Антагонизм микроорганизмов природной ассоциации «Тибетский рис» в отношении некоторых мицелиальных грибов Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 58.071:582.282.123.4:582.282.123.2:582.281.2

АНТАГОНИЗМ

МИКРООРГАНИЗМОВ

ПРИРОДНОЙ

АССОЦИАЦИИ

«ТИБЕТСКИЙ РИС»

В ОТНОШЕНИИ

НЕКОТОРЫХ

МИЦЕАИААЬНЫХ

ГРИБОВ

Тихомирова О.М. (доцент кафедры)*, Иванова Е.А. (дипломант)

ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия, Санкт-Петербург, Россия

© Тихомирова О.М., Иванова Е.А., 2013

Проведено исследование влияния микроорганизмов природной ассоциации «Тибетский рис» на рост мицелиальных грибов родов Aspergillus, Pénicillium, Fusarium, Mucor, Absidia, Rhizopus, Cunnunghamella. Установлено, что микроорганизмы-ассоцианты проявляют антагонизм в отношении всех исследованных штаммов, при этом аскомицеты оказались более чувствительными, чем зигомицеты. Метаболиты, образуемые микробиотой «Тибетского риса» в процессе ферментации, оказывали разнонаправленное действие на рост грибов. Наиболее выраженную ингибиру-ющую активность в отношении мицелиальных грибов отмечали, начиная с 72 ч культивирования ассоциации, в то время как метаболиты, образуемые на 1 сутки ферментации, напротив, стимулировали рост ряда штаммов грибов. Показано, что ассоциация «Тибетский рис» является перспективным источником получения продуктов, активных против мицелиальных грибов, однако следует строго учитывать особенности динамики образования действующих компонентов.

Ключевые слова: Aspergillus, Zygomycota, Pénicillium, противогрибковая активность, «Тибетский рис», ферментированные продукты, Fusarium

ANTAGONISTIC ACTIVITY OF MICROORGANISMS FROM NATURAL ASSOCIATION «TIBETAN RICE» AGAINST SOME FILAMENTOUS FUNGI

Tikhomirova O.M. (assistant professor of chair), Ivanova Е.А. (graduated student)

SBEI HPE Saint-Petersburg Chemical-Pharmaceutical Academy, St. Petersburg, Russia

© Tikhomirova O.M., Ivanova E.A., 2013

Контактное лицо: Тихомирова Ольга Михайловна, Тел.: (812) 315-24-96

The influence of natural association «Tibetan rice» microbiota on growth of filamentous fungi of genera Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Mucor, Absidia, Rhizopus, Cunnunghamella has been investigated. Associants exhibited inhibitory activity against all strains of fungi, but ascomycetes were more susceptible than zygomycetes. Activity of metabolites synthesized by «Tibetan rice» microbiota on the fungal growth was different during the fermentation period. The highest levels of inhibition were recorded after 72 h of associants cultivation while metabolites formed on the first day of fermentation opposite stimulated the growth of some fungal strains. The results showed that natural microbial association «Tibetan rice» is a perspective source of the products active againstfilamentousfungi but dynamics of antifungal metabolites formation should be strictly taken into account.

Key words: antifungal activity, Aspergillus, fermented products, Fusarium, Penicillium, «Tibetan rice», Zygomycota

ВВЕДЕНИЕ

Традиционные ферментированные продукты, полученные с использованием микробных ассоциаций, в настоящее время интенсивно исследуют во всем мире, при этом их рассматривают не только в качестве продуктов функционального питания, но и как источники оригинальных штаммов микроорганизмов [1, 2]. Особое внимание привлекают ассоциации с доминированием молочнокислых бактерий (МКБ), для которых характерен широкий спектр биологической активности - антимикробное, иммуномодули-рующее, антиатеросклеротическое, гипотензивное и другие виды благоприятного действия при введении в макроорганизм самих микробов или их метаболитов [3,4].

В связи с возрастающей актуальностью микозов в современной клинической практике, распространением резистентности возбудителей к антигрибковым препаратам, возможности развития неблагоприятных побочных эффектов этих препаратов [5] возрастает интерес к продуктам природного происхождения, в том числе пробиотическим, как эффективным средствам для лечения и профилактики микозов различной локализации [6].

Одной из оригинальных природных микробных ассоциаций является «Тибетский рис» (TP), в состав которого входят МКБ, уксуснокислые бактерии и дрожжи [7]. На кафедре микробиологии СПХФА в течение ряда лет проводят изучение микробиоты TP и его биологической активности. В частности, была выявлена выраженная ингибирующая активность ассоциантов TP в отношении дрожжей Candida albicans [8]. В то же время, влияние микробиоты TP и продуктов ее метаболической активности на жизнедеятельность мицелиальных грибов оставалась неизученной.

Цель данного исследования - оценка антагонистической активности микроорганизмов, входящих в состав ассоциации TP, в отношении мицелиальных грибов - представителей отделов Ascomycota и Zygomycota.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования избрали природную ассоциацию микроорганизмов TP, а также культураль-

ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2013.Т.15. №3

ную жидкость (КЖ) и нативный раствор (HP), полученные при культивировании TP на молочно-сахар-ной среде MC В [7].

Антагонизм микробиоты ассоциации TP в отношении мицелиальных грибов исследовали с использованием метода агаровых блоков. В качестве тест-культур выступали штаммы из коллекции культур кафедры микробиологии СПХФА: Aspergillus niger 2а, A. nidulans 4, A. oryzae 6, Pénicillium expansum 14, P. funiculosum 16, Fusarium culmorum 27, Absidia sp. 30, Mucor racemosus 31, Rhizopus nigricans 33, Cun-ninghamella sp. 37.

Для подготовки тест-культур агаризованную среду Сабуро разливали в чашки Петри диаметром 90 мм по 20 мл и давали застыть при комнатной температуре. На поверхность среды наносили фрагменты мицелия соответствующих грибов и выращивали при 22,0±0,5 °С в течение 72-96 ч (для аскомицетов) и 36-48 ч (для зигомицетов). Из периферических областей выросших колоний с помощью стерильного сверла вырезали агаровые блоки диаметром 6 мм, которые и использовали в работе.

Гомогенат зёрен TP готовили, как описано ранее [8], после чего получали разведение гомогената 1:10 (по объёму) в стерильном физиологическом растворе. КЖ разводили стерильным физиологическим раствором в таком же соотношении. Полученные разведения высевали поверхностным методом по 0,1 млнаагаризованные среды MPC (де Мана-Рогоза-Шарп) и Бриге, заранее разлитые в чашки Петри диаметром 90 мм по 20 мл. Часть посевов выращивали при 22,0±0,5 °С, другую часть - при 32,5±0,5 °С в течение 72 ч до получения сливного роста. Из среды с проросшими колониями с помощью стерильного сверла вырезали агаровые блоки диаметром 6 мм.

Для исследования антагонизма агаризованную среду Сабуро разливали по 20 мл в чашки Петри диаметром 90 мм. После застывания среды в центр чашки помещали агаровый блок с тест-культурой гриба. На равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 25 мм от блока с тест-культурой размещали агаровые блоки с ассоциантами ТР. Чашки инкубировали при 22,0±0,5 °С: с блоками аскомицетов - 72-96 ч, зигомицетов - 36-48 ч. По окончании инкубации отмечали наличие и измеряли радиус зоны полного ингиби-рования роста тест-культуры гриба вокруг блоков с микробиотой ТР.

Влияние HP, полученного на разных сроках культивирования ассоциации, на рост мицелиальных грибов оценивали по интенсивности радиального разрастания колоний [9].

Ферментацию проводили на среде МСВ при 22,0±0,5 °С в течение 9 сут. Пробы отбирали на следующих сроках культивирования ассоциации TP: 0 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч, 96 ч, 120 ч, 9 сут.

Тест-культуры мицелиальных грибов выращивали на агаризованной среде Сабуро при 22,0±0,5 °С в течение времени, достаточного для получения колоний диаметром 3-4 см (36-120 ч в зависимости от

штамма). Из периферической части колонии с помощью стерильного сверла вырезали агаровые блоки диаметром 6 мм.

В стерильную чашку Петри диаметром 90 мм вносили 5 мл исследуемого варианта HP (в контроле брали 5 мл стерильной очищенной воды), заливали 5 мл расплавленной и охлаждённой до 45-50 °С средой Сабуро двойной концентрации (на 1 л среды: пептона - 20 г; глюкозы - 80 г, агар-агара - 40 г; стерилизация при 0,152 МПа в течение 30 мин, рН 5,6-5,8) и перемешивали. После застывания питательной среды в центр чашки помещали вырезанный из культуры тест-гриба агаровый блок и термостатировали: R. nigricans в течение 33-24 ч; М. racemosus 31, Absidia sp. 30, Cunninghamella sp. - 37-48 ч; P. expansum - 1472 ч; A. niger 2a, A. oryzae 6, F.culmorum - 27-96 ч; P. funiculosum 16-7 сут.; A. nidulans 4-14 сут. По окончании инкубации измеряли радиус колонии гриба (в миллиметрах). Степень ингибирования радиального разрастания колоний рассчитывали по формуле [10]:

Гк— ^нр

RGI =-х 100, где

Гк

RGI (radial growth inhibition) - ингибирование радиального разрастания колоний, %;

гк - радиус колонии гриба в контроле, мм;

гнр - радиус колонии гриба в присутствии соответствующего варианта HP, мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании активности микробиоты TP в отношении мицелиальных грибов методом агаровых блоков выявили выраженное ингибирование разрастания колоний тест-культур. В то время как в контроле формировались четко выраженные колонии грибов диаметром не менее 30 мм, вокруг блоков, вырезанных из сред MPC или Бриге после культивирования на них ассоциантов TP при двух разных температурах, отмечали наличие зон задержки роста грибов. Полученные данные представлены в таблице.

Таблица

Ингибирование роста мицелиальных грибов микроорганизмами-ассоциантами TP, выращенными

при различных условиях

Тест-культура Радиус зоны ингибирования роста тест-культуры гриба, мм

среда MPC среда Бриге

22,0±0,5 °С 32,5+0,5 °С 22,0+0,5 °С 32,5+0,5 °С

A. niqer 16,3±0,8 15,4+0,5 16,2+0,6 16,4+1,5

A. nidulans 15,5±0,8 14,2+0,6 14,8+0,8 14,0+0,4

A. oryzae 14,3±1,3 9,2+0,3 15,2+0,3 10,3 ±0,8

P. expansum 18,2±0,3 10,3±1,8 14,7+0,3 10,8+0,3

P. funiculosum 15,3±0,3 16,2+0,4 15,2+0,9 15,5+0,4

F. culmorum 13,4±0,9 11,5±0,5 12,4+1,2 10,6+0,6

Absidia sp. 6,5±0,4 6,2+0,6 5,7+0,3 5,3+0,3

M. racemosus 5,8±0,6 5,2+0,8 5,1+0,7 5,0+0,5

R. nigricans 6,8±1,0 6,2+0,8 5,8+0,8 5,5+0,4

Cunninghamella sp. 4,2+0,8 4,2+0,6 4,4+0,7 4,0+0,6

Было установлено, что метаболиты ассоциантов ТР, диффундирующие из агаровых блоков в среду Сабуро, ингибируют (в разной степени) все включён-

I

i1 il H

I a

120ч

Длительность культиоирсшомия TP I A-ntdufotn mA.ofyioe m A, niger

A

Длительность культивирования TP

I P e)tßöniütr\

P. funkubsutn

Б

Рис. 1. Влияние HP на степень радиального разрастания колоний некоторых грибов отдела Ascomyœta в зависимости от длительности культивирования ассоциации ТР. А - действие на грибы рода Aspergillus; Б - действие на грибы родов Pénicillium и Fusarium

ные в план исследования тест-культуры мицелиальных грибов. 11ри этом рост зигомицетов угнетается в существенно меньшей степени, чем рост; аскомице-тов. Достоверных различий в антагонистической активности микробиоты ТР, в зависимости от состава питательной среды и температуры культивирования ассоциантоВ против большинства исследованных штаммов грибов, обнаружить не удалось, за исключением А, огугае и Р. ехражит, в отношении которых большую активность проявляли ассоцианты, выращенные при 22,0±0,5 "С.

Поскольку на предыдущем этапе работы было установлено выраженное (в разной степени) подавление роста всех исследованных тест-культур ми-целиальных грибов микроорганизмами ассоциации ТР, представляло интерес изучение динамики изменения антифибковой активности в процессе культивирования атой ассоциации на среде МСВ.

Исследованиями, проведёнными ранее на кафедре микробиологии СПХФА, показано, что на разных стадиях ферментации соотношение ассоциантов в зерне ТР и КЖ существенно различается [7]. Такие вариации состава, очевидно, могут привести к значительным изменениям антигрибковой активности НР в связи с изменением спектра образуемых метаболитов [2,11],

Влияние НР, полученного на разных сроках культивирования ассоциации, на рост мицелиальных грибов оценивали по степени ингибирования радиального разрастания колоний. Данный метод нагляден и широко используется при оценке влияния веществ различной природы на рост фитопатогенных грибов [9,10]. Результаты представлены на рис, 1 и 2, На рис, 3 приведены изменения в характере и интенсивности роста мицелиальных грибов в присутствии НР на примере Е айтогит.

Дл и le льнос т ькул ьт и я препон их ТР

■ Abadía ip. М. raermostn ЯЙ.mgrtcani mCtinnlnghameíIa ip.

Рис. 2. Влияние НР на степень радиального разрастания колоний грибов отдела Zygomycota в зависимости от длительности культивирования ассоциации ТР

В результате выявили, что наиболее выраженным действием на все исследованные К) штаммов грибов обладает НР, полученный на 72-96 ч культивирования ассоциации, также активность (в разной степени) проявлялась и у НР на более поздних сроках культивирования. Обращает на себя внимание тот факт, что НР, полученный на начальном этапе культивирования (1 сут,), в ряде случаев, не только не угнетал, но и, наоборот, стимулировал рост мицелиальных грибов. Особенно это выражено для F. culmorum (Рис. 2, 3): интенсивность роста мицелия в присутствии НР, полученного через 24 ч культивирования ассоциации, составила 108,5± 1,8% в сравнении с контролем, 11оскольку штаммы мицелиальных грибов, которые были взяты для исследования, не являются ауксотрофами, можно предположить, что такое усиление роста гиф связано с повышением доступности органического источника азота в среде — свободных аминокислот — в результате активного нротеолиза белков молока на ранних стадиях ферментации. Известно, что смеси аминокислот более эффективно обеспечивают питательные потребности грибов, чем отдельные аминокислоты, причём многие грибы лучше всего усваивают именно смесь аминокислот гидролизата казеина [2].

ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2013.ТЛ5. №3

В Г

Рис. 3, Влияние НР, полученного на разных сроках культивирования ассоциации ТР на среде МСВ, на рост колоний Еси1тогит 27. А - контроль; Б - культивирование ТР в течение 24 ч; В -48 ч; Г - 72 ч

ВЫВОДЫ

1, Микроорганизмы, входящие в состав ассоциации ТР, проявляют антагонизм в отношении широкого спектра мицелиальных грибов — представителей родов Aspergillus, Pénicillium, Fusarium, Absidia, Mucor, Rhizopus, Cunninghamella, что указывает на перспективность проведения дальнейших исследований с представителями других родов и видов грибов. Природа антигрибковых метаболитов-ассоци^ антов требует отдельного изучения,

2, HP, полученный на разных сроках культивирования ассоциации ТР на среде МСВ, может оказывать разнонаправленное действие на рос т грибов. Наиболее выраженную ингибирующую активность отмечали, начиная с 72 ч культивирования ассоциа-

ции, в то Время как НР, полученный на 1 сутки культивирования, напротив, способен стимулировать рост отдельных штаммов грибов. В связи с этим при получении на основе ассоциации ТР продуктов, активных против мицелиальных грибов, следует строго учитывать особенности динамики образования действующих компонентов.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Gazzani G., Grusak М.А. Functional foods and their expanding applications in the improvement of human health // Curr. Opin. Biotechnol. - 2012. - Vol. 23. - P. 127-128.

2. Fermented foods and beverages of the world / Eds. J. P. Tamang, K. Kailasapathy. - Boca Raton etc.: CRC Press, 2010. - 434 pp.

3. Горелов A.B., Усенко Д.В. Современный взгляд на место пробиотических продуктов в профилактике заболеваний и сохранении здоровья человека // Лечение и профилактика. - 2011. - № 1. - С. 56-64.

4. Granato D., Branco G.F., Gomes С.A., et al. Probiotic dairy products as functional foods // Compr. Rev. Food Sci. Food Safety. - 2010. - Vol. 9, №5. - P. 455-470.

5. Климко H.H. Микозы: диагностика и лечение. Руководство для врачей. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Ви Джи Групп, 2008. - 336 с.

6. Mailander-Sanchez D., WagenerJ., SchallerM. Potential role of probiotic bacteria in the treatment and prevention of localized candidosis // Mycoses. - 2012. - Vol. 55, №1. - P. 17-26.

7. Ларина О.Г. Микробиология природной ассоциации «Тибетский рис»: дис... канд. биол. Наук. - СПб., 2000. - 180 с.

8. Тихомирова О.М., Иванова Е.А. Противогрибковая активность микроорганизмов природной ассоциации «Тибетский рис» // Проблемы мед. микологии. - 2011. - Т. 13, № 4. - С. 39-42.

9. Quiroga E.N., Sampietro A.R., Vattuone М.А. In vitro fungitoxic activity of Larrea divaricata cav. extracts // Lett. Appl. Microbiol. - 2004. - Vol. 39, №1. - P. 7-12.

10. Rodriguez M.A., Cabrera G., Godeas A. Cyclosporine A from a nonpathogenic Fusarium oxysporum suppressing Sclerotica sclerotiorum II J. Appl. Microbiol. - 2006. - Vol. 100, №3. - P. 575-586.

11. Strom K. Fungal inhibitory lactic acid bacteria. Characterization and application of Lactobacillus plantarum MiLAB 393: doct. thesis / Strom Katrin. - Uppsala: Swedish Univ. Agr. Sci., 2005. - 39 p.

Поступила в редакцию журнала 02.09.2013

Рецензент: Н.П. Журавлева

/