CC BY
12
УДК 577.152.3
ВЛИЯНИЕ НАТИВНОГО И МИКРОКАИСУЛИРОВАННОГО ИНГИБИТОРА ИРОТЕАЗ - АИРОТИНИНА НА РЕИРОДУКЦИЮ РЕСИИРАТОРНО-КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ КРУИНОГО РОГАТОГО СКОТА
Н. В. Ларионова1*, Д. Дюшен2, Р. В. Белоусова3
('кафедра энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; Воробьевы горы, Москва 119899, Россия; тел: 93934-17; e-mail:nilar@enzyme.chem.msu.ru; 2Лаборатория физико-химии, фармакотехники, биофармации, UMR CNRS 8612, факультет фармации, Университет Париж-Юг, 902296 Шатнэ Малабри, Франция; Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, 109472 Москва)
Ингибитор протеиназ - апротинин включен в микрокапсулы, полученные путем межфазного сшивания растворимого крахмала и бычьего сывороточного альбумина терефталоилхлори-дом. Изучена кинетика освобождения активного апротинина при биодеградации микрокапсул in vitro. Исследовано влияние нативного и микрокапсулированного апротинина на репродукцию вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ), аденовируса и вируса диареи крупного рогатого скота. Установлено, что нативный апротинин в дозе 3000 TIU/ мл ингибирует репродукцию вируса ИРТ и аденовируса и не влияет на размножение вируса диареи. Иоказана пригодность биоадгезивной биодеградируемой микрокапсулированной формы апротинина для эффективного подавления репродукции вируса ИРТ.
Протеолиз вирусных белков является одним из фундаментальных явлений в репликации вирусов. Протеолити-ческий процессинг вирусных полипептидов регулируется как последовательностью аминокислот белков-мишеней, доступных действию протеиназ, так и протеиназами соответствующей специфичности, которые могут иметь как клеточное, так и вирусное происхождение [1]. Ограниченный протеолиз определяет структурное и функциональное состояние вирус-специфических белков, что обеспечивает контроль сборки вирионов, формирование инфекционного вирусного потомства и развитие инфекционного процесса [2].
Ранее была показана возможность ингибирования репликации респираторных вирусов человека в культуре клеток [3] и в куриных эмбрионах [4, 5] с помощью природного ингибитора протеолитических ферментов - апротинина. Вирусные и бактериальные респираторно- кишечные инфекции крупного рогатого скота (к.р.с.), являются основными причинами заболеваемости и гибели молодняка сельскохозяйственных животных.
Цель настоящей работы - изучение влияние апротини-на и его новой лекарственной формы в виде крахмальных микрокапсул на репродукцию вируса ИРТ, аденовируса и вируса диареи к.р.с.
Методы исследования
В работе использовали растворимый крахмал Glu-cidex 2 («Roquette Freres», Франция). Бычий сывороточный альбумин («Sigma», США). Терефталоилхлорид
(«Aldrich-Chimie », Франция). Апротинин «Contrycal» («AWD», Германия).
Получение микрокапсулированного апротинина. Микрокапсулы получали путем межфазного сшивания тереф-талоилхлоридом растворимого крахмала и бычьего сывороточного альбумина методом, детально описанным нами ранее [6]. При капсулировании апротинин в концентрации (20 000 TIU/мл) был включен в состав водной фазы. Лиофилизованные микрокапсулы стерилизовали g-облучением в дозе 15 кГр.
Характеристика микрокапсул. Морфологию микрокапсул изучали с помощью оптической и сканирующей электронной микроскопии.
Изучение освобождения апротинина из микрокапсул in vitro. Антитрипсиновую активность в растворах, полученных в результате деградации микрокапсул под действием a-амилазы (0,2 мг/мл), определяли по уменьшению амидазной активности бычьего трипсина [7].
Культивирование клеток. Для культивирования как первичных культур клеток, так и перевиваемых линий клеток использовали питательную среду 199 и среду Игла (1:1 об/об) с добавлением 10%-й телячьей сыворотки. В качестве поддерживающей среды использовали ту же среду, не содержащую сыворотки. Перевиваемые линии клеток поддерживали периодическими пересеваниями.
Исследование инфекционности вирусов. Готовили разведения вирусов от 10-1 до 10-9 в среде с апротинином и без него, оставляли при комнатной температуре на 1 ч, а затем по 1 мл каждого разведения вируса вносили в про-
*Адресат для переписки.
бирки с соответствующей культурой клеток. Инфицированную культуру клеток культивировали при 37° в течение 10-12 дней. Инфекционный титр вирусов определяли методом титрования по цитопатическому действию на монослой соответствующей культуры клеток.
Результаты и их обсуждение
Микрокапсулирование апротинина. В исследованиях, проведенных нами ранее [6, 7], была разработана рациональная стратегия инкапсулирования ингибитора протеи-наз - апротинина. В настоящей работе в оптимальных условиях были получены прочные микрокапсулы с высоким выходом. По данным сканирующей электронной микроскопии, микрокапсулы имеют гладкую сплошную поверхность, их размер составляет 50-100 мкм. Белок освобождается из микрокапсул только в результате ферментативного расщепления их стенки. Причем фармакокине-тикой его освобождения можно управлять, изменяя условия получения микрокапсул. На рисунке показано, что при действии а-амилазы на стерилизованные микрокапсулы антитриптическая активность апротинина освобождается в среду в течение суток. Таким образом, предложенный метод приготовления микрокапсулирован-ного апротинина обеспечивает получение стабильных (в определенных условиях хранения) препаратов, способных к контролируемому освобождению активного ингибитора протеиназ.
Выбор культуры клеток для культивирования вируса ИРТ, аденовируса и вируса диареи к.р.с. С целью поиска наиболее чувствительной культуры клеток для вирусов использовали первично-трипсинизированную культуру клеток почки эмбриона коровы и тестикул бычков (ТБ), а также перевиваемые линии клеток почки теленка, почки эмбриона коровы, легкого эмбриона коровы (ЛЭК) и эпителия коронарных сосудов теленка (КСТ). Все изучаемые вирусы репродуцировались как в первичных культурах клеток, так и в перевиваемых линиях клеток, за исключением клеток КСТ для аденовируса и вируса ИРТ. Однако линия клеток КСТ обладала наибольшей чувствительностью для вируса диареи. В этом случае цитопатическое действие наступало через 36-48 ч, т.е. на 24 ч раньше,
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, ч
Освобождение антитриптической активности апротинина в процессе деградации микрокапсул (10 мг) а-амилазой (0,2 мг/мл) при рН 7,4 и 37°
Антивирусное действие нативного и микрокапсулированного апротинина
л 400
1-
о о 350
X
т 300
Н Ы те 250
к =з Цй 200
2 150
р 100
ю
50
X
5 0
Апротинин Инфекционный титр вируса (1Я ТЦД5с/мл) Пик* цитопатического действия, ч
вирус ИРТ аденовирус вирус диареи
- 7 6 7 48-60
Нативный 3000 ТЮ/мл 5000 Т1и/мл 5 3,5 7 7 72-96
Микрокапсулированный 3000 ТЮ/мл 5 - - 72-96
* Для вируса ИРТ и аденовируса.
чем в случае первичной культуры ТБ (через 60-72 ч). Титр вируса стабильно находился в пределах 6,5-7,0 ^ ТЦД50/мл (ТЦД - тканевая цитопатическая доза), что на 1-1,5 ^ выше, чем в культуре клеток ТБ.
Вирус ИРТ и аденовирус наиболее активно репродуцировались в перевиваемой линии клеток ЛЭК. Инфекционный титр вируса ИРТ составлял от 6,0 до 7,5 ^ ТЦД50/мл, аденовируса - от 5,5 до 6,0 ^ ТЦД50/мл, пик цитопатичес-кого действия наблюдали через 48-60 ч.
В дальнейших опытах использовали перевиваемую культуру клеток ЛЭК для аденовируса, ИРТ и культуру клеток КСТ для вируса диареи. Обе эти линии клеток быстро формировали монослой (через 48-72 ч) при пересеве их 1:6.
Изучение влияния нативного и микрокапсулированного апротинина на репродукцию респираторно-кишечных вирусов к.р.с. На первом этапе исследования проверяли воздействие апротинина на культуру клеток ЛЭК и КСТ. Для этого после формирования монослоя культуры клеток в поддерживающую среду добавляли апротинин в разных дозах (300, 1000, 3000 и 5000 ТЩ/мл среды) и наблюдали в течение 12 дней. Указанные дозы препарата не оказывали токсического действия на культуру клеток. Более того, в присутствии апротинина морфология клеток сохранялась в нормальном состоянии, в то время как в контрольных образцах (без апротинина) к 10-12-му дню наблюдения отмечали неспецифическую дегенерацию (зернистость цитоплазмы, округление клеток и сползание клеток со стекла). Результаты экспериментов по влиянию апротинина на зараженные вирусами культуры клеток представлены в таблице. Видно, что присутствие апротинина в поддерживающей среде приводило к уменьшению инфекционного титра вируса ИРТ и аденовируса на 2 и 2,5 логарифмических единицы соответственно. Кроме того, цитопатическое действие указанных вирусов проявлялось на 24-48 ч позже, чем в контрольных образцах. Микрокапсулы, способные к постепенному освобождению апротинина, демонстрировали подавление репродукции вируса ИРТ, аналогичное на-тивному ингибитору протеиназ. Однако апротинин не оказывал подавляющего действия на вирус диареи при концентрациях вплоть до 5000 ТЩ/мл.
Таким образом, результаты настоящего сообщения показывают возможность подавления репродукции вируса
ИРТ и аденовируса апротинином. Поскольку механизм протеолитической активации вирионов протеиназами, организма-хозяина присущ широкому кругу респираторных вирусов (грипп А, В, С, парамиксовирус, включая респираторно-синцитиальный, паротита кори, парагрип-позные вирусы, коронавирусы и др.), можно ожидать, что препараты на основе апротинина будут обладать широким спектром противовирусного действия [1]. Перечис-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Жирное О.П. // Мол. биол. 1988. 22. С. 581.
2. Krausslich H.-G., Wimmer E. // Ann. Rev. Biochem. 1988. 57.
Р. 701.
3. Zhirnov O.P., Ovcharenko A.V., Bukrinskaya A.G. // J. Gen. Virol.
1982. 63. Р. 469.
4. Zhirnov O.P., Ovcharenko A. V., Bukrinskaya A.G. // J. Gen. Virol.
1982. 66. Р. 1633.
ленные достоинства могут способствовать скорейшему созданию на основе апротинина высокоэффективного средства против респираторных вирусов. Готовая лекарственная форма апротинина в виде биоадгезивных крахмальных микросфер представляется перспективной, поскольку в условиях in vivo может дать дополнительное преимущество, связанное с усилением перехода апротинина на респираторный эпителий и пролонгирование действия.
5. Zhirnov O.P., Golyando P.B., Ovcharenko A. V // Arch. Virol. 1994.
135. Р. 209.
6. Larionova N. V., Ponchel G., Duchene D., Larionova N.I. // Inter. J.
Pharm. 1999. 189. Р. 171.
7. Ларионоеа H.B., Казанская, Н.Ф., Ларионоеа, Н.И., Поншель,
Ж., Дюшен, Д. // Биохимия. 1999. 64. С. 14.
Поступила в редакцию 20.06.00
