CC BY
32УДК 616.992.28: 678.019.38
ПРОТИВОГРИБКОВАЯ
АКТИВНОСТЬ
МИКРООРГАНИЗМОВ
ПРИРОДНОЙ
АССОЦИАЦИИ
«ТИБЕТСКИЙ РИС»
Тихомирова О.М. (доцент кафедры)*, Иванова Е.А. (дипломант)
ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская химикофармацевтическая академия, Санкт-Петербург,
Россия
© Тихомирова О.М., Иванова Е.А., 2011
Проведен скрининг микроорганизмов природной ассоциации «Тибетский рис» для оценки их способности ингибировать рост Candida albicans. Из состава ассоциации были выделены 30 штаммов молочнокислых палочковидных и кокковидных бактерий, 1 штамм уксуснокислых бактерий и 3 штамма дрожжей, проявляющих антагонизм в отношении тест-культуры. Из числа молочнокислых бактерий выбраны 8 штаммов, перспективных для дальнейшего изучения с целью получения на их основе пробиотических продуктов с противогрибковым действием.
Ключевые слова: дрожжи, Candida albicans, молочнокислые бактерии, противогрибковая активность, «Тибетский рис», уксуснокислые бактерии, ферментированные продукты
ANTIFUNGAL ACTIVITY OF MICROORGANISMS FROM NATURAL ASSOCIATION «TIBETAN RICE»
Tikhomirova O.M. (assistant professor of chair), Ivanova E.A. (graduated student)
SBEI HPE Saint-Petersburg Chemical-Pharmaceutical Academy, Saint-Petersburg, Russia
копирайт????????
Microorganisms of natural association «Tibetan rice» was screened for their ability to inhibit growth of Candida albicans. 30 strains of lactic acid bacteria (rods and cocci), 1 strain of acetic acid bacteria and 3 yeast strains with antagonistic activity were isolated from association. 8 strains of lactic acid bacteria were selected as perspective for further investigations as potential probiotics with antifungal activity.
Key words: acetic acid bacteria, antifungal activity, Candida albicans, fermented products, lactic acid bacteria, «Tibetan rice», yeasts
* Контактное лицо: Тихомирова Ольга Михайловна
Тел.: (812) 315-24-96
ВВЕДЕНИЕ
Противогрибковая терапия многих часто встречающихся микозов, даже при наличии широкого спектра химиотерапевтических препаратов, в ряде случаев оказывается неэффективной. Этому способствует возрастающая распространенность микроорганизмов, устойчивых к традиционно назначаемым препаратам. В связи с этим становится актуальной разработка средств, одновременно оказывающих ингибирующее действие на возбудителей и иммуномодулирующее действие - на макроорганизм. Одним из возможных подходов к решению проблемы повышения эффективности антимикотической терапии является использование пробиотиков, полученных на основе непатогенных микроорганизмов, способствующих восстановлению нормобиоты тела человека и предотвращающих колонизацию поверхностей посторонними микроорганизмами [1].
Потенциальным источником пробиотических микроорганизмов, обладающих высокой антагонистической активностью, являются традиционные ферментированные кисломолочные продукты (кефир, кумыс, айран и другие). В настоящее время в научной литературе имеются данные, подтверждающие эффективность таких напитков при использовании в комплексной терапии различных заболеваний, в том числе микозов [2].
Молочнокислые бактерии (МКБ), уксуснокислые бактерии (УКБ) и дрожжи, входящие в состав микробных ассоциаций при получении ферментированных продуктов, наряду с некоторыми другими микроорганизмами - сапробами, являются перспективными ингибиторами роста дрожжевых и мицелиальных грибов. По данным ряда авторов, эти микроорганизмы способны к выделению различных веществ антигрибкового действия (органических кислот, пероксида водорода, диацетила, пептидов и других), причем для указанных метаболитов, как правило, характерно синергическое взаимодействие при проявлении биологического эффекта [3].
На кафедре микробиологии СПХФА изучали микробиоту такой саморегулирующейся природной ассоциации микроорганизмов как «Тибетский рис» (ТР). В ее составе обнаружили молочнокислые палочковидные бактерии рода Lactobacillus, УКБ и дрожжи двух видов, при этом ассоцианты находились в строме из полисахарида, формирующего «зерно» [4].
Цель данного исследования - поиск штаммов-ан-тагонистов в отношении С. albicans среди микроорганизмов, входящих в состав ассоциации ТР.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследования использовали природную ассоциацию микроорганизмов ТР, а также культуральную жидкость (КЖ), полученную при культивировании этой ассоциации на молочно-сахарной среде [4]. Посевной материал зерен вносили
в среду в количестве 5%. Культивирование проводили при 22±0,5 °С в течение 3 суток. В конце ферментации зерна ТР отделяли фильтрованием, фильтрат КЖ использовали для исследования.
Антимикробную активность ассоциантов ТР в отношении дрожжей выявляли методом отсроченного антагонизма. Зерна ТР гомогенизировали путем растирания в стерильной ступке в стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 (по объёму). Полученные гомогенаты разводили в 100 раз стерильным физиологическим раствором. КЖ разводили стерильным физиологическим раствором в 1000 раз. Разведенные гомогенаты и КЖ высевали поверхностным методом по ОД мл на агари-зованные среды МРС, сусло-агар, среду с маннитом (МУР), дрожжевым экстрактом и пептоном для УКБ [4], Бригс (в модификации Шарп) и агар с сахарозой для Leuconostoc sp. [5]. Часть чашек термостатирова-ли при 32,5±0,5 °С, другую часть - при 22,0±0,5 °С.
1 мл взвеси клеток тест-культуры С. albicans NCTC 885-653 добавляли к 9 мл расплавленной и охлажденной до 45-50 °С агаризованной среды Сабуро, перемешивали и заливали вторым слоем в чашки с колониями, образованными ассоциантами после 24, 48, 72 и 96 ч культивирования. Кроме того, в ряде экспериментов заливку выполняли непосредственно после высева ассоциантов. Культивирование в присутствии тест-микроорганизма проводили в течение
1 недели при 32,5±0,5 °С или 22,0±0,5 °С. Результаты оценивали по наличию чётко заметных зон ингибирования роста тест-культуры вокруг колоний ассоциантов (диаметр зон - 3 мм и более). Материал из колоний, вокруг которых наблюдали отсутствие роста С. albicans, отсевали на жидкую среду МРС, культивировали в течение 72 ч при 32,5±0,5 °С или 22,0±0,5 °С (в зависимости от того, при какой температуре была выявлена антагонистическая активность) и микроскопировали с окраской по Граму для определения микроморфологии клеток. При получении смешанных культур проводили дополнительные рассевы на соответствующих агаризованных питательных средах до получения чистых культур.
Антагонистическую активность отдельных чистых культур ассоциантов в отношении С. albicans также оценивали с использованием метода отсроченного антагонизма. Чистые культуры МКБ и УКБ выращивали на жидкой среде МРС в течение 48-72 ч, разводили стерильным физиологическим раствором до получения суспензий, содержащих 109 кл/мл. Агаризованные питательные среды МРС и Бригс разливали по 10 мл в чашки Петри диаметром 90 мм. После застывания среды на поверхность делали высев разведённой культуры соответствующего штамма двумя штрихами, равноудалёнными друг от друга и от краёв чашки. Посевы инкубировали в течение 72 ч при 32,5±0,5 °С или 22,0±0,5 °С. После инкубации, поверх выросших штрихов, вторым слоем заливали 5 мл расплавленной и охлаждённой до 45-50 °С агаризованной среды Сабуро, в которую
заранее вносили взвесь тест-культуры С. albicans из расчёта 10s кл/мл. Культивирование в присутствии тест-микроорганизма проводили в течение 72 ч при 32,5±0,5 °С или 22,0±0,5 °С.
Чистые культуры дрожжей выращивали на жидкой среде Сабуро в течение 48 ч, разводили стерильным физиологическим раствором до получения суспензий, содержащих 109 кл/мл. Исследование проводили аналогично описанному выше, но культивировали на агаризованной среде Сабуро. Посевы инкубировали в течение 72 ч при 22,0±0,5 °С.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Поскольку в состав ассоциации ТР входят микроорганизмы с различными физиологическими особенностями, гомогенат зёрен ТР и КЖ, полученную при культивировании ассоциации на молочно-сахарной среде, высевали на среды различного состава: МРС (поддерживает рост широкого спектра МКБ, некоторых УКБ и дрожжей), МУР (используют для выделения УКБ, преимущественно рода Gluconobacter), сусло-агар, среду Бригс в модификации Шарп (используют для выделения МКБ рода Pediococcus, также поддерживает рост ряда других МКБ), питательный агар с сахарозой (применяют при контроле пищевых продуктов для определения присутствия или подсчета количества бактерий рода Leuconostoc). Хотя на начальной стадии изучения ассоциации ТР на кафедре микробиологии СПХФА среди ассоциантов не были обнаружены кокковидные МКБ [4], последующими исследованиями показано, что бактерии такой микроморфологии не только присутствуют, но и составляют существенную часть ассоциации. Именно поэтому в план исследования были включены среды для Pediococcus spp. и Leuconostoc spp. При выборе температурных режимов для выделения антагонистов учитывали то, что традиционное культивирование ассоциации ТР для получения лечебно-профилактического напитка проводится при температуре 20-24 °С. В то же время температурный оптимум для большинства МКБ родов Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Carnobacterium и других, выделяемых из различных источников (включая ферментированные продукты), а также УКБ находится в интервале 25-40 °С [6, 7]; для скрининга была выбрана середина этого интервала, поскольку оптимум для отдельных изоля-тов заранее известен не был. Кроме того, из данных научной литературы известно, что механизмы антагонизма МКБ, УКБ и дрожжей могут быть различны, причём метаболиты различной природы, обусловливающие антагонизм, образуются на разных сроках культивирования [8-10]. В связи с этим заливку второго слоя питательной среды с тест-культурой проводили либо сразу после посева ассоциантов, либо через 24 ч, 48 ч, 72 ч или 96 ч культивирования ассоциантов на соответствующих питательных средах при определённой температуре.
Наибольшее число антагонистов было выявлено на средах Бригс и МРС, меньше - на сусло-ага-
ре и агаре с сахарозой для Leuconostoc sp. На среде МУР росли микроорганизмы, практически не ингибировавшие рост С. albicans (был получен только 1 штамм-антагонист). Активные ассоцианты обнаружили в посевах, инкубировавшихся при обоих температурных режимах: на средах Бригс и МРС более активны были микроорганизмы, растущие при 32,5±0,5 °С, на сусло-агаре и среде для Leuconostoc sp.- при 22,0±0,5°С.
При посеве тест-культуры С. albicans одновременно с ассоциантами ингибирование её роста проявлялось слабо - активных изолятов не было получено. Наиболее выраженным антагонизм был в тех случаях, когда между посевом ассоциантов и тест-культуры выдерживался промежуток времени 72 или 96 ч. Из этого следует, что основной вклад в антагонистическое действие ассоциантов ТР вносят накапливающиеся к этому времени в среде метаболиты.
Всего были получены 34 чистые культуры антагонистов из числа ассоциантов ТР. По своей микроморфологии 30 из них соответствовали МКБ (палочкам и коккам), 1 - УКБ, 3 - дрожжам. Обращает на себя внимание тот факт, что среди антагонистов выявили
2 штамма кокковидных грамположительных бактерий с гомоферментативным типом молочнокислого брожения. Молочнокислые кокки (лактококки, педи-ококки и другие) широко распространены во многих ферментированных продуктах, но ранее не были обнаружены в составе ассоциации ТР [4].
Для подтверждения способности выделенных чистых культур бактерий-ассоциантов ингибировать рост тест-культуры С. albicans, оценки стабильности этого свойства и выделения наиболее активных антагонистов, каждую из полученных культур проверяли индивидуально с использованием метода отсроченного антагонизма.
Из данных научной литературы известно, что состав питательной среды и условия культивирования могут оказать существенное влияние на антимикробную активность МКБ. В частности, в исследовании Залан и соавт. [11] высокая активность была отмечена на среде МРС, а также среде, содержащей сок топинамбура, в то время как среды, содержащие молочные компоненты, оказались менее эффективными. В связи с этим антагонизм ассоциантов ТР в отношении тест-штамма патогенных дрожжей проверяли при двух разных температурах культивирования (22,0±0,5 °С и 32,5±0,5 °С) на двух средах - МРС и Бригс (в модификации Шарп). Последняя включает томатный сок, который содержит не только смесь сахаров (глюкозы, фруктозы), но и анионы органических кислот (лимонной, щавелевой, винной), витамины, макро- и микроэлементы. Среды, содержащие томатный сок, рассматривают как перспективные для культивирования пробиотических микроорганизмов [12].
Было установлено, что все полученные чистые культуры бактерий угнетают (в разной степени) рост тест-штамма дрожжей (таблица).
Таблица
Ингибирование роста С. albicans чистыми культурами бактерий-ассоциантов «Тибетского риса»
III Ингибирование роста тест-культуры на среде
Штамм МРС Ври ГС
22,0±0,5°С 32,5±0,5 °С 22,0±0,5 °С 32,0±0,5°С
3 +++ + + ++
5х-3 ++ ++ ++ ++
6 - с - -
8 +++ +++ + +
8х-3 ++ ++ + ++
9-IV-1 ++ +++ ++ ++
10 +++ ++ +++ ++
12 ++ +++ ++ +++
13 с ++ с ++
15 + + + +
15-V-1 + ++ ++ ++
17х-1 + ++ ++ ++
19 + ++ ++ ++
21 + ++ + ++
24 + + с +++
30 с ++ с -
33 + ++ + ++
35 ++ +++ ++ ++
45 ++ + ++ ++
47 + + с +
55 ++ ++ ++ ++
56 +++ ++ ++ +++
57 + + + ++
58 ++ ++ ++ ++
59 + + + ++
60 - + - +
62 + + + +
63 ++ ++ с ++
64 с + с +
68 с - с -
Примечание: ширина зоны ингибирования роста тест-культуры: + + + - более 25 мм, + + - 10-25 мм, + - менее 5 мм; с (слабое ингибирование) - визуально заметное уменьшение числа колоний тест-культуры около штриха; % - отсутствие ингибирующего действия. Жирным шрифтом выделены наиболее активные штаммы.
Наибольшую активность проявили штаммы 3, 8, 9-IV-1, 10, 12, 24, 35 и 56 (все они - МКБ): хотя бы на одной из питательных сред ширина зоны ингибирования роста тест-микроорганизма превышала 25 мм, при этом штаммы 9-IV-1, 10, 12, 56 и 35 были высокоактивны на обеих средах и при разных температурных режимах культивирования, а штамм 8 существенно ингибировал рост С. albicans на среде МРС. Среди отмеченных изолятов штамм 35 был представлен грамположительными кокковидными бактериями, предварительно идентифицированными как Lactococcus lactis; остальные имели форму палочек. Эффективное ингибирование роста патогенных дрожжей показали также изоляты 5х-3, 55 и 58. Высокая антагонистическая активность выделенных чистых культур сохранялась после 3-5 пересевов на жидкой среде МРС. Наименее активными оказались штаммы 6, 60 и 68.
Примеры ингибирования роста С. albicans чистыми культурами ассоциантов ТР приведены на рисунке. Из состава ассоциации были выделены 3 чистые культуры дрожжей, различавшихся по микроморфологии (штаммы 7, 16 и 67), из которых только
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2011. Т. 13. №4
штамм 7 ингибировал рост тест-микроорганизма на агаризованной среде Сабуро (ширина зоны ингибирования роста - 4 мм). Слабую активность в отношении дрожжей проявили изоляты 16 и 67 (подавление разрастания колоний тест-микроорганизма вблизи штриха). Следует отметить, что ранее [13] в ТР были выявлены только 2 вида дрожжей (Saccharomyces cerevisiae и 1 новый вид - Candida tibetica sp. nov.) В связи с этим привлекает внимание третий штамм дрожжей, а также соотношение дрожжевых организмов в естественной ассоциации и их роль при взаимодействии с другими ассоциантами.
ВЫВОДЫ
1. В составе ассоциации ТР присутствуют МКБ, УКБ и дрожжи, являющиеся антагонистами в отношении С. albicans.
2. Выделенные из природной ассоциации микроорганизмов ТР ряд штаммов МКБ представляют интерес как основа для получения препаратов с противогрибковым действием.
3. В дальнейших исследованиях намечено идентифицировать полученные изоляты и изучить механизмы их антагонистической активности.
Д
е
ж з
Рис. Ингибирование роста С. albicans микроорганизмами, входящими в состав ассоциации ТР. Штаммы: а - 3, б - 8х-3, в - 9-IV-1, г - 10, д - 13, е - 24, ж - 59, з - 63
ЛИТЕРАТУРА
1. Salminen S., Nybom S., Meriluoto /., et al. Interaction of probiotics and pathogens — benefits to human health? // Curr. Opin. Biotechnol. - 2010. - Vol. 21. - P. 157-167.
2. Глушанова H.A. Биологические свойства лактобацилл // Вюл. сиб. мед. - 2003. — № 4. - С. 51-55.
8* Magmtsson J., Strom К., Roos S., et al. Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Lett. - 2003. - Vol. 219. - P. 129-135.
4. Ларина О.Г. Микробиология природной ассоциации «Тибетский рис»: дис,,. канд. биол. наук. - СПб., 2000. - 180 с.
5. ГОСТ 10444.11-89. Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов. - М.: Изд-во стандартов, 1990. - 18 с,
6. Fermented Milks /Ed. A. Y. Tamime. - Blackwell Science, 2006. - 264 p.
7. Haakensen М.,Dobson С. М., Hill J. E,, Ziola B. Reclassification of Pediococcus dextrinicus (Coster and White 1964) Back 1978 (Approved Lists 1980) as Lactobacillus dextrinicus comb, nov., and emended description of the genus Lactobacillus II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. —2009. - Vol. 59, №3. - P.615-621.
8. Ожован И.М., Арзуманян В.Г., Баснакъян И.А. Киллерньш токсины клинически значимых дрожжей // Журн. микро-биол. - 2002. - № 4. - С. 79-83.
9. Bartowsky E.J., Henschke P. A. Acetic acid bacteria spoilage of bottled red wine - A review // Int. J. Food Microbiol. - 2008. - Vol. 125, №1. - P. 60-70.
10. Strom K. Fungal inhibitory lactic acid bacteria. Characterization and application of Lactobacillus plantarum MiLAB 393:
doct. thesis / Strom Katrin. - Uppsala: Swedish Univ. Agr. ScL, 2005. - 39 p.
11. Zalan Z., Hudacek J., Stetina J., etal. Production of organic acids by Lactobacillus strains in three different media // Eur.
Food Res. Technol. - 2010. - Vol. 230, №3. - P. 395-404.
12. Yoon K.Y., Woodams E.E., Hang Y.D. Probiotication of tomato juice by lactic acid bacteria // J. Microbiol. - 2004. - Vol.
42, №4. - P. 315-318.
13. Блинов Н.П., Ларина О.Г. Микробиота природной ассоциации «Тибетский рис» // Проблемы медицинской микологии. - 1999. - Т.1, №1. - С. 51-56.
Поступила в редакцию журнала 26.10.2011 Рецензент: А.А. Маметьева
