CC BY
14УДК 577.121:628.355.2: 582.282.123.4:582.282.123.2:582.281.2
метаболиты
микроорганизмов
природной
ассоциации
«тибетский рис»
с антигрибковой
активностью
тихомирова о.м. (доцент кафедры)*, иванова Е.А. (дипломант)
Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия (кафедра микробиологии), Санкт-Петербург, Россия
© Тихомирова О.М., Иванова Е.А., 2015
Изучали основные группы метаболитов микроорганизмов природной ассоциации «Тибетский рис», ингибирующих рост ми-целиальных грибов родов Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Mucor, Absidia, Rhizopus, Cunnunghamella. Установлено, что на разных сроках культивирования ассоциации на молочно-сахарной среде антагонистическое действие связано с соединениями различной химической природы. Начиная с 36 ч ферментации, существенный вклад в подавление жизнедеятельности грибов вносят вещества пептидной структуры, чувствительные к нагреванию и действию протеолитических ферментов (a-химотрипсина, проназы Е). К 3-4 суткам культивирования и позже происходит накопление органических кислот и/или иных веществ, активных в кислой среде. На более поздних сроках культивирования определённый вклад в антигрибковое действие также вносят термостабильные, устойчивые к протеазам вещества, не теряющие своей активности в нейтральной среде. Состав и структура конкретных антигрибковых метаболитов-ассоциантов «Тибетского риса» подлежит дальнейшему изучению.
Ключевые слова: Aspergillus, Zygomycota, Penicillium, противогрибковая активность, «Тибетский рис», ферментированные продукты, Fusarium
antifungal
metabolites of microorganisms from natural association «tibetan rice»
Tikhomirova o.M. (assistant professor of chair), Ivanova Е.А. (graduated student)
St. Petersburg Chemical-Pharmaceutical Academy (Chair of microbiology), St. Petersburg, Russia
© Tikhomirova O.M., Ivanova Е.А., 2015
The main groups of metabolites of microorganisms from natural association «Tibetan rice» inhibiting growth of filamentous fungi of genera Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Mucor, Absidia, Rhizopus, Cunnunghamella have been investigated. It was established that
* Контактное лицо: Тихомирова Ольга Михайловна, Тел.: (812) 315-24-96
microbiota of «Tibetan rice» synthesized compounds of different chemical nature during cultivation on milk sucrose medium. From 36 h of cultivationproteinaceous compounds whose activity was inhibited by heat and proteolytic enzymes (a-chymotripsin and pronase E) treatments contributed significantly to the antagonism against fungi. From 3-4 days of cultivation organic acids and probably other compounds that exhibited activity under acidic conditions were shown to be important antifungal factors. In the later stages offermentation heat andprotease-stable compounds active under neutral conditions against tested fungal strains were produced. The composition and structure of individual antifungal metabolites are subject of further investigations.
Key words: antifungal activity, Aspergillus, fermented products, Fusarium, Penicillium, «Tibetan rice», Zygomycota
введение
Ферментированные продукты, при получении которых используют микробные ассоциации, привлекают особое внимание исследователей и активно изучаются, поскольку, как правило, обладают широким спектром биологической активности, включая антимикробную. Выделенные из этих ассоциаций отдельные штаммы бактерий и дрожжей, в свою очередь, могут представлять интерес в качестве основы для создания новых, оригинальных продуктов [1, 2].
«Тибетский рис» (ТР) относят к числу естественно возникших сообществ микроорганизмов. При изучении микробиоты ТР, проведенном на кафедре микробиологии СПХФА, выявили, что в состав данной ассоциации входят несколько видов молочнокислых бактерий (МКБ), уксуснокислых бактерий (УКБ) и дрожжей [Ларина О.Г.: дисс... к.б.н. - СПб., 2000], причем, очевидно, микробиота ТР исследована еще не полностью. Среди прочих проявлений биологической активности микроорганизмов-ассоциантов и нативного раствора (НР), полученного при культивировании ТР на молочно-сахарной среде (МСВ), была обнаружена выраженная способность продуктов метаболизма микробиоты ТР, полученных на определенных сроках культивирования, подавлять рост мицелиальных грибов [3].
Способность МКБ, УКБ и дрожжей ингибировать жизнедеятельность микромицетов различного таксономического положения в последние годы интенсивно изучают в связи с актуальностью проблемы ограничения роста (а в ряде случаев - и синтеза ми-котоксинов) грибов в пищевых продуктах, сельском хозяйстве и медицине [4, 5]. Установлено, что антагонистическое действие этих микроорганизмов может быть связано с образованием органических кислот, пептидов различного состава и молекулярной массы, рейтерина, дигидроксиацетона, целлобиозолипидов, производных флороглюцина и ряда других соединений, причем имеются видовые и штаммовые особенности состава образуемых факторов антагонизма [5-9].
Цель данного исследования - выявление основных групп антигрибковых метаболитов микробиоты ТР, активных в отношении мицелиальных грибов -представителей отделов Ascomycota и Zygomycota.
материалы и методы
Объектами исследования были природная ассоциация микроорганизмов ТР, а также культуральная жидкость (КЖ) и нативный раствор (НР), полученные при культивировании ТР на молочно-сахарной среде МСВ [Ларина О.Г.: дисс... к.б.н. - СПб., 2000]. Ферментацию проводили при 22,0±0,5 оС в течение 9 суток. Пробы отбирали на следующих сроках культивирования: 0 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч, 96 ч, 120 ч, 9 сут. Кроме исходного НР, в ряде экспериментов использовали: нейтрализованный НР (значение рН НР доводили 0,1 М NaOH до рН 6,8-7,0); прогретый НР (НР выдерживали при 100 оС на водяной бане в течение 30 мин); НР после обработки проназой Е и НР после обработки а-химотрипсином. При исследовании влияния проназы Е (Sigma-Aldrich, США) на активность НР его значение рН доводили до 7,5 добавлением 0,1М NaOH, фермент добавляли в количестве 20 мг/100 мл при активности ферментного препарата не менее 3,5 Ед/мг, термостатировали при 25 оС в течение 1 ч, после чего инактивировали фермент нагреванием на водяной бане при 80 оС в течение 20 мин [10]. Обработку НР а-химотрипсином проводили после доведения значения рН до 7,8 добавлением 0,1 М раствора NaOH; а-химотрипсин (ЕС 3.4.21.1) из поджелудочной железы крупного рогатого скота (ФС 42-628-97) добавляли из расчёта 20 мг/100 мл НР, инкубировали 2 ч при 37 оС, реакцию останавливали кратковременным нагреванием (100оС, 5 мин) и доводили значение рН до 6,8-7,0 10% раствором Н3РО4 [10].
Антагонизм микробиоты ассоциации ТР изучали в отношении штаммов мицелиальных грибов из коллекции культур кафедры микробиологии СПХФА: Aspergillus niger 2a, A. nidulans 4, A. oryzae 6, Penicillium expansum 14, P. funiculosum 16, Fusarium culmo-rum 27, Absidia sp. 30, Mucor racemosus 31, Rhizopus nigricans 33, Cunninghamella sp. 37. Тест-культуры готовили, как описано ранее [3]. Влияние НР, полученного на разных сроках культивирования ассоциации, на рост мицелиальных грибов оценивали по интенсивности радиального разрастания колоний [3, 11]. Степень ингибирования радиального разрастания колоний рассчитывали по формуле [12].
Для определения хитинолитической активности использовали питательную среду, по составу аналогичную агаризованной среде МРС для культивирования МКБ [Ларина О.Г.: дисс. к.б.н. - СПб., 2000], но без основных источников углерода (углеводов и солей органических кислот), в которую добавляли коллоидный хитин в концентрации 2 г/л (рН 6,2-6,8). Среду разливали по 15 мл в чашки Петри. Неразве-дённые гомогенат зёрен ТР и культуральную жидкость, полученные, как описано в [13], высевали поверхностным методом по 0,1 мл, часть посевов термостатировали при 22,0±0,5 оС, другую часть - при 32,5±0,5 оС в течение 7 суток. По окончании инкубации отмечали наличие областей просветления (раз-
рушения хитина) вокруг колоний выросших микроорганизмов [14].
результаты и их обсуждение
Для выяснения природы антигрибковых метаболитов, содержащихся в НР, его компоненты подвергали действию протеолитических ферментов (а-химотрипсина и проназы Е), а также нейтрализации (до рН 6,8-7,0) и нагреванию на кипящей водяной бане (100 оС, 30 мин).
Проназа Е и а-химотрипсин представляют собой протеолитические ферменты с различной специфичностью действия. Проназа Е - это смесь, по меньшей мере, трёх внеклеточных протеаз, полученных из культурального фильтрата Streptomyces griseus, включая сериновую протеазу, обладающую широкой субстратной специфичностью и гидролизующую пептидные связи преимущественно с карбоксильной стороны глутаминовой и аспарагиновой кислот. а-Химотрипсин из поджелудочной железы крупного рогатого скота также является сериновой протеазой, которая катализирует реакцию гидролиза пептидных связей с карбоксильной стороны аминокислот с ароматическими или крупными гидрофобными боковыми заместителями (тирозин, триптофан, фени-лаланин, метионин, лейцин) [10].
Обработанные, как указано выше, образцы и исходный НР исследовали на способность подавлять радиальное разрастание колоний мицелиальных грибов - представителей отделов Ascomycota и Zygo-mycota. Результаты представлены на рисунке (А - К).
Б
Рис. Влияние нейтрализации, воздействия температуры и протеолитических ферментов на активность НР в отношении мицелиальных грибов. А - Fusarium culmorum 27; Б - A. niger 2a; В - A. nidulans 4; Г - A. oryzae 6; Д - P. expansum 14; Е - P. funiculosum 16; Ж - Absidia sp. 30; З - M. racemosus 31; И - Rhizopus nigricans 33; К - Cunninghamella sp. 37. Обозначения на рис. 1, Б-К такие же, как на рис. 1, А
Е
Отметим, что нейтрализацию проводили исключительно для НР, полученного через 36 ч ферментации и далее, так как через 24 ч культивирования ТР значение рН среды отличалось от исходного (0 ч) незначительно. Обработку НР протеолитическими ферментами через 1 сутки культивирования также не проводили, поскольку в это время в нем еще присутствовало значительное количество неразрушенных белков молока, которые мешали бы корректной интерпретации результатов. При этом антигрибковая активность была незначительной или, напротив, НР стимулировал рост гриба [3]. В связи с этим на рисунке соответствующие данные не приведены.
Несмотря на определенные особенности ответа отдельных штаммов исследованных мицелиальных грибов на антигрибковые метаболиты ассоциантов ТР, можно выявить и очевидные черты сходства, которые актуальны как для представителей отдела Ascomycota, так и для зигомицетов. Полученными результатами показано, что на разных сроках культивирования ассоциации ТР образуются вещества различной химической природы, вносящие вклад в антагонизм в отношении мицелиальных грибов. Ранее было установлено, что наиболее выраженно ин-гибирование всех исследованных 10 штаммов грибов проявляется при использовании НР, полученного на 72-96 ч культивирования ассоциации; также активность (в разной степени) проявлялась и у НР на более поздних сроках культивирования [3]. Можно предположить, что противогрибковые свойства ассоциации придает присутствие в НР, полученном на 3-4 сутки и позже, органических кислот и, вероятно, веществ, активных в кислой среде, поскольку противогрибковое действие НР снижалась при нейтрализации. Отметим, что органические кислоты, образуемые МКБ, могут проявлять синергическое действие в сочетании с другими метаболитами [15]. Такое действие используют на практике: комбинированные препараты, содержащие молочную кислоту, являются эффективными ингибиторами роста ряда мицелиальных грибов, в том числе -рода Trichophyton [16]. Начиная с 36 ч культивирования ассоциации в подавление НР жизнедеятельности грибов, очевидно, вносят вклад вещества пептидной структуры, чувствительные к нагреванию и действию протеоли-тических ферментов (a-химотрипсина, проназы Е). Образование соединений белковой (пептидной) природы, ингибирующих рост мицелиальных грибов, было описано для ряда МКБ, причем была показана
зависимость их активности от значения рН среды, а некоторые из выделенных пептидов оказались в значительной степени термостабильными [5]. На более поздних сроках культивирования определённый вклад в антигрибковое действие также вносят термостабильные, устойчивые к протеазам вещества, не теряющие своей активности в нейтральной среде. В дальнейшем предполагается провести более подробное изучение состава и структуры этих метаболитов.
Подавление роста грибов может быть связано с синтезом антагонистами ферментов, разрушающих клетки (прежде всего, клеточные стенки) грибов [11]. Среди таких ферментов следует отметить хитиназы, катализирующие реакцию гидролиза хитина - основного структурного компонента клеточной стенки мицелиальных грибов-аскомицетов. Для МКБ и УКБ в научной литературе не было обнаружено упоминаний о хитинолитической активности, в то время как дрожжи образуют хитиназы. В частности, представители вида Saccharomyces cerevisiae могут синтезировать хитиназы, в том числе и с необычным для этой группы ферментов оптимумом рН в кислой области. Однако при высеве микроорганизмов ассоциации ТР на среду, содержащую хитин в качестве основного источника углерода, хитиназной активности выявлено не было. Таким образом, хитиназы не являются фактором антагонизма микробиоты ТР.
Результатами данного исследования показана перспективность дальнейшего изучения микробио-ты ТР и ее метаболитов с целью получения оригинальных продуктов с антигрибковым действием.
выводы
1. Микроорганизмы-ассоцианты ТР в процессе культивирования на молочно-сахарной среде образуют метаболиты различной химической природы, активные в отношении мицелиальных грибов отделов Ascomycota и Zygomycota.
2. На разных сроках культивирования ассоциации вклад в антагонизм могут вносить как органические кислоты, так и вещества белковой (пептидной) природы, а также термостабильные соединения, устойчивые к протеазам и сохраняющие активность при нейтрализации среды. Установление структуры индивидуальных антигрибковых метаболитов ассоци-антов требует дальнейшего изучения.
3. Хитиназы не являются факторами антагонизма ассоциантов ТР.
цитированная литература
1. Gazzani G., Grusak M.A. Functional foods and their expanding applications in the improvement of human health // Curr. Opin. Biotechnol. - 2012. - Vol. 23. - P. 127-128.
2. Fermented foods and beverages of the world / Eds. J. P. Tamang, K. Kailasapathy. - Boca Raton etc.: CRC Press, 2010. -434 p.
3. Тихомирова О.М., Иванова Е.А. Антагонизм микроорганизмов природной ассоциации «Тибетский рис» в отношении некоторых мицелиальных грибов // Проблемы мед. микологии. - 2013. - Т. 15, №3. - С. 55-59.
4. Oliveira P.M., ZanniniE., ArendtE.K. Cereal fungal infection, mycotoxins, and lactic acid bacteria mediated bioprotection: from crop farming to cereal products // Food Microbiol. - 2014. - Vol. 37, №1. - P. 78-95.
5. Dalié D.K.D., Deschamps A.M., Richard-Forget F. Lactic acid bacteria - potential for control of mould growth and
mycotoxins // Food Control. - 2010. - Vol. 21, №4. - P. 370-380.
6. Coda R., Cassone A., Rizzello C.G., et al. Antifungal activity of Wickerhamomyces anomalus and Lactobacillus plantarum during sourdough fermentation: identification of novel compounds and long-term effect during storage of wheat bread // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - Vol. 77, №10. - P. 3484-3492.
7. Logeshwaran P., Thangaraju M., Rajasundari K. Antagonistic potential of Gluconacetobacter diazotrophicus against Fusarium oxysporum in sweet potato (Ipomea batatus) // Arch. Phytopathol. Plant Prot. - 2011. - Vol. 44, №3. - P. 216-223.
8. Stopiglia C.D.O., Vieira F.J., Mondadori A.G., et al. In vitro antifungal activity of dihydroxyacetone against causative agents of dermatomycosis // Mycopathologia. - 2011. - Vol. 171, №4. - P. 267-271.
9. Kulakovskaya TV., Golubev W.I., Tomashevskaya M.A., et al. Production of antifungal cellobiose lipids by Trichosporon porosum // Mycopathologia. - 2010. - Vol. 169, №2. - P. 117-123.
10. www.sigmaaldrich.com
11. Quiroga E.N., Sampietro A.R., Vattuone M.A. In vitro fungitoxic activity of Larrea divaricata cav. extracts // Lett. Appl. Microbiol. - 2004. - Vol. 39, №1. - P. 7-12.
12. Rodriguez M.A., Cabrera G., Godeas A. Cyclosporine A from a nonpathogenic Fusarium oxysporum suppressing Sclerotinia sclerotiorum // J. Appl. Microbiol. - 2006. - Vol. 100, №3. - P. 575-586.
13. Тихомирова О.М., Иванова Е.А. Противогрибковая активность микроорганизмов природной ассоциации «Тибетский рис» // Проблемы мед. микологии. - 2011. - Т. 13, №4. - С. 39-42.
14. Souza C.P., Burbano-Rosero E.M., Almeida B.C., et al. Culture medium for isolating chitinolytic bacteria from seawater and plankton // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2009. - Vol. 25, №11. - P. 2079-2082.
15. Li H., Liu L., Zhang S., et al. Identification of antifungal compounds produced by Lactobacillus casei AST18 // Curr. Mi-crobiol. - 2012. - Vol. 65, №2. - P. 156-161.
16. Hultenby K., Chryssanthou E., Klingspor L., et al. The effect of K101 Nail Solution on Trichophyton rubrum and Candida albicans growth and ultrastructure // Mycoses. - 2014. - Vol. 57, №10. - P. 630-638.
Поступила в редакцию журнала 15.01.2015
Рецензент: Н.П. Елинов
