирусная активность, химическое соединение, цитотоксичность Сокращения: ВД-БС — вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек, ВИЭВ — Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, ИРТ — инфекционный ринотрахеит, КРС — крупный рогатый скот, КСТ — перевиваемая культура клеток коронарных сосудов теленка, МПК — максимально переносимая концентрация, ПГ-3 — парагрипп-3, ТЦД — тканевая цитопатическая доза, ЦТД — цитотоксическое действие
Введение
Актуальной проблемой современного животноводства являются массовые респираторные болезни молодняка КРС, причиняющие значительный экономический ущерб. Первопричиной их возникновения у 90 % телят служат вирусы, которые, вызывая инфекционный процесс в макроорганизме, создают оптимальные условия для жизнедеятельности в нем бактерий, что приводит к осложнению вирусного заболевания [2, 4, 6_8].
Наибольшее значение в патологии органов дыхания у телят имеют возбудители ИРТ, ВД-БС, ПГ-3 и респираторно-синцитиальной инфекции. В инфекционном процессе могут участвовать также адено- и коронави-русы КРС. Вовлечение возбудителей этих болезней в полиэтиологический комплекс респираторных болезней приводит к значительному усилению их тяжести, поскольку вирусы, обладая иммуносупрессивным свойством, могут потенциировать течение многих респираторных болезней телят.
В настоящее время в качестве мероприятий против данных болезней чаще всего используют вакцинацию или выявление и уничтожение инфицированных животных. Одно из новых направлений в борьбе с вирусными болезнями — использование средств химиотерапии, направленное на подавление репродукции вируса в организме и сокращение частоты и длительности выделения его во внешнюю среду, а также применение противовирусных препаратов различных классов для профилактики и лечения больных животных [3].
Цель исследования
Расширение спектра противовирусных препаратов за счет синтеза нового химического соединения (поиск и отработка его получения).
Материалы и методы
Новое химическое соединение синтезировали по разработанной нами методике с учетом очередности смешения объемов и концентрации реакционных смесей, а также температурного режима.
Токсичность препаратов определяли в условиях in vitro на КСТ (ВИЭВ) в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [5]. Для этого готовили 10-кратные разведения препаратов в культуральной среде от 1000 до 0,001 мкг/мл, которые вносили в двухсуточный монослой культуры клеток КСТ, выращенной микрометодом в 96-луночных планшетах.
На одно разведение каждого препарата использовали 4 лунки с монослоем культуры клеток. Цитотоксическое действие препаратов на клетки учитывали по степени изменения монослоя при наблюдении в течение 3 суток.
Все опыты проводили в трехкратной повторности, для статистической обработки применяли общепринятые методы [1].
Противовирусную активность нового химического соединения определяли в отношении возбудителя ВД-БС КРС, относящегося к РНК-содержащим вирусам рода Pestivirus семейства Flaviviridae (штамм ВК-1). Монослой культуры клеток КСТ заражали вирусом в дозе 1_10 ТЦД/кл., и через 1,5 ч отмывали его пи-
тательной средой без сыворотки крови и вносили препарат в максимально нетоксичной дозе для культуры КСТ, в контроле добавляли питательную среду
Титры вируса определяли микрометодом в 96-луноч-ных планшетах с клетками КСТ с использованием не менее 4 параллельных рядов и выражали в ТЦД5о/о,1мл.
Результаты
Новое химическое соединение синтезировали по следующей схеме: к раствору 1,12-додекандиамина (2,3 ммоль, 0,46 г) и этилдиизопропиламина (5,1 ммоль,
0,87 мл) в 10 мл этилацетата добавляли при перемешивании раствор N-гидроксисукцинимидного эфира Na, ^“-ди-трет-бутилоксикарбонил^-гистидина (5,1 ммоль, 2,3 г) в 5 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивали 24 ч при 22 0С. Затем добавляли N^-диме-тилэтилендиамин (1 ммоль, 110 мкл) и перемешивали 30 мин. Реакционную смесь промывали последовательно 2%-м раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20), насыщенным раствором NaHCO3 (20) и водой (20 мл). Органический слой сушили над безводным Na2SO4. Растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в смеси ТФУ:СН2С12=1:1 (5 мл) и выдерживали реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре. Растворитель и ТФУ удаляли в вакууме, остаток упаривали с этанолом (3 x 10 мл). Выход трифторацетата ^№-бис^-гистидил-1,12-додекандиамина 0,81г, 37,7 %.
Данные 'Н ЯМР-спектра для трифторацетата ^№-бис-L-гистидил-1,12-додекандиамина (D2O) 5, м.д. (J/Гц): 1,61 (м, 4Н, -O-CH2(CH2)2CH2O-); 1,71 (м, 4Н, -NH-CH2CH2 CH2O-); 2,87-3,12 (м, 4H, His-CH-СШ); 3,20 (м, 4H, -NH-CHH; 4,03 (т, 2H, His-CH, J = 7,3); 7,27 (c, 2H, CHIm);
Т.И. Глотова В.Н. Сильников, Л.С. Королева, О.В. Кунгурцева, В.Л. Тихонов, А.Г. Глотов
8,56 (с, 2Н, СН1т). ESI-MS, т^ найдено 475,6 [М + Н]+, вычислено 474,64. Элементный анализ: найдено С — 41,01, Н — 4,67, F — 24,80, N — 11,90. С32Н4^12^010. Вычислено С — 41,29; Н — 4,98, F — 25,49; N — 12,04.
Исходя из метода синтеза, данных элементного анализа, 1Н ЯМР и ЕБ1 масспектроскопии полученному соединению приписана следующая структурная формула:
Чтобы определить влияние условий и сроков хранения полученного химического соединения на стабильность его состава, соединение хранили в бытовом холодильнике при -4 ± 2 оС и при комнатной температуре 20 ± 2 оС в течение 2 лет (срок наблюдения) с последующим проведением элементного анализа.
Периодичность исследований — один раз в 3 мес. В результате проведенного анализа не отмечено отклонений в химическом составе препарата.
Цитотоксичность соединения оценивали путем добавления его разведений в среде Игла МЕМ к выращенному монослою перевиваемой клеточной культуры КСТ в лунки 96-луночного планшета (Costar) до конечных концентраций 39,06...5000,0 мкг/мл (по четыре лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37оС в СО2-инкубаторе в течение 3 сут.
Токсичность препарата оценивали по четырехкрестовой системе, анализируя морфологию клеток и целостность монослоя при микроскопировании в инвертированном микроскопе.
Определение токсичности химического соединения в культуре клеток КСТ
Доза препарата ЦТД
5 мг/мл + + + +
2,5 мг/мл + + + +
1,25 мг/мл + + + +
625,0 мкг/мл + + + +
312,5 мкг/мл - + - +
156,25 мкг/мл
78,125 мкг/мл
39,06 мкг/мл
Минимальная нетоксичная доза химического соединения для культуры клеток КСТ составляет 156,25 мкг/мл. Учитывая результаты определения нетоксичной дозы, рассчитали МПК препарата для культуры клеток КСТ, которая составила 78,125 мкг/мл. За МПК принимали 1/2 дозы, при которой отсутствовало цитопатическое действие вещества.
Для оценки противовирусного действия нового химического соединения культуру клеток КСТ заражали вирусом ВД-БС КРС (штамм «ВК-1») в дозе не менее
1__10 ТЦД/кл. Через 1,5 ч после заражения в лунки с
культурой клеток вносили химическое соединение в дозе 78,0 ± 1,0 мкг/мл (опыт) или разводящую питательную среду (контроль). Культивировали при 37 оС в тече-
ние 72 ч, после чего вируссодержащую суспензию титровали, чтобы определить инфекционную активность вируса ВД-БС КРС.
Противовирусный эффект препарата рассчитывали по разнице инфекционных активностей вируса в контрольных и опытных образцах и выражали в ^ снижения титров вируса. В каждом опыте проводили дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозы препарата.
Инфекционный титр вируса ВД-БС КРС определяли микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах с культурой клеток КСТ с использованием не менее четырех параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в ТЦД5о/о. Разница титра вируса в опытных и контрольных образцах более чем в 2 ^ТЦД50/мл свидетельствовала о противовирусной активности синтезированного нами химического соединения.
В результате проведенных исследований установлено, что новое химическое соединение в значительной степени (на 2,08 ^ ТЦД50/мл) подавляет инфекционную активность вируса ВД-БС КРС. Снижение титра вируса было достоверным (более 2 ^ ТЦД50/мл) при внесении препарата через 1,5 ч после заражения культуры клеток.
Чтобы оценить влияние сроков хранения на показатели противовирусной активности химического соединения, его хранили в бытовом холодильнике при -4 ± 2 оС и при комнатной температуре 20 ± 2 оС в течение 2 лет (срок наблюдения). С периодичностью один раз в 6 мес оценивали его противовирусную активность (табл.).
Определение влияния сроков хранения химического соединения на его противовирусную активность
Срок хранения, Титр вируса (lg ТЦД50/0,1 мл) Титр вируса (lg ТЦД50/0,1мл) (опыт)
(контроль) при -4 ± 2 оС при 20 ± 2 оС
6 5,08 ± 0,14 2,92 ± 0,07 2,83 ± 0,07
12 5,67 ± 0,07 3,67 ± 0,07 3,58 ± 0,07
18 5,5 ± 0,12 3,5 ± 0,12 3,42 ± 0,07
24 5,58 ± 0,07 3,58 ± 0,07 3,5 ± 0,12
В результате проведенных исследований новое синтезированное химическое соединение показало выраженную противовирусную активность в отношении тестируемого вируса на протяжении всего срока наблюдения, вызывая снижение ее на 2,0.2,25 lg ТЦД5о/о,1мл.
Выводы
Синтезированное нами новое химическое соединение имеет состав C32H46F12N8O10 и обладает противовирусной активностью.
Полученный препарат оказывает противовирусное действие на РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Flaviviridae роду Pestivirus, приводя к статистически достоверному снижению его инфекционной активности в чувствительной культуре клеток. Синтезированное пептидоподобное соединение способно достоверно снижать репродукцию вируса ВД-БС КРС.
Результаты исследований in vitro служат основой для дальнейших исследований in vivo на экспериментально или естественно инфицированных вирусом ВД-БС КРС животных.
РВЖ • СХЖ • № 1/2012
Противовирусная активность нового химического соединения
Библиография
1. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов. — Л.: ЛГУ, 1974.
2. Гулюкин М.И., Юров К.П., Караваев Ю.Д. и др. Система ветеринарно-санитарных, профилактических и лечебных мероприятий против инфекционных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах российской Федерации. — М.: Политерра, 2007.
3. Зубаиров М.М., Киселев А.В., Котляров В.М. и др. Антивирусная и антибактериальная активность новых химических соединений / Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, 9—10 декабря 1998 г. — Покров, 1998.
4. Крюков Н.Н. Инфекционный ринотрахеит — пустулезный вульвовагинит крупного рогатого скота / Итоги науки и техники // Животноводство и ветеринария, 1980; 32—113.
5. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р.У. Хабриева. — М.: Медицина, 2005.
6. Юров К.П., Шуляк А.Ф., Петрова О.Г., Майджи О.В. Распространение инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в различных регионах России // Тр. ВИЭВ, 2003; 73:15—22.
7. Babiuk L.A., Van Drunen Littel-van den Hurk S., Tikoo S.K. Immunology of bovine herpesvirus 1 infection // Vet. Microbiol., 1996; 53 (1-2): 31—42.
8. Jericho K.W., Kozub G.C. Experimental infectious respiratory disease in groups of calves: lobar distribution, variance, and sam-ple-size requirements for vaccine evaluation // Can. J. Vet. Res., 2004; 68 (2): 118—127.
Summary
T.I. Glotova, V.N. Silnikov, L.S. Koroleva, O.V. Kungurtseva, V.L. Tikhonov, A.G. Glotov. Аntiviral activity of new chemical drug. The results of obtaining a new peptide-like drug and studying its antiviral activity are submitted. The chemical composition of the drug is C32H46F12N8O10. In vitro experiments provided evidence of cytotoxicity and antiviral activity of the drug. It has been established that the synthetic peptide-like compound allows us to significantly reduce BVDV reproduction in sensitive cell cultures, i.e. it has antiviral activity. The resulting compound has stable chemical composition and retains antiviral activity during 2 years (observation time) when stored at -4 ± 2°C and 20 ± 2°C.
