Научная статья на тему 'Экспериментальное изучение противовирусной активности Гамапрена при герпесвирусной инфекции in vitro'

Экспериментальное изучение противовирусной активности Гамапрена при герпесвирусной инфекции in vitro Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
259
52
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
противовирусные препараты / герпесвирусные инфекции кошек / вирус инфекционного ринотрахеита кошек / гамапрен / вирус болезни Ауески / накопление вирусных белков / размножение вирусов / культура клеток / antiviral medicines / feline herpesvirus infections / feline rhinotracheitis virus / gamapren / the Aujeszky's disease virus / viral protein accumulation / the reproduction of viruses / cell culture

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — А. В. Санин, А. Н. Наровлянский, А. В. Пронин, В. Ю. Санина, Т. Н. Кожевникова

Вирусы группы герпеса вызывают у домашних животных целый ряд заболеваний, среди которых не последнее место занимают инфекционный ринотрахеит кошек и болезнь Ауески. Несмотря на то, что в настоящее время для лечения и профилактики герпесвирусных инфекций используется достаточно большое число иммуномодуляторов и противовирусных средств, поиск и внедрение эффективных лечебных препаратов остается актуальной задачей. Очевидно, что такие средства должны не только подавлять размножение вируса герпеса и способствовать коррекции вирусиндуцированного иммунодефицита, но и соответствовать требованиям к безопасности. Цель исследования: изучить влияние препарата Гамапрен (ГП), действующим веществом которого являются фосфорилированные полипренолы, выделенные из листьев шелковицы, на репродукцию различных герпесвирусов и созревание вирусных белков в культуре клеток in vitro. Показано, что ГП в экспериментах in vitro подавляет репродукцию герпесвирусов и созревание вирусных белков в культуре клеток. Так, ГП в дозе 200 мкг/млподавлял созревание белков ВИРК в чувствительной культуре клеток CRFK. При внесении ГП в дозе 100 мкг/мл в культуру клеток легких эмбрионов коров наблюдали подавление размножения ВИР КРС (вирус герпеса 1-го типа) в 100 раз. При этом наблюдали также торможение развития ЦПД вируса. Кроме того, ГП значительно снижал «урожай» ВИР КРС в чувствительной культуре клеток. Также в экспериментах по изучению влияния ГП на репродукцию ВБА показано, что ГП угнетает размножение данного вируса в чувствительной культуре клеток КФ на 2,25 lg ЦПД50/мл. Таким образом, в настоящей работе выявлено противовирусное действие ГП, проявляющееся in vitro по отношению к 3 различным герпесвирусам, 2 из которых (ВИРК и ВБА) играют важную роль в инфекционной патологии у кошек.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — А. В. Санин, А. Н. Наровлянский, А. В. Пронин, В. Ю. Санина, Т. Н. Кожевникова

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Experimental Study of Gamapren Antiviral Activity against Herpes Simplex Virus in vitro

Viruses of the herpes group cause a number of diseases in pets, including feline infectious rhinotracheitis and Aujeszky's disease. Despite the fact that currently a sufficiently large number of immunomodulators and antiviral agents are used for the treatment and prevention of herpesviral infections, the search of effective therapeutic agents remains an urgent task. It is obvious that such medications should not only suppress the reproduction of the herpes virus and contribute to the correction of viral-induced immunodeficiency, but also meet safety requirements. The aim of the investigation was to study the effect of Gamapren (GP), the active ingredient of which is phosphorylated polyprenols isolated from mulberry leaves, on the reproduction of various herpesviruses and the maturation of viral proteins in vitro. It is shown that GP is able to inhibit the reproduction of herpes viruses and maturation of viral proteins in cell culture. Thus, GP at a dose of 200 |jg/ml suppressed the maturation of feline rhinotracheitis virus proteins in the sensitive culture of CRFK cells. Also, GP at a dose of 100 |jg/ml suppressed the reproduction of infectious bovine rhinotracheitis virus in the bovine lung embryo cell culture about 100-fold. Also observed was inhibition of the viral cytopathogenic action. In addition, GP significantly reduced the «harvest» of the virus in sensitive cell culture. In yet another protocol we studied the effect of GP on the reproduction of Aujeszky's disease virus and shown that GP inhibited its reproduction in the sensitive cell culture by 2.25 lg CPD50/ ml. Thus, in the present work we demonstrated the antiviral effect of GP, which is manifested in vitro against 3 different herpes viruses, 2 of which (feline rhinotracheitis virus and Aujeszky's disease virus) inflict diseases in cats.

Текст научной работы на тему «Экспериментальное изучение противовирусной активности Гамапрена при герпесвирусной инфекции in vitro»

СОВРЕМЕННЫЕ ФАРМАКО- И БИОПРЕПАРАТЫ

Для цитирования: Санин, А.В. Экспериментальное изучение противовирусной активности Гамапрена при герпесвирусной инфекции УДК 619: 615

in vitro / А.В. Санин, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, В.Ю. Санина, Т.Н. Кожевникова, Анна В. Изместьева, Анастасия В. Изместьева,

А.Д. Агафонова, И.К. Зубашев, С.В. Ожерелков, Р.В. Белоусова // Российский ветеринарный журнал. — 2018. — № 3. — С. 28-33.

For citation: Sanin A.V., Narovljanskij A.N., Pronin A.V., Sanina V.Yu., Kozhevnikova T.N., Izmest'eva Anna V., Izmest'eva Anastasiya V.;

Agafonova A.D., Zubashev I.K., Ozherelkov S.V., Belousova R.V., Experimental Study of Gamapren Antiviral Activity against Herpes Simplex

Virus in vitro, Rossijskij veterinarnyj zhurnal (Russian veterinary journal), 2018, No. 3, pp. 28-33.

Экспериментальное изучение противовирусной активности Гамапрена при герпесвирусной инфекции in vitro

А.В. Санин1, доктор биологических наук, профессор, зав. лаб. клеточного иммунитета (saninalex@inbox.ru), А.Н. Наровлянский1, доктор биологических наук, профессор, зав. лаб. цитокинов (narovl@yandex.ru), А.В. Пронин1, доктор биологических наук, профессор, зам. директора по научной работе (proninalexander@yandex.ru), В.Ю.Санина1, кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаб. клеточного иммунитета (sanina@gama-market.ru), Т.Н. Кожевникова1, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаб. клеточного иммунитета (tatiana@micro-plus.ru), Анна В. Изместьева1, научный сотрудник лаб. цитокинов (info@gamavetfatm.ru), Анастасия В. Изместьева1, научный сотрудник лаб. цитокинов (info@gamavetfatm.ru), А.Д. Агафонова1, ветеринарный врач, младший научный сотрудник лаб. клеточного иммунитета (enduro400@yandex.ru), И.К. Зубашев1, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаб. цитокинов (izubaschev@yandex.ru), С.В. Ожерелков2, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаб. противовирусных лекарственных средств(ozherelkov@yandex.ru), Р.В Белоусова3, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры вирусологии.

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).

2 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова» РАН (108819, г. Москва, пос. Московский, поселок Института полиомиелита, дом. 8, кор. 1).

3 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА имени К.И. Скрябина» (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23).

Вирусы группы герпеса вызывают у домашних животных целый ряд заболеваний, среди которых не последнее место занимают инфекционный ринотрахеит кошек и болезнь Ауески. Несмотря на то, что в настоящее время для лечения и профилактики герпес вирусных инфекций используется достаточно большое число иммуномодуляторов и противовирусных средств, поиск и внедрение эффективных лечебных препаратов остается актуальной задачей. Очевидно, что такие средства должны не только подавлять размножение вируса герпеса и способствовать коррекции вирусиндуцированного иммунодефицита, но и соответствовать требованиям к безопасности.

Цель исследования: изучить влияние препарата Гамапрен (ГП), действующим веществом которого являются фосфорилированные полипренолы, выделенные из листьев шелковицы, на репродукцию различных герпесвирусов и созревание вирусных белков в культуре клеток in vitro.

Показано, что ГП в экспериментах in vitro подавляет репродукцию герпесвирусов и созревание вирусных белков в культуре клеток. Так, ГП в дозе 200 мкг/млподавлял созревание белков ВИРК в чувствительной культуре клеток CRFK. При внесении ГП в дозе 100 мкг/мл в культуру клеток легких эмбрионов коров наблюдали подавление размножения ВИР КРС (вирус герпеса 1-го типа) в 100 раз. При этом наблюдали также торможение развития ЦПД вируса. Кроме того, ГП значительно снижал «урожай» ВИР КРС в чувствительной культуре клеток.

Также в экспериментах по изучению влияния ГП на репродукцию ВБА показано, что ГП угнетает размножение данного вируса в чувствительной культуре клеток КФ на 2,25 lg ЦПД50/мл.

Таким образом, в настоящей работе выявлено противовирусное действие ГП, проявляющееся in vitro по отношению к 3 различным герпесвирусам, 2 из которых (ВИРК и ВБА) играют важную роль в инфекционной патологии у кошек.

Ключевые слова: противовирусные препараты, гер-песвирусные инфекции кошек, вирус инфекционного ринотрахеита кошек, гамапрен, вирус болезни Ауески, накопление вирусных белков, размножение вирусов, культура клеток

Сокращения: БОЕ — бляшкообразующие единицы, ВБА — вирус болезни Ауески, ВИР КРС — вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, ВИРК — вирус инфекционного ринотрахеита кошек, ГП — Гамапрен, ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, Дс-Nа — додецилсульфат натрия, КФ — куриные фибробласты, ЛЭК — культура клеток легких эмбрионов коров, МЦП — микроцентрифужные про-

бирки, ПААГ — полиакриламидный гель, ПАС — про-теинА-сефароза, ТЦД50 — тканевая цитопатоген-ная доза, вызывающая гибель 50 % клеток монослоя, ЦПД — цитопатическое действие, CRFK — Crandell Feline Kidney Cell Line (перевиваемая культура клеток почки кошки), PI — Polyprenyl Immunostimu-lant (полипренилфосфат иммуностимулянт)

Введение

Вирусы группы герпеса вызывают у домашних животных целый ряд заболеваний — болезнь Ауески, респираторные и глазные заболевания, герпесвирусный энцефалит, инфекционный ринотрахеит кошек и др. Воз-

будители относятся к семейству герпесвирусов, характеризуются наличием липопротеиновой оболочки и содержат двухцепочечную ДНК [13]. На основании фено-типических и генетических данных семейство герпес-вирусов подразделяют на 3 подсемейства: a-, р-, и g-гер-песвирусов. Несмотря на то, что в настоящее время для лечения и профилактики герпеса используется достаточно большое число иммуномодуляторов и противовирусных средств, поиск и внедрение препаратов, повышающих резистентность к герпетической инфекции, остается актуальной задачей [13]. Очевидно, что подобные препараты должны не только подавлять размножение вируса герпеса и способствовать коррекции вирус-индуцированного иммунодефицита, но и соответствовать требованиям безопасности, включающим в себя отсутствие токсичности, аллергенности и реактогенности.

В предыдущих исследованиях было показано, что фосфорилированные полипренолы подавляют размножение ряда вирусов в чувствительных культурах клеток, а также обладают терапевтической активностью при лечении вирусных заболеваний мелких домашних животных [1, 5...7, 10, 11].

Цель исследования

Изучить влияние ГП, действующим веществом которого являются фосфорилированные полипренолы, выделенные из листьев шелковицы, на репродукцию различных герпесвирусов и созревание вирусных белков в культуре клеток in vitro.

Материалы и методы

Животные. В опытах использовали аутбредных беспородных мышей обоего пола массой 10.12 г, полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.

Гамапрен. Использовали коммерческий препарат ГП производства ООО «ГамаВетФарм», 0,5 %. В экспериментах применяли ГП в дозах от 80 до 200 мкг/мл.

Препарат сравнения. В качестве препарата сравнения использовали Ридостин производства ЗАО «Вектор-Медика», п. Кольцово Новосибирской области, содержащий 8 мг активного вещества в 1 мл. Использовали дозу 200 мкг/мышь, обычно применяемую у мышей при моделировании инфекции.

Вирусы. ВИРК, штамм Гранд, с активностью 6.5 lg ТЦД5о/мл был получен из музея ВГНКИ ветеринарных препаратов.

ВИР КРС, штамм 4016 (герпесвирус 1-го типа) был получен с кафедры ветеринарной вирусологии биологического факультета ФГБОУ ВО МГАВМиБ — МВА им. К.И. Скрябина.

ВБА, штамм ГНКИ, был получен из музея ВГНКИ ветеринарных препаратов.

Культуры клеток. В качестве субстрата для размножения ВИРК, штамм Гранд, использовали перевиваемую культуру почек кошек CRFK (Crandell Feline Kidney Cell Line), полученную из лаборатории вирусных инфекций ВГНКИ ветеринарных препаратов.

ВИР КРС, штамм 4016 пассировали и титровали на чувствительной перевиваемой культуре клеток ЛЭК. Титры вирусов оценивали по показателю lg ЦПД50/мл.

ВБА поддерживали на чувствительной культуре КФ.

Сыворотка. Использовали гипериммунную поликло-нальную сыворотку (из лаборатории вирусных инфек-

ций ВГНКИ ветеринарных препаратов), полученную от кошек, переболевших инфекционным ринотрахеитом.

Схемы экспериментов. Далее приведены схемы четырех экспериментов.

Влияние ГП на созревание белков ВИРТ. Трехдневную культуру клеток CRFK, посаженную в стандартные культуральные флаконы (8=25см2), заражали ВИРК с множественностью заражения »5.10 БОЕ/кл. Схема заражения представлена в таблице 1.

1. Схема заражения клеток CRFK ВИРК в присутствии ГП (200 мкг/мл) 1. Protocol of CRFK cells infection be FRV in the presence of GP (200 ng/ml)

Номер пробы ВИРК Среда поддержки

1 - МЕМ двойная

2 + МЕМ двойная

3 + МЕМ двойная + ГП

После полуторачасовой адсорбции клеток с вирусом при 37 °С во флаконы вносили по 2 мл среды для мечения, включавшей в себя: раствор Эрла (+ ГП, 200 мкг/мл) — 3 мл, среду поддержки МЕМ двойная — 3 мл; размеченный метионин — 21 мкл. Через 24 ч после начала мечения во все флаконы добавляли по 400 мкл РИП-бу-фера (Трис-HCl 10 мМ рН 8,0; NaCl 0,13 М; ЭДТА 1 мМ; NP-40 1 %; апротинин 500 ед/мл; 1 мМ ПМСФ) и помещали в морозильную камеру при -70 °С. Все флаконы были трижды подвергнуты замораживанию и оттаиванию. Полученный экстракт собирали в МЦП. Препараты двукратно осветляли на миницентрифуге в течение 20 мин при 14 тыс. мин-1. Из супернатанта в МЦП отбирали аликвоты по 180 мкл. Ко всем аликвотам добавляли по 10 мкл поливалентной сыворотки к ВИРТ. Реакционную смесь помещали на 12 ч при 4 °С. Одновременно с приготовлением реакционных смесей оставили набухать ПАС в РИП-буфере (соотношение объемов — 1:1). На следующий день ПАС трехкратно промывали равным объемом РИП-буфера. Осадок ресуспен-дировали в равном объеме РИП-буфера и добавляли по 50 мкл суспензии во все пробы. Образцы инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, встряхивая каждые 20 мин. По окончании инкубации пробы центрифугировали в течение 10 мин при 6 тыс. мин-1. Затем промывали 5 раз 1 мл промывочного W-буфера (Трис-HCl 10 мМ рН 8,0; NaCl 0,15 М; ЭДТА 1 мМ; NP-40 0,01 %). К пробам после промывки добавляли по 20 мкл S-бу-фера для нанесения на гель (Трис-HCl 0,0625 М, рН 6,8; глицерин 20 %; р-меркаптоэтанол 10 %; Дс-Na 2 %; бром-феноловый синий (на кончике шпателя), пробы прогревали при 95 °С в течение 10 мин и оставляли на 12 ч в холодильнике при 4 °С.

На следующий день проводили гель-электрофорез в денатурирующих условиях (1 % Дс-Na) по Лэммли в 10%-м ПААГ. Вместе с пробами в одну дорожку был помещен маркер молекулярной массы. В качестве белковых маркеров использовали смесь №4 (Pharmacia, Швеция) следующего состава: фосфорилаза в (94 000 Да), БСА (67 000 Да), овальбумин ( 43 000 Да), карбоновая ангид-раза (30 000 Да), ингибитор трипсина (20 000 Да), L- лак-тоальбумин (14 000 Да). Разделение заканчивали в момент выхода из геля краски (бромфенолового синего). Гели фиксировали в течение 1 ч в водном растворе, содержащем 10 % этанола 96 %, 20 % ледяной уксусной кислоты. Фиксированные гели отмывали водой до исчезновения запаха уксусной кислоты. Далее проводили ок-

раску гелей с помощью красителя Кумасси R-250 в течение 2 ч. После окраски гель отмывали в растворе, содержащем 25 % этилового спирта и 7 % уксусной кислоты. Затем гель четырехкратно обрабатывали безводным диметилсульфоксидом по 20 мин и инкубировали в течение 1 ч при 20 °С в 20%-м растворе сцин-тиллятора (PPO) в диметилсульфоксиде. По окончании обработки гелей их сушили на вакуумной сушке при 80 °С в течение 30 мин. Далее сухие пластины закладывали в рентгенографическую кассету с пленкой Kodak на 10 суток в холодильную камеру при -70 °С.

Влияние ГПна репродукцию ВИР КРС. ВИР КРС титровали в присутствии ГП, который добавляли в каждое разведение вируса в дозах 100 и 80 мкг/мл, препарат до нужной концентрации разводили поддерживающей средой Игла МЕМ. В качестве контроля использовали раствор плацебо, разведенный поддерживающей средой 1 : 40.

В каждом опыте проводили контроль на токсичность ГП.

После заражения контрольные и экспериментальные пробирки с клетками помещали в термостат и содержали при 37 °С в течение 5 суток, проводя ежедневные визуальные наблюдения за состоянием культур клеток. Результаты титрования оценивали в lg ЦПД50/мл.

Исследование изменений вирулентности «урожая» внутриклеточных и внеклеточных вирионов, полученных при титровании ВИР КРС в культуре клеток ЛЭК в присутствии ГП. Для изучения полученного «урожая» внутриклеточных и внеклеточных вирионов пробирки с клетками, зараженными вирусом ВИР КРС в разведениях 10-3,10-4, 10-5, 10-6, 10-7 объединяли из 4-х для каждого разведения в одну пробирку, получая тем самым по 2 пробы (контрольную и опытную) для каждого разведения вируса. Клетки в исследуемых пробах разрушали методом последовательного замораживания при при -70 °С и оттаивания с целью получения внутриклеточных вирионов. Полученные пробы титровали на свежих (48-часовых) клетках ЛЭК путем приготовления серийных разведений от 10-1 до 10-6 для каждой пробы и вносили по 1 мл в пробирки с монослоем клеток (по 4 на каждое разведение). Далее в течение 5-ти суток проводили ежедневное визуальное наблюдение за состоянием монослоя клеток в контрольных и опытных пробирках. Проявление ЦПД вируса оценивали стандартным методом (+/-). Титры вируса определяли по методу Кер-бера (1 пробирка — 0,25 lg ЦПД50).

Влияние ГП на репродукцию ВБА. После образования монослоя КФ из лунок полностью отсасывали поддерживающую среду и вносили:

• в контрольные лунки — ВБА (по 0,2 мл) в последовательных разведениях от -2 до -7 (по 4 лунки на каждое разведение);

• в экспериментальные — ВБА (по 0,2 мл), разведенному поддерживающей средой 199 на растворе Хенкса, содержащей 200 мкг ГП исследуемых серий в аналогичных контрольным разведениях от -2 до -7;

• дополнительным контролем служили КФ, куда вносили не содержащий вируса ГП в дозах 200 мкг/0,2 мл. После этого проводили ежедневное визуальное наблюдение за состоянием монослоя КФ в инверсионном микроскопе в течение 5 суток. Проявление ЦПД вируса оценивали стандартным методом: +, ++, +++, ++++.

Рис. Влияние ГП на созревание белков ВИРК в чувствительной культуре клеток CRFK через 24 ч после инфицирования клеток. Дорожки: 1 — белки в клетках (без ВИРК); 2 — белки в клетках, инфицированных ВИРК без добавления ГП; 3 — белки в клетках, инфицированных ВИРК в присутствии ГП (200 мкг/мл)

Fig. Effect of GP on the maturation of FRV proteins in the sensitive culture of CRFK cells 24 h after cell inoculation. Tracks: 1-proteins in the cells (without FRV); 2 — proteins in the cells infected with FRV without adding GP; 3 — proteins in cells infected with FRV in the presence of GP (200 Mg/ml)

Результаты и обсуждение

Влияние ГП на созревание белков ВИРК. На радиоавтографе (рис.) приведены результаты анализа лизиро-ванных клеток с поликлональной сывороткой кошек против ВИРК. Данные, представленные на рисунке, показывают влияние ГП в дозе 200 мкг/мл на созревание белков ВИРК через 24 ч после инфицирования культуры клеток (дорожки №2 и 3): ГП в использованной дозе подавляет накопление белков ВИРК в чувствительной культуре клеток CRFK.

Влияние ГП на размножение ВИР КРС in vitro. Аналогичную картину наблюдали при изучении влияния ГП на размножение ВИР КРС в культуре клеток ЛЭК. Данные, представленные в таблице 2, демонстрируют значительную противовирусную активность препарата в отношении вируса герпеса 1-го типа. Так, в культурах, в которые вносили ВИР КРС и ГП в дозе 100 мкг/мл, титр вируса был в 100 раз ниже, чем в клетках, инфицированных ВИР КРС без добавления препарата (1-я и 3-я пробы). При этом наблюдали торможение развития ЦПД вируса, внесенного в культуру клеток вместе с препаратом на 24...48 ч, по сравнению с таковым в контрольных зараженных клетках.

Влияние ГП на вирулентность «урожая» внутриклеточных и внеклеточных вирионов, полученных при титровании ВИР КРС в культуре клеток ЛЭК. Результаты титрования представлены в таблице 3.

В результате проведенных исследований было установлено, что титры ВИР КРС в «урожае», полученном на клетках ЛЭК при добавлении ГП, в 10 раз меньше, чем титр ВИР КРС в контроле при одинаковом проявлении ЦПД в исходных пробах /++++/ ( пробы 3 и 4; 5 и 6).

Результаты титрования вируса в пробах 7 и 8 показали, что при отсутствии проявления ЦПД в опытной пробе 8 /-/ вирус выявлялся в титре 4,5 lg, в то время как в контрольной пробе 7 при выраженном проявлении ЦПД /++++/ титр вируса в 10 раз больше (5,5 lg).

Исследование урожая вируса в контрольных и опытных пробах (9 и 10; 11 и 12) позволило установить, что при полном отсутствии ЦПД /-/, как в контрольных, так и в опытных первичных пробах, вирус при пассаже на свежих клетках выявлялся в контроле в достаточно высоких титрах 5.1 lg, тогда как в пробах клеток с ГП инфекционный титр вируса не выявлял-

2. Противовирусная активность ГП в отношении ВИР КРС in vitro 2. Antiviral activity of GP against infectious bovine rhinotracheitis virus in vitro

Номер и название проб Титры ВИР КРС (lg ЦПД50/мл) Токсичность (+/-)

1. Контроль вируса 3,5 + 0,5 -

2. Контроль плацебо 3,25+ 0,25** -

3. Вирус + ГП (100 мкг/мл) 1,75 + 0,25 * -

4. Контроль токсичности ГП - -

* Разница между соответствующими показателями в пробах 1 и 3; 2 и 3 статистически достоверна при Р< 0,05. ** Разница между соответствующими показателями недостоверна в пробах 1 и 2 при Р> 0,05

3. Влияние ГП на вирулентность «урожая» внутриклеточных и внеклеточных вирионов, полученных при титровании ВИР КРС в культуре клеток ЛЭК 3. The influence of GP on the virulence of intracellular and extracellular virions «harvest», obtained during the titration of IBR virus in the CLE cell culture

Номер и название пробы Титр вируса lg ЦПД50/мл Проявление ЦПД в исходных пробах

1. Контроль исходный 5,0 ++++

2. Опыт исходный 4,0 ++++

З.Контроль 10-3 8,0 ++++

4. Опыт 10-3 7,0 ++++

5. Контроль 10-4 5,5 ++++

б. Опыт 10-4 4,5 ++++

7. Контроль 10-5 5,5 ++++

8. Опыт 10-5 4,5 -

9. Контроль 10-6 5,0 -

10. Опыт 10-6 0 -

11. Контроль 10-7 1,5 -

12. Опыт 10-7 0

ся. Таким образом, ГП значительно снижает «урожай» ВИР КРС в чувствительной культуре клеток.

Исследование противовирусной активности ГП в отношении вируса болезни Ауески in vitro. Под действием ГП наблюдали подавление репродукции ВБА на 2,25 lg ЦПД50/мл (табл. 4).

В предыдущих исследованиях было показано, что препарат ГП, действующим веществом которого являются фосфорилированные полипренолы, выделенные из листьев шелковицы, обладает иммуномодули-рующими и противовирусными свойствами, которые проявляются в отношении инфекций, вызванных различными вирусами как in vitro, так и in vivo [2.4, 8, 9]. В настоящей работе показано, что ГП в экспериментах in vitro подавляет репродукцию герпесвирусов и созревание вирусных белков в культуре клеток.

Установлено, что ГП в дозе 200 мкг/мл подавляет созревание белков ВИРК в чувствительной культуре клеток CFRK. При внесении ГП в дозе 100 мкг/мл в культуру клеток ЛЭК наблюдали подавление размножения ВИР КРС (вирус герпеса 1-го типа) в 100 раз. При этом наблюдали также торможение развития ЦПД вируса. Кроме того, ГП значительно снижает «урожай» ВИР КРС в чувствительной культуре клеток. В экспериментах по изучению влияния ГП на репродукцию ВБА показано, что ГП угнетает размножение данного вируса в чувствительной культуре клеток КФ на 2,25 lg ЦПД50/мл.

Таким образом, в настоящей работе выявлено противовирусное действие ГП, проявляющееся in vitro по отношению к 3 различным герпесвирусам, 2 из которых (ВИРК и ВБА) играют важную роль в инфекционной патологии у кошек.

В настоящее время большинство противовирусных препаратов, применяющихся для борьбы с герпесвирус-ными инфекциями кошек, представляют собой аналоги тех или иных нуклеотидов или нуклеозидов ДНК вируса, либо ингибиторы вирусной ДНК-полимеразы, и их безопасность зависит, в значительной степени, от того, насколько специфично их воздействие на вирус [16]. Не случайно, что одним из немногих противовирусных препаратов, разрешенных в США для лечения кошачьего ринотрахеита, одного из самых распространенных инфекционных заболеваний домашних кошек [12], является PI, безопасность которого, как и ГП, подтверждена клиническими испытаниями [14]. Препарат ГП был создан в результате совместной российско-американской разработки в рамках проекта МНТЦ. Итогом проекта стал параллельный выпуск в России препарата ГП, а в США — препарата PI, различие между которыми состоит только в том, что фосфорилированные полипрено-лы ГП получают из листьев шелковицы, произрастающей на юге РФ, а сырьем для PI служит шелковица, расп-

4. Противовирусное действие ГП в отношении ВБА in vitro 4. Antiviral activity of GP against Aujeszky's disease virus in vitro

Разведения ВБА Контроль вируса ВБА + ГП

-2 iiii i i i i

-3 iiii i i i i

-4 iiii i----

-5 iiii ----

-б i--- ----

-7 i---- ----

-8 ---- ----

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Титры ВБА lg ЦПД50/мл 5,5+0,4 3,25+0,25

ространенная в США. Кроме того, концентрация действующего вещества в ГП 0,5 %, а в PI — 0,25 %. И ГП и PI первоначально зарегистрированы для лечения герпесвирус-ных инфекций кошек, однако PI также проявил эффективность в контролируемых клинических испытаниях при сухой форме кошачьего инфекционного перитонита [15]. Об аналогичных свойствах ГП ранее также сообщалось в отечественных публикациях [11].

Выводы

Препарат ГП обладает выраженным противовирусным действием, проявляющимся в отношении герпесвирусов ВИРК, ВИР КРС и ВБА в культуре in vitro.

Конфликт интересов

Конфликт интересов отсутствует. Анна В. Изместье-ва и Анастасия В. Изместьева являются также сотрудниками ООО «ГамаВетФарм», являющегося производителем лекарственного препарата для ветеринарного применения Гамапрен®.

Библиография

1. Васильев, А.Н. Противовирусная и иммуномодулирующая активность полипренилфосфатов при вирусных инфекциях / А.Н. Васильев, С.В. Ожерелков, В.В. Козлов, А.В. Пронин, А.В. Санин, Т.М. Парфёнова, А.В., Изместьева, А.М. Амченкова, Т.Н. Кожевникова, Т.Н. Степанова, А.Н. Наровлянский // Антибиотики и химиотерапия. — 2008. — Т. 53. — №3-4. — С. 3-8.

2. Глотова, Т.И. Противовирусная активность нового химического соединения / Т.И. Глотова, В.Н. Сильников, Л.С. Королева, О.В. Кун-гурцева, В.Л. Тихонов, А.Г. Глотов // Российский ветеринарный журнал. СХЖ — 2012. — №1. — с. 22-24

3. Глотова, Т.И. Противовирусная активность нового средства Гамапрен в отношении вируса ринотрахеита кошек / Т.И. Глотова, А.Г. Гло-

тов, В.В. Русских, Т.Б. Тугунова // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки — 2008. — № 10. — С. 63-68.

4. Изместьева, А.В. Иммуномодулирующая и противовирусная активность морапренилфосфатов (МПФ) / А.В. Изместьева, А.В. Сали-чев, М.В. Мезенцева, Л.К. Березина, А.А. Ольшанская, А.М. Амченкова, И.К. Зубашев, В.С. Козлов, С.В. Ожерелков, А.В. Пронин, А.В. Санин, А.Н. Наровлянский // Мед. иммунол. — 2011. — Т.1 3. — №4-5, — С. 522-523.

5. Кожевникова, Т.Н. Морапренилфосфаты подавляют размножение вируса энцефаломиелита Тейлера и накопление вирусного белка VP3 в чувствительных культурах клеток BHK-21 и P388D1 / Т.Н. Кожевникова, Е.Г. Викторова, В.Г. Козлов, А.Н. Наровлянский, А.В. Санин, А.В. Пронин, С.В. Ожерелков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2007. — №3. — С. 26-30.

6. Кожевникова, Т.Н. Влияние препаратов гамапрен и фоспренил, созданных на основе полипренолов растительного происхождения, на продукцию некоторых регуляторных цитокинов в норме и при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей / Т.Н. Кожевникова, С.В. Ожерелков, А.В. Изместьева, В.Ю. Санина, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, А.В. Санин // Российский иммунологический журнал. — 2008. — Т. 11. — №2-3. — С. 250.

7. Наровлянский, А.Н Противовирусная активность полипренилфос-фатов при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гепатита С in vitro / А.Н. Наровлянский, П.Г. Дерябин, А.М. Седов, А.В. Санин, А.В. Пронин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2 012. — №5. — С. 80-84.

8. Русских, В.В. Ринотрахеит кошек: клинико-эпизоотологические аспекты, противовирусная активность препаратов/ В.В. Русских: дис. ... кандидата ветеринарных наук, — Новосибирск [Место защиты: Ин-т эксперим. ветеринар. Сибири и Дал. Востока], 2009. — 131 с.

9. Санин, А.В. Применение Гамапрена при лечении вирусных инфекций у кошек / А.В. Санин, С.Л. Савойская, И.К. Васильев, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, Гордеева Е.В. // Ветеринария Кубани. — 2009. — №6. — С. 29-30.

10. Санин, А.В Иммуномодуляторы в ветеринарной практике — применение и противоречия / А.В. Санин, А.Н. Наровлянский, С.В. Ожерелков, А.В. Пронин, В.Ю. Санина // Ветеринарная клиника. — 2008. — №10. — С. 10-12.

11. Фурман, И.М. Применение препаратов на основе растительных полипренолов при различных формах кошачьего инфекционного перитонита / И.М. Фурман, И.К. Васильев, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, А.В. Санин // Российский ветеринарный журнал. МДЖ. — 2010. — №3. — С. 42-44.

12. Gaskell, R.M. Feline Respiratory Disease / R.M. Gaskell, S. Dawson, A. Radford / In Infectious Diseases of the Dog and Cat. — St.Louis: Elsevier Saunders, 2012. — рр. 151-164.

13. Looker, K.J. An estimate of the global prevalence and incidence of herpes simplex virus type 2 infection / K.J. Looker, G.P. Garnett, G.P. Schmid // Bulletin of the World Health Organization. — October 2008. — No. 86(10). — pp. 805-812

14. Legendre, A.M. Polyprenyl Immunostimulant in Feline Rhinotracheitis: Randomized Placebo-Controlled Experimental and Field Safety Studies / A.M. Legendre, T. Kuritz, R.E. Heidel, V.M. Baylor // Front. Vet Sci. — 27 February 2017. Режим доступа: https://doi.org/10.3389/fvets. 2017.000024.

15. Legendre, A.M. Polyprenyl Immunostimulant Treatment of Cats with Presumptive Non-Effusive Feline Infectious Peritonitis / A.M. Legendre, T. Kuritz, G. Galyon, V.M. Baylor, R.E. Heidel // Front Vet Sci. — 2017 Feb. — No. 14(4). — pp. 7. Режим доступа https://doi.org/10.3389/fvets. 2017.00007

16. Thomasy, S.M. A review of antiviral drugs and other compounds with activity against feline herpesvirus-1 / S.M. Thomasy, D.J. Maggs // Vet Ophthalmol. — 2016. — No. 19 (Suppl 1). — pp. 119-130.

References

1. Vasil'ev A.N., Ozherelkov S.V., Kozlov V.V., Pronin A.V., Sanin A.V., Par-fjonova T.M., Izmest'eva A.V., Amchenkova A.M, Kozhevnikova T.N., Stepanova T.N., Narovljanskij A.N, Protivovirusnaja i immunomoduliru-jushhaja aktivnost' poliprenilfosfatov pri virusnyh infekcijah, Antibi-otiki i himioterapija, 2008, Vol. 53, No. 3-4, pp. 3-8.

2. Glotova T.I., Sil'nikov V.N., Koroleva L.S., Kungurceva O.V., Tihonov V.L., Glotov A.G., Protivovirusnaja aktivnost' novogo himicheskogo soedineni-ja, Rossijskij veterinarnyj zhurnal.SHZh, 2012, No. 1, pp. 22-24.

3. Glotova T.I., Glotov A.G., Russkih V.V., Tugunova T.B., Protivovirusnaja aktivnost' novogo sredstva Gamapren v otnoshenii virusa rinotraheita koshek, Sibirskij vestniksel'skohozjajstvennojnauki, 2008, No. 10, pp. 63-68.

4.Izmest'eva A.V., Salichev A.V., Mezenceva M.V., Berezina L.K., Ol'shan-skaja A.A., Amchenkova A.M., Zubashev I.K., Kozlov V.S., Ozherelkov S.V., Pronin A.V., Sanin A.V., Narovljanskij A.N., Immunomodulirujush-haja i protivovirusnaja aktivnost' moraprenilfosfatov (MPF), Med. immunol., 2011, Vol. 13, No. 4-5, pp. 522-523.

5. Kozhevnikova T.N., Viktorova E.G., Kozlov V.G., Narovljanskij A.N., Sanin A.V., Pronin A.V., Ozherelkov S.V. Moraprenilfosfaty podavljajut razm-nozhenie virusa jencefalomielita Tejlera i nakoplenie virusnogo belka VP3 v chuvstvitel'nyh kul'turah kletok BHK-21 i P388D1, Zh. mikrobiologii, ehpidemiologii i immunobiologii, 2007, No. 3, pp. 26-30.

6. Kozhevnikova T.N., Ozherelkov S.V., Izmest'eva A.V., Sanina V.Ju., Narovljanskij A.N., Pronin A.V., Sanin A.V., Vlijanie preparatov gamapren i fosprenil, sozdannyh na osnove poliprenolov rastitel'nogo proishozhdeni-ja, na produkciju nekotoryh reguljatornyh citokinov v norme i pri jeksper-imental'nom kleshhevom jencefalite u myshej, Rossijskij immunologich-eskij zhurnal, 2008, Vol. 11, No. 2-3, pp. 250.

7. Narovljanskij A.N., Derjabin P.G., Sedov A.M., Sanin A.V., Pronin A.V. Protivovirusnaja aktivnost' poliprenilfosfatov pri jeksperimental'noj infekcii, vyzvannoj virusom gepatita S in vitro, Zhurnal mikrobiologii, jepidemi-ologii i immunobiologii, 2012, No. 5, pp. 80-84.

8. Russkih V.V., Rinotraheit koshek: kliniko-jepizootologicheskie aspek-ty, protivovirusnaja aktivnost' preparatov (Rhinotracheitis cats: clinical and epidemiological aspects, the antiviral activity of the preparations), Candidate thesis in veterinary sciences, 2009, Novosibirsk, [Mesto zash-hity: In-t jeksperim. veterinar. Sibiri i Dal. Vostoka], 131 p.

9. Sanin A.V., Savojskaja S.L., Vasil'ev I.K., Narovljanskij A.N., Pronin A.V., E.V. Gordeeva, Primenenie Gamaprena pri lechenii virusnyh infekcij u koshek, Veterinarija Kubani, 2009, No. 6, pp. 29-30.

10. Sanin A.V., Narovljanskij A.N., Ozherelkov S.V., Pronin A.V., Sanina V.Ju., Immunomoduljatory v veterinarnoj praktike — primenenie i pro-tivorechija, Veterinarnaja klinika, 2008, No. 10., pp. 10-12.

11. Furman I.M., Vasil'ev I.K., Narovljanskij A.N., Pronin A.V., Canin A.V. Primenenie preparatov na osnove rastitel'nyh poliprenolov pri razlichnyh formah koshach'ego infekcionnogo peritonita, Rossijskij veterinarnyj zhurnal. MDZh, 2010, No. 3, pp. 42-44.

12. Gaskell R.M., Dawson S., Radford A., Feline Respiratory Disease, 4th ed. In Infectious Diseases of the Dog and Cat: Greene C.E., editor, St.Louis, Elsevier Saunders, 2012, pp. 151-164.

13. Looker K.J., Garnett G.P., Schmid G.P., An estimate of the global prevalence and incidence of herpes simplex virus type 2 infection, Bulletin of the World Health Organization, October 2008, No. 86(10), pp. 805-812.

14. Legendre A.M., Kuritz T., Heidel R.E., Baylor V.M., Polyprenyl Immunostimulant in Feline Rhinotracheitis: Randomized Placebo-Controlled Experimental and Field Safety Studies, Front. Vet Sci., 27 February 2017, https://doi.org/10.3389/fvets.2017.000024.

15. Legendre A.M., Kuritz T., Galyon G., Baylor V.M., Heidel R.E. Polyprenyl Immunostimulant Treatment of Cats with Presumptive Non-Effusive Feline Infectious Peritonitis, Front Vet Sci., 2017 Feb, No. 14(4), p. 7. https://doi.org/10.3389/fvets.2017.00007.

16. Thomasy S.M., Maggs D.J., A review of antiviral drugs and other compounds with activity against feline herpesvirus-1, Vet Ophthalmol, 2016, No. 19(Suppl 1), pp. 119-130.

ABSTRACT

A.V. Sanin1, A.N. Narovljanskij1, A.V. Pronin1, V.Yu. Sanina1, T.N. Kozhevnikova1, Anna V. Izmest'eva1, Anastasiya V. Izmest'eva1, A.D. Agafonova1, I.K. Zubashev1, S.V. Ozherelkov2, R.V. Belousova3.

1 Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology (18, Gamaleya str., Moscow, 123098).

2Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and Biological products of RAS F (8/1, village of Institute of poliomyelitis, Moscow settlement, Moscow, 108819).

3 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named after K.I. Skryabin (23a, Ac. Skryabin str., Moscow, 109472).

Experimental Study of Gamapren Antiviral Activity against Herpes Simplex Virus in vitro. Viruses of the herpes group cause a number of diseases in pets, including feline infectious rhinotracheitis and Aujeszky's disease. Despite the fact that currently a sufficiently large number of immunomodulators and antiviral agents are used for the treatment and prevention of herpesviral infections, the search of effective therapeutic agents remains an urgent task. It is obvious that such medications should not only suppress the reproduction of the herpes virus and contribute to the correction of viral-induced immunodeficiency, but also meet safety requirements.

The aim of the investigation was to study the effect of Gamapren (GP), the active ingredient of which is phosphorylated polyprenols isolated from mulberry leaves, on the reproduction of various herpesviruses and the maturation of viral proteins in vitro. It is shown that GP is able to inhibit the reproduction of herpes viruses and maturation of viral proteins in cell culture. Thus, GP at a dose of 200 ig/ml suppressed the maturation of feline rhinotracheitis virus proteins in the sensitive culture of CRFK cells. Also, GP at a dose of 100 ig/ml suppressed the reproduction of infectious bovine rhinotracheitis virus in the bovine lung embryo cell culture about 100-fold. Also observed was inhibition of the viral cytopathogenic action. In addition, GP significantly reduced the «harvest» of the virus in sensitive cell culture.

In yet another protocol we studied the effect of GP on the reproduction of Aujeszky's disease virus and shown that GP inhibited its reproduction in the sensitive cell culture by 2.25 lg CPD50/ ml.

Thus, in the present work we demonstrated the antiviral effect of GP, which is manifested in vitro against 3 different herpes viruses, 2 of which (feline rhinotracheitis virus and Aujeszky's disease virus) inflict diseases in cats.

Keywords: antiviral medicines, feline herpesvirus infections, feline rhinotracheitis virus, gamapren, the Aujeszky's disease virus, viral protein accumulation, the reproduction of viruses, cell culture.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.