Фосфатсолюбилизирующая активность молочнокислых бактерий Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 579.86

ФОСФАТСОЛЮБИЛИЗИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

К.М. Злотников, к.б.н., А.К. Злотников, к.б.н., Е.Н. Капаруллина, к.б.н., А.В. Казаков, М.Л. Казакова

— Научно-производственная фирма «Альбит», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

E-mail: direktor@albit.ru

Статья посвящена выделению молочнокислых бактерий из листьев различных видов растений. Таксономическое положение выделенных штаммов бактерий определено на основании секвенирования гена 16S рРНК. Продемонстрирована способность выделенных молочнокислых бактерий (лактобактерий) растворять недоступные растениям формы фосфата кальция.

Ключевые слова: молочнокислые бактерии, микроорганизмы, фосфорное питание растений, фосфат кальция.

Фосфор - один из основных мине- и помещали в герметично закрываю- на УФ детекторе при t = 24°С. Концен-

ральных элементов питания растении, и его доступность во многом определяет судьбу урожая. Фосфорные удобрения используются растениями только на 10-25 %, поскольку фосфор в большинстве почв находится в форме малорастворимых солеИ и коллоидов, таких как Ca3(PO4)2, CaHPO4, Ca5(PO4)3(OH), MgHPO4, AlPO4, FePO4 и других [1]. В почвах с неИтральноИ и щелочной реакцией (чернозёмы, каштановые, серые лесные) более доступны для растений однозамещённые и двузамещённые фосфаты, которые образуются в почве при действии органических и неорганических кислот. В повышении доступности фосфора для растений большую роль играют микроорганизмы, способные за счёт выделяемых ими органических кислот солюбилизировать фосфаты. В качестве фосфатсолюбилизаторов в литературе традиционно называются представители родов Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Enterobacter, Azospirillum, грибов-микоризообра-зователей и других ассоциированных с растениями микроорганизмов [2, 3]. Однако среди них не упоминаются молочнокислые бактерии (лактобак-терии), хотя имеются свидетельства о выделении микроорганизмов данной группы из разных частей растений [4]. Лактобактерии способны продуцировать органические кислоты (молочная, уксусная и др.), поэтому логично предположить, что они могут обладать способностью переводить фосфаты в более доступную для растений форму.

Цель настоящей работы - выделение молочнокислых бактерий из растений и изучение их способности солюбилизировать нерастворимые в воде фосфаты.

Накопительные культуры бактерии получали из листьев растений, при этом листья ополаскивали стерильной дистиллированной водой, измельчали

щиеся пробирки с винтовой крышкой вместимостью 20-30 мл, заполняя объём примерно на 70-80 %. Оставшийся объём заполняли стерильной водой, герметично закрывали и пробирки инкубировали при 28°С в термостате в течение суток. За период инкубации пробирки 1-2 раза встряхивали вручную.

Для культивирования лактобакте-рий на твёрдых питательных средах в настоящей работе впервые предложены среды 2Т5 и 2Т5-Р. После инкубации пробы из жидкой фазы высевали на агаризованную питательную среду 2Т5 следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0, триптон - 1,5, соевый пептон - 0,7, аминопептид - 20,0 мл, автолизат гриба Cephaliophora tropica D3 - 50,0 мл, сок тыквы - 60,0 мл, сок томата - 20,0 мл (pH 6,0) и инкубировали в термостате при 30°С в течение 20-40 ч. Агаризованную среду 2Т5-Р с фосфатом кальция готовили из равных объемов горячей (50-60°С) 2% агаризо-ванной среды 2Т5 (причём один объём содержал 40 мМ СаС12, другой - 17 мМ K,HPO4), перемешивали и разливали в чашки Петри. Образующаяся при этом взвесь кристаллов нерастворимых в воде фосфатов, состоящая из Ca3(PO4)2, двузамещённого фосфата кальция и гидроксилапатита, равномерно распределялась по объёму и делала среду непрозрачной. Бактерии после рассева на агаризованные среды выращивали в термостате при 28°C.

Способность бактерий продуцировать молочную кислоту проверяли при их выращивании без аэрации в неразбавленном стерилизованном огуречном соке с 1% глюкозой. Молочную кислоту детектировали методом ВЭЖХ на хроматографе высокого давления LKB 2150 (Швеция) с колонкой Reprosil-Pur C8 (250 Ш 4,6). В качестве элюента использовали 0,01 н H2SO4. Оптическую плотность измеряли при 210 нм

№ 4 (62) 2012

трацию молочной кислоты определяли методом абсолютной градуировки.

Для определения таксономического положения выделенных штаммов лактобактерий использовали 20-30-часовые культуры, выращенные в 150-200 мл жидкой среды 2Т5 при 30°С. ДНК выделяли и очищали по методу Мармура [5]. Ген 16S рРНК амплифицировали методом ПЦР, используя универсальные для 16S рДНК прокариот праймеры 27f: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и 1492r: 5'- AAGGAAGGTGATCCAGCTCGT-3' [6]. Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Выделение и очистку фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили на колонках с использованием набора «Wizard SV Gel and PCR Cleanup System» (Promega, США), согласно инструкции фирмы- производителя. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили при помощи наборов BigDye® Terminator vl.1 и капиллярного анализатора ABI PRISM® (Applied Biosystems, США). Предварительный филогенетический скрининг сходства нуклео-тидных последовательностей гена 16S рРНК штаммов лактобактерий по базе данных GeneBank [NCBI] проводили с помощью пакета программ BLAST [http://ncbi.nlm.nih.gov].

Выделение лактобактерий проводили в конце апреля 2011 г. из накопительных культур молодых листьев крапивы, петрушки, одуванчика, укропа, редиса и салата, собранных на территории СНТ «Митинки» (Пущино Московской обл.). Пробы высевали на агаризованную среду 2Т5 и выдерживали 48 ч при 30°С. Во всех случаях за двое-трое суток на среде 2Т5 вырастали только характерные слегка матовые колонии лактобактерий небольшого размера (от слабо различимых до 1 мм в диаметре), резко отличающиеся

Владимярскш ЗемледЪлецъ

Фосфатсолюбилизирующая активность лактобактерий, изолированных с листьев растений (штаммы №№ 1-15). Учёт на агаризованной среде 2Т5-Р после 48 часов культивирования.

от колоний посторонней микрофлоры (псевдомонады, энтеробактерии, бациллы и т.д.), вырастающих на данной среде до размера 2-4 мм за 24 часа. Титр бактерий в накопительных культурах достигал уровня 106-107 КОЕ/мл. Судя по величине и морфологическим особенностям колоний, выросших на среде 2Т5, популяции лактобактерий в накопительных культурах представляли собой смесь нескольких штаммов бактерий, обычно от 3 до 5 морфоти-пов с каждого вида растений.

Из проб каждого вида растений были отсеяны по 2-3 характерные различающиеся между собой по морфологии колонии, и после двух последовательных стандартных процедур микробиологической очистки (подращивание в жидкой среде 2Т5 с последующим рассевом до единичных колоний) эти клоны бактерий изучали как отдельные штаммы. Изучение включало в себя микроскопирование, определение таксономической принадлежности, накопления молочной кислоты, способности растворять Са3(Р04)2. В ходе работы было исследовано 15 штаммов-изолятов бактерий.

С использованием световой микроскопии было установлено, что большинство выделенных штаммов бактерий представлено кокками, тогда

как некоторые имели форму коротких палочек. Все выделенные штаммы бактерий были грамположительные, неспорообразующие, хорошо росли в жидкой среде 2Т5 без аэрации и накапливали молочную кислоту (до 96 мг/л за 48 часов при 30°С в огуречном соке с 1% глюкозы). Все это указывало на принадлежность их к группе молочнокислых бактерий [7].

Четыре выделенных штамма бактерий были взяты для определения таксономического положения. На основании секвенирования гена 16S рРНК исследуемые штаммы идентифицированы как представители лактобакте-рий: Lactobacillus brevis (штамм № 3, источник - листья редиса), Leuconostoc citreum (штамм № 5, листья петрушки), Lactobacillus paracasei (штамм № 10, листья одуванчика), Leuconostoс mesenteroides (штамм № 12, листья укропа).

При высеве исследуемых штаммов на агаризованную среду 2Т5-Р с фосфа-

том кальция все 15 бактерий-изолятов показали ярко выраженную способность растворять Ca3(PO4)2 (зоны просветления на рисунке). Диаметр зон просветления за 2 суток культивирования составил для разных штаммов от 8 до 18 мм.

Таким образом, в работе впервые показано, что с листьев целого ряда растений могут быть выделены молочнокислые бактерии, способные к солюбилизации нерастворимых форм фосфата кальция. В связи с этим можно предположить, что молочнокислые бактерии, живущие в ассоциации с растениями, могут наряду с другими таксономическими группами микроорганизмов участвовать в улучшении фосфорного питания растений.

Литература

1. Ischerword K.F. Fertilizer use and environment // In: N. Ahmed and A. Hamid (eds.), Proc. Symp. Plant Nutrition Management for Sustainable Agricultural Growth. NFDC, Islamabad. 1998.

2. Khan A.A., Jilani G., Akhtar M.S., Naqvi S.M.S., Rasheed M. Phosphorus solubilizing bacteria: occurrence, mechanisms and their role in crop production // J. Agric. Biol. 2009. V. 1. № 1.

3. Vega N.W.O. A review on beneficial effects of rhizosphere bacteria on soil nutrient availability and plant nutrient uptake // Rev. Fac. Nal. Agr. Medellin. 2007. V. 60. № 1.

4. Beattie G.A. Plant-associated bacteria: survey, molecular phylogeny, genomics and recent advances // In: S.S. Gnanamanickam (ed.), Plant-associated bacteria. Springer. 2007.

5. Marmur J.A. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms// J. Mol. Biol. 1961. V. 3.

6. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. // In: E. Stackebrandt and M. Goodfellow (Eds.) Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Chichester. Wiley. 1991.

7. Alesson L. Lactic acid bacteria: classification and physiology // In: S. Salminen, A. von Wright, A. Ouwehand (eds.), Lactic acid bacteria. Microbiological and functional aspects. Third Edition. 2004.

K.M. Zlotnikov, A.K. Zlotnikov, E.N. Kaparullina, A.V. Kazakov, M.L. Kazakova

PHOSPHATE SOLUBILIZATION ACTIVITY OF LACTIC ACID BACTERIA

Several strains of lactic acid bacteria (LAB) were isolated from plant leaves. Their taxonomic position was found using 16S rRNA gene sequence analysis. All isolated LABs demonstrated ability to solubilize sedimented calcium phosphate.

Keywords: lactic acid bacteria, microorganisms, phosphorus plant nutrition, calcium phosphate.

ВлаЭишрскш ЗемлеШеЩ)

№ 4 (62) 2012