CC BY
49
УДК 619:616.98:578
Противовирусная активность нового синтезированного препарата в отношении возбудителя вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
Т.И. Глотова, Т.И. Семенова х, А.Г. Глотов, * В.Н. Сильников, * Е.А. Буракова
ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии, г. Новосибирск
*ГНУ Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
Ведение животноводства в настоящее время направлено на интенсификацию производства. Организуется строительство крупных молочных комплексов, в некоторые регионы России идет завоз высокопродуктивного импортного скота. Повышение молочной продуктивности коров, сосредоточение большого количества животных на ограниченных территориях и ввод новых животных в стадо увеличивают риск проявления вирусных болезней с сопутствующими бактериальными инфекциями.
Актуальной проблемой для современного животноводства являются массовые респираторные болезни молодняка КРС, причиняющие значительный экономический ущерб. Наибольшее значение в патологии органов дыхания у телят имеют вирусы: вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС), инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3) и респираторно-синцитиальной инфекции (РСИ) крупного рогатого скота (КРС). Данные вирусы, обладая иммуносупрессивным свойством, могут потенцировать течение многих респираторных болезней телят.
Одно из новых направлений в борьбе с вирусными болезнями КРС — химиотерапия, направленная на подавление репродукции вируса в организме и сокращение частоты и длительности выделения его во внешнюю среду, а также на профилактику и лечение больных животных.
В связи с этим актуальным является поиск новых эффективных противовирусных препаратов, обладающих выраженной противовирусной активностью в отношении вируса ВД-БС КРС.
В Институте химической биологии и медицины СО РАН разработан новый препарат с рабочим названием «Абакавир», который представляет собой поликатионное соединение 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил) пентан дихлорид дибромид. Наиболее близкими структурными аналогами данного препарата являются четвертичные соли 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, представляющие собой поликатионные молекулы на основе полиолов.
Ранее установлено, что данные соединения проявляют антибактериальную активность в отношении бактерий.
Целью работы являлось изучение противовирусного действия нового синтезированного химического соединения в отношении возбудителя вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.
Исследование цитотоксического действия препарата «Абакавир» проводили путем внесения его разведений в среде Игла MEM в выращенный монослой перевиваемой клеточной культуры КСТ (коронарные сосуды теленка) в лунки 96-луночного планшета (Costar), до конечных концентраций 39,06-10000,0 мкг/мл (по четыре лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°C в CO2-инкубаторе в течение 3 суток.
Результаты оценивали по четырехкрестовой системе, анализируя морфологию клеток и целостность монослоя при микроскопировании.
Таблица 1 - Определение токсического действия Абакавира на культуру клеток КСТ
Доза препарата Цитотоксическое действие (ЦТД)
10 мг/мл - + + -
5 мг/мл - - - -
2,5 мг/мл - - - -
1,25 мг/мл - - - -
625,0 мкг/мл - - - -
312,5 мкг/мл - - - -
156,25 мкг/мл - - - -
78,125 мкг/мл - - - -
39,06 мкг/мл - - - -
По данным таблицы, минимальная нетоксичная доза Абакавира для культуры клеток КСТ составила 5 мг/мл.
Учитывая полученные результаты, рассчитали максимально переносимую концентрацию (МПК) испытуемого препарата для культуры клеток КСТ, которая составила 2,5 мг/мл. За МПК принимали 1/2 дозы, при которой отсутствовало цитопатическое действие вещества.
Противовирусную активность Абакавира в отношении вируса ВД-БС КРС проводили в условиях in vitro. Для этого культуру клеток КСТ заражали вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) (штамм «ВК-1») в дозе не менее 1-10 ТЦД/кл (тканевая цитопатическая доза). Через 1,5 часа после заражения в лунки с культурой клеток вносили Абакавир в дозе 2,5±0,1 мг/мл (опыт) или разводящую питательную среду (контроль). Культивировали при 37°С в течение 72 часов, после чего вирусосодержащую суспензию титровали для определения инфекционной активности вируса ВД-БС КРС.
Противовирусный эффект рассчитывали по разнице инфекционных активностей вируса в контрольных и опытных образцах и выражали в lg снижения титров вируса. В каждом опыте проводили дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозы препарата.
Определение инфекционного титра вируса ВД-БС КРС проводили микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах с культурой клеток КСТ с использованием не менее 4 параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в ТЦД50/0,1 мл (50%-ная тканевая цитопатическая доза).
В таблице 2 представлены показатели снижения инфекционной активности вируса (выраженной в 1д) в контроле, где вирус репродуцировался без препарата, и в опыте, где репродукция осуществлялась в присутствии препарата.
Таблица 2 - Вирулицидные свойства Абакавира в отношении вируса ВД-БС КРС (штамм ВК-1)_
Время экспозиции вируса с Абакавиром Титр вируса ВД-Абакави БС КРС после экспозиции с ром (lg ТЦД50/0.1 мл)
контроль В присутствии Абакавира 2,5±0,1 мг/мл
1,5 ч 4,83±0,07 1,75±0,12
Из данных таблицы 2 видно, что Абакавир в значительной степени (на 3,08 1дТЦД50/0,1мл) подавляет инфекционную активность вируса ВД-БС КРС. Снижение титра вируса было достоверным (более 3 lg ТЦД50/01мл) при внесении препарата через 1,5 часа после заражения культуры клеток.
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что Абакавир обладает противовирусным действием в отношении РНК-содержащего вируса, относящегося к семейству Flaviviridae роду Pestivirus, приводит к статистически достоверному снижению его репродукции в чувствительной культуре клеток.
Результаты исследований in vitro служат основой для дальнейших исследований in vivo на экспериментально или естественно инфицированных вирусом ВД-БС животных с целью разработки эффективных лечебных и профилактических схем применения препарата.
