CC BY
84
УДК 637.075:579.8
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМы ДЛЛ ИДЕНТИФИКАцИИ
микроорганизмов бактериальных заквасок
К.В. БЕСПОМЕСТНЫХ, кандидат технических наук, заведующий лабораторией
Кемеровский государственный сельскохозяйственный институт
E-mail: kbespmestnykh@rambler.ru
Резюме. В работе представлены результаты исследований по соз -данию ПЦР-тест-системы для индикации и идентификации молочнокислых бактерий заквасок, применяемых в производстве кисломолочных продуктов. С целью выявления консервативныхучастков для закладки родоспецифичных и видоспецифичных праймеров были проанализированы нуклеотидные последовательности ДНК, кодирующей синтез 16S рРНК бактерий рода Lactobacillus, представленных в GenBank Сконструированы новые родоспецифичные и видоспецифичные праймеры для идентификации бактерий рода Lactobacillus, имеющих значительные отличия от молочнокислых бактерий других родов и видов. Их теоретическая специфичность подтверждена экспериментально на бактериальных заквасках, концентратах и кисломолочных продуктах. Практически созданные праймеры обладают наибольшей степенью гомологии к участкам нуклеотидной последовательности ДНК 16S рРНК микроорганизмов L. delbrieckii subsp. bulgaricus и обладают высокой специфичностью. Они позволяют выявить различие определенного вида микроорганизма по отношению к другим бактериям и определить их количественное содержание в продукте. Оптимальные параметры амплификации гена 16S рРНК молочнокислых бактерий (температура, время инкубации, количество циклов): 950С -200 с - 1 цикл, [620С - 50 с, 950С - 20 с] - 25 циклов, 720С - 120 с -1 цикл. Результаты идентификации видов L. bulgaricus и других лактобактерий с помощью полимеразной цепной реакции сопоставимы с полученными с использованием классического биохимического метода на основе сахаролитической активности различных видов лактобацилл. исследования, проведенные на широком спектре кисломолочных продуктов, экспериментально подтвердили более высокую специфичность и чувствительность ПЦР-тест-системы для идентификации молочнокислых бактерий, входящих в состав бактериальных заквасок. Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, прайме-ры, бактерии рода Lactobacillus, кисломолочная продукция, контроль качества.
Молоко - скоропортящийся продукт, поэтому ученые постоянно ищут новые способы его переработки [1, 2]. Одно из традиционных направлений решения этой задачи - производство кисломолочных продуктов. Однако до сих пор нет четко выработанной схемы контроля, согласно которой можно было бы определить не только технологическую пригодность, но и безопасность использования чистых культур бактерий и заквасок для их изготовления.
Кроме того, существует проблема, обусловленная тем, что свойства используемых монокультур и бактериальных заквасок очень изменчивы. Вследствие этого снижается активность развития и изменяются свойства полезных микроорганизмов, что приводит к нарушению процессов биотрансформации сырья и усилению размножения посторонней микрофлоры. Для изготовления качественных кисломолочных продуктов следует применять генетически устойчивые культуры бактерий или бактериальные закваски на их основе, способные обеспечивать целенаправленное протекание биотехнологических процессов.
На сегодняшний день межродовая и видовая идентификация микроорганизмов возможна исключительно на основе биохимических и морфологических свойств. Однако при этом могут возникнуть трудности, связанные с их значительным сходством.
Один из подходов к решению перечисленных проблем - использование для точной идентификации микроДостижения науки и техники АПК, №5-2014 _
организмов тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) [3, 4].
Цель наших исследований - изучить биохимические свойства микроорганизмов, структуру генома и разработать тест-систему для идентификации молочнокислых бактерий.
Для ее достижения решали следующие задачи: изучить биохимические признаки, сахаролитические свойства молочнокислых бактерий; провести анализ нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей синтез 16S рРНК молочнокислых бактерий; определить специфичность и чувствительность разработанной тест-системы.
Условия, материалы и методы. Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в Научно-образовательном центре и на кафедре «Био-нанотехнологии» Кемеровского технологического института пищевой промышленности.
В качестве объектов исследования использовали десять штаммов бактерий рода Lactobacillus, предоставленных ФГУП ГосНИИгенетики, пять из которых по паспортным данным принадлежали к L. acidophilus, пять - к L. delbrueckii subsp. Bulgaricus (табл. 1); бактериальные закваски и концентраты; кисломолочные продукты, приобретенные на потребительских рынках Кемеровской области.
Таблица 1. Штаммы микроорганизмов из всероссийской коллекции промышленных микроор-
ганизмов вКПм Госниигенетики)
Номер в
коллек- Название Источник
ции ВКПМ
В-6551 Фесцес новорожденного
L. а. Т-3 ребенка
B-8153 L. a. AE-5 Выделен из штамма AT-44
В-194 L. a. 1k Выделен из курицы
В-8634 L. а. 3 Самоквасная простокваша
В-5863 L. a. 57S Самоквасное молоко
В-6516 L. d. b. 21 Выделен из сырого молока
В-3964 L. d. b. Сырое молоко
В-3141 L. d. b. Л20/2 Мацони
В-6543 L. d. b. Б-259 Самоквасный молочный продукт
В-6515 L. d. b. 19 Выделен из сырого молока
Образцы кисломолочной продукции разделяли на несколько опытных групп в зависимости от вида входящих в их состав молочнокислых бактерий.
Экспериментальные исследования проводили в 3-кратной повторности, полученные данные анализировали и обрабатывали с использованием компьютерных программ.
Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов. На первом из них изучали биохимические свойства штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Для выращивания культур бактерий рода Lactobacillus использовали модифицированные питательные среды de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) для выделения и культивирования L. delbrueckii subsp. bulgaricus: полужидкую, содержащую 0,15% агара (MRS-2), и плотную с 2% агара (MRS-4). Штаммы для молекулярно-генетических исследований высевали на среду MRS-2 и инкубировали в течение 12 ч при 370С. Полученные культуры бактерий использовали для выделения геномной ДНК.
Лиофильно высушенные штаммы, предоставленные ФГУП ГосНИИгенетика, разводили в 1 см3 стерильного
Таблица 2. номера последовательностей гена 16S ррнК представителей рода Lactobacillus, депонированных в GenBank
Номер 1 Вид 1 Штамм
FJ861093.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus KLDS 1.0625
CP000412.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC BAA-365
EU483107.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus LC
EU642554.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus L3
FJ915706.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMAU40169
EU547306.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus BCS113
CP000033.3 L. acidophilus NCFM
FM878603.1 L. casei LB133
GU386757.1 L. paracasei B41
AM491821.1 L. rhamnosus R-32689
DQ480531.1 L. plantarum SK1.002
физиологического раствора и высевали 0,1...0,15 см3 на жидкую среду MRS-2. Инкубацию проводили 2 сут. при 370С. Затем выполняли разведения от 10-1 до 10-8 в стерильном физиологическом растворе и высевали на чашки с плотной средой MRS-4. Посев выполняли с каждого разведения. Инкубировали в течение 2.3 сут. при 370С в анаэробных условиях с использованием анаэ-ростатов и газогенерирующих пакетов GasPack (США). Изолированные колонии, типичные для лактобацилл, пересевали на полужидкую среду MRS-2. Через 2 сут. инкубации культуры из всех пробирок использовали для постановки так называемого «пестрого ряда».
В состав «пестрого ряда» входили 14 субстратов (сахаров и многоатомных спиртов): арабиноза, целло-биоза, галактоза, лактоза, мальтоза, маннит, манноза, мелибиоза, раффиноза, салицин, сахароза, трегалоза, ксилоза, сорбит.
Для изучения ферментации углеводов при дифференциации чистых культур микроорганизмов использовали бульон с бромкрезоловым пурпурным, который засевали 2 каплями 48-часовой культуры со среды MRS-2 с последующим встряхиванием пробирки для лучшего размешивания.
После посева испытуемого микроорганизма в каждую пробирку асептически помещали по одному диску с соответствующим углеводом. Посевы инкубировали в течение 48 ч при 35.. ,37°С. Результаты учитывали через 18 и 48 ч.
На втором этапе исследования в режиме on-line с использованием компьютерной программы ClustalW (версия 2.1) проводили сравнительный анализ 11 полных нуклеотидных последовательностей ДНК (табл. 2), кодирующей синтез 16S рРНК L. delbrueckiisubsp. bulgaricus, представленных в международной базе данных GenBank National Center for Biotechnology Information (NCBI), с целью выявления консервативных участков нуклеотидных последовательностей для закладки родоспецифичных и видоспецифичных праймеров.
Изучение последовательностей и конструирование праймеров проводили с использованием компьютерной программы Oligo 6,31, определение температуры отжига праймеров и процентный состав суммы всех гуанинов (G) и цитозинов (C) по отношению к длине исследуемого участка нуклеиновых кислот - с помощью программы Oligonucleotide Properties Calculator, теоретическое изучение специфичности выбранных праймеров - с применением программы BLASTA on-line.
ДНК из высушенной культуры бактерий выделяли с помощью «Набора для выделения геномной ДНК из бактерий» компании ЗАО «Синтол». Перед проведением процедуры брали навеску 5.10 мкг лиофилизированной культуры.
ДНК молочнокислых бактерий, содержащихся в кисломолочных продуктах, выделяли с помощью «Комплекта реагентов для выделения ДНК на сорбенте» ранее упомя-
нутого производителя. Перед выделением бактериальной ДНК в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл «Эп-пендорф» вносили 100 мкл кисломолочного продукта.
Третий этап посвящен конструированию универсальных праймеров для амплификации гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus и оптимизации параметров амплификации. Последовательности праймеров оптимизировали с целью повышения температуры отжига и увеличения специфичности получаемого ПЦР-продукта. Сконструированные пары родоспецифичных и видоспецифичных праймеров синтезировали и очищали в полиакриламидном геле в ЗАО «Синтол» (Москва), а затем использовали для постановки реакции амплификации гена 16S рРНК штаммов микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus, бактериальных заквасок и бактериальных концентратов, штамма Bifidоbacterium bifidum №1, лактобактерий, содержащихся в кисломолочных пробиотических продуктах.
В микроцентрифужную пробирку вместимостью 0,5 мл вносили ПЦР-реакционную смесь (табл. 3).
Таблица 3. Компонентный состав Пцр-реак-ционной смеси (из расчета на каждую анализируемую пробу)
№ п/п Наименование Объем, мкл
1 2,5*Реакционная смесь* 2,5
2 Смесь праймеров, 10 пкмоль/мкл каждого 1,0
3 Taq ДНК-полимераза, 5 Е/мкл 0,5
4 Деионизованная вода 13,0
5 Образец ДНК 5,0
'содержит2,5хПЦРбуфер Б(KCl, ТрисНС1(рН8,8), глице-рол, Tween 20), дезоксинуклеозидтрифосфаты, MgCl2.
Реакционную смесь осаждали кратковременным центрифугированием (10 ...15 сек). При использовании амплификатора типа «Терцик-МС2» («ДНК-технология», г. Москва) без подогрева крышки в каждую микроцентрифужную пробирку с реакционной смесью вносили по 30 мкл минерального масла для предохранения водной фазы от испарения при ПЦР. Все микроцентрифужные пробирки со смесями помещали в амплификатор типа «Терцик», ПЦР проводили по заранее разработанной программе (табл. 4).
Таблица 4. рекомендуемые условия проведения
пцр
Шаг про- Температура, Время инку- Число циклов
граммы 0С бации
1 95 300 с 1
2 62 50 с 35.45
95 20 с
3 72 120 с 1
Детекцию продуктов амплификации осуществляли методом электрофоретического разделения в 1,5%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, с последующей визуализацией в ультрафиолетовом цвете (260 нм) и регистрацией полученных результатов с помощью гель-документирующей видеосистемы «МгапРЬОо».
На четвертом этапе проводили оценку видовой специфичности ПЦР, в сравнении с классическими биохимическими методами. Исследовали специфичность параллельной идентификации микроорганизмов Ь. delbrueckiisubsp.
12 3 4 5
300
1234 5 6 789
рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 16S рРНК молочнокислых бактерий с использованием синтезированных родоспецифичных праймеров: А) гель 1: 1 - Маркер молекулярной массы ДНК (п.н.); 2 - L. d. b. Б-259; 3 - L. d. b. 19; 4 - Отрицательный контроль H2O; 5 - Маркер молекулярной массы ДНК (п.н.); Б) гель 2: 1 - L. a. T-3; 2 - L. a. AE-5; 3 - L. a. 1k; 4 - L. a. 3; 5 - L. a. 57S; 6 - L. d. B. 21; 7 - L. d. B.; 8 - L. d. B. Л20/2; 9 - Маркер молекулярной массы ДНК (п.н.).
bulgaricus с использованием биохимического метода и методики на основе ПЦР-тест-системы.
результаты и обсуждение. Штаммы бактерий L. delbrueckii subsp. bulgaricus неспособны сбраживать пентозы, так как ферментация происходит по гликоли-тическому пути. В наших исследованиях все они хорошо ферментировали лактозу. Штамм В-3141 ферментировал сахарозу, В-3141 и В-6516 - мальтозу, В-6515 и В-6516 - маннозу. Таким образом, по своим свойствам изучаемые штаммы неоднородны [5].
После тщательного анализа выровненных последовательностей генов 16S рРНК, имеющихся в современных банках данных, выбраны наиболее консервативные в пределах рода Lactobacillus участки, подходящие для создания праймеров. Для повышения специфичности нуклеотид-ные последовательности в регионах, соответствующих позициям праймеров, были детально проанализированы с целью выявления нуклео-тидных замен. Выбранные нуклеотидные последовательности использованы для сравнительного филогенетического анализа.
По результатам сравнительного анализа ДНК микроорганизмов рода Lactobacillus были синтезированы родо-специфичные праймеры длиной 22 п.н. (16S for-16S rev): 16S for - 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGG A (22); 16S rev -5'-ACG CTT GCC ACC TAC GTA TTA C (22) для амплификации гена 16S рРНК длиной 566 п.н. В качестве видоспецифичных праймеров для идентифика-
ции L. delbrueckii subsp. bulgaricus (16SbulF- 16SbulR) синтезированы: 16SbulF - 5'-CAA CAG AAT CGC ATG ATT CAA GTT TG (26); 16SbulR - 5'-ACC GGA AAG TCC CCA ACA CCT A (22) для амплификации гена 16S рРНК длиной 675 п.н.
Оценка специфичности сконструированных праймеров при помощи компьютерной программы BLASTA подтвердила их гомологичность с нуклеотидными последовательностями гена 16S рРНК бактерий рода Lactobacillus и отсутствие значимой гомологичности с нуклеотидными последовательностями других родов и видов бактерий.
Лабораторные испытания показали, что полимераз-ная цепная реакция с использованием праймеров 16S for-16S rev, специфична в отношении представителей рода Lactobacillus.
На электрофореграмме в дорожках геля наблюдаются фрагменты ДНК размера 566 п.н., соответствующие пробам ДНК бактерий рода Lactobacillus (рис. 1).
Теоретически обоснованная специфичность пар родоспецифичных и видоспецифичных праймеров была подтверждена экспериментально на бактериальных заквасках (БЗ) и концентратах (БК).
На электрофореграмме продуктов амплификации ДНК гена 16S рРНК различных бактериальных заквасок с использованием синтезированных праймеров фрагменты искомого размера (737 п.н. и 612 п.н.) наблюдаются лишь в тех дорожках агарозного геля, куда нанесены пробы ДНК лактобактерий видов L. acidophilus и L. bulgaricus. В дорожках геля, соответствующих пробам ДНК бактерий родов Bifidobacterium и Streptococcus не наблюдается положительных сигналов. Теоретически обоснованная специфичность пар видоспецифичных праймеров была подтверждена экспериментально на различных субстратах (рис. 2) [6].
выводы. Изучение биохимических свойств штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus В-3141, В-3964, В-6515, В-6516, В-6545 показало, что они неспособны сбраживать пентозы, так как ферментация происходит по гликолитиче-скому пути. Все они хорошо ферментируют лактозу. Биохимические признаки изучаемых штаммов различны, что облегчает их идентификацию классическими методами.
Полный анализ нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей синтез 16S рРНК лактобактерий, позволил выявить участки ДНК наиболее специфичные к
рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК: а) гена 16S рРНК бактерий рода Lactobacillus с использованием пары родоспецифичных праймеров 16S for и 16S rev 1 - Бифидумбактерин (штамм Bifidumbacterinbifidum); 2 - БЗ ацидофильная палочка невязкая (L. acidophilus); 3 - БЗ болгарская палочка вязкая (L. bulgaricus); 4 - Streptococcusthermophilus 17Т; М - ДНК маркер (п.н.); б) генома представителей рода Lactobacillus, содержащихся в различных субстратах 1 - БК для йогурта КТСБ; 2 - БЗ для йогурта БЗ-СТБп; 3 - БЗ болгарская палочка невязкая; 4 - БЗ болгарская палочка вязкая; 5 - Отрицательный контроль H2O; 6 - Положительный контроль (ДНК L. delbrueckii subsp. bulgaricus Л 20/2); М - маркер размерности ДНК (п.н.).
бактериям вида L. delbrueckii subsp. bulgaricus. В резуль- Сконструированную систему праймеров для выявления
тате были синтезированы праймеры, входящие в состав гена 16S рРНК можно использовать в реакции в качестве
тест-системы, которые позволяют выявлять отличия лак- видоспецифической для L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Ее
тобактерий от других видов микроорганизмов. применение будет способствовать расширению возмож-
Оптимальные параметры реакции: 950С - 200 с - 1 цикл, ностей исследователей при молекулярно-генетической
[620С - 50 с, 950С - 20 с] - 25 циклов, 720С - 120 с - 1 цикл. характеристике лактобацилл.
Литература.
1. Ермолаев В.А., Комарова Н.А., Курбанова М.Г. Интенсификация процесса вакуумного обезвоживания молочно-белковых продуктов //Хранение и переработка сельхозсырья. 2012. № 2. С. 8-11.
2. Курбанова М.Г., Масленникова С.М., БондарчукО.Н. Исследование закономерностей получения кислотныхгидролизатов казеина // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2013. № 12 (110). С. 101-105.
3. Ботина С.Г. Видовая идентификация и паспортизация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования / Молочная промышленность. 2008. № 3. С. 52-54.
4. Torriani S., Zapparoli G., Dellaglio F. Use of PCR-Based methods for rapid differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis//Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. № 10. Р. 4351-4356.
5. Питательные среды для микробиологического контроля качества лекарственных средств и пищевых продуктов: справочник/ В.А. Галынкин, Н.А. Заикина, В.И. Кочеровец, И.З. Курбанова; под ред. В.А. Галынкина и В.И. Кочеровца. СПб.: Проспект науки, 2006. 336 с.
6. Беспоместных К.В., Короткая Е.В. Идентификация бактерий рода Lactobacillus с использованием ПЦР-тест-системы// Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2011. № 7-8. С. 109-117.
development of TEST-SYSTEMS for THE iDENTiFicATioN oF MicRooRGANiSMS
of the bacterial ferments
K.V. Bespomestnykh
Kemerovo State Institute of Agriculture
Summary. This article presents the results of research to develop a PCR-test-system for indication and identification of lactic acid bacteria starter cultures used in the manufacture of dairy products. The nucleotide sequence of DNA encoding 16S rRNA synthesis of bacteria of the genus Lactobacillus, submitted to GenBank, to identify conserved regions of nucleic acid sequences and for laying the genus-specific species-specific primers. Designed new genus-specific and species-specific primers for the identification of bacteria of the genus Lactobacillus, with significant differences from other lactic acid bacteria genera and species. Theoretical specificity synthesized primers confirmed experimentally bacterial ferments, concentrates and dairy products. Revealed that virtually created primers have the highest degree of homology to the nucleotide sequence of DNA sections 16S rRNA microorganisms L. delbrieckii subsp. bulgaricus and have high specificity. They can detect a particular species of microorganism the difference with respect to other bacteria and to determine their quantitative content in the product. The optimal values of the 16S rRNA gene amplification of lactic acid bacteria (temperature, incubation time, number of cycles): 95 0С - 200 sec - 1 cycle [62 0С - 50 sec, 95 0С - 20 sec] - 25 cycles of 72 0С - 120 sec - 1 cycle. A comparative evaluation of the species specificity of PCR with the classical biochemical methods. The results of identification of species other L. bulgaricus and Lactobacillus obtained using polymerase chain reaction are comparable to the classical biochemical identification methods based on different species saccharolytic activity of lactobacilli. Experimentally confirmed the higher specificity and sensitivity of PCR-test-systems for the identification of lactic acid bacteria belonging to the bacterial starters. Studies have been conducted on a wide range of dairy products. Keywords: polymerase chain reaction primers, bacteria of the genus Lactobacillus, milk products , quality control.
УДК 663.52+663.03
перспективы использования экструдата РЖИ в биотехнологии этанола
A.Ю. ШАРИКОВ, кандидат технических наук, научный сотрудник
B.И.СТЕПАНОВ, кандидат технических наук, зав. отделом
В.В. ИВАНОВ, кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник
Л.В. РИМАРЕВА, член-корреспондент Россельхозака-демии, зам. директора
Н.И. ИГНАТОВА, старший научный сотрудник Л.И. СКВОРЦОВА, научный сотрудник ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии E-mail: charikov@yandex.ru
Резюме. Основные тенденции развития биотехнологии этанола - повышение концентрации перерабатываемых сред и использование трудноперерабатываемого зернового сырья, прежде всего, ржи. Одновременная их реализация в рамках традиционной технологии ограничена в силу резкого ухудшения реологических свойств высококонцентрированных ржаных гидролизатов. В качестве альтернативы традиционной водно-тепловой обработке при подготовке сырья к осахариванию предложено использование варочной экструзии. Проведены исследования влияния экструзии ржи на процесс ее дальнейшей биконверсии
в этанол. Показана возможность получения гидролизатов ржи с концентрацией 30% растворимых сухих веществ с приемлемыми реологическими свойствами. На этапе получения гидролизата установлена необходимость использования совместно с альфа-амилазой и протеазой гемицеллюллитического ферментного комплекса в количестве не менее 0,15 единиц ксиланазной способности на 1 г сухих веществ. На стадии разжижения уже к 30 мин. биокатализа динамическая вязкость опытного гидролизата ржи снизилась до 0,5 Пас, что свидетельствует о ее пригодности для дальнейшей биоконверсии. По результатам бродильных проб с использованием осмофильной расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae концентрация спирта в браге и выход спирта опытного образца из экструдата ржи составили 15,09 об.% и 64,7 дал/т условного крахмала соответственно, что на 1 об.% и 2,25 дал/т условного крахмала выше, чем в контроле, предусматривающем применение механико-ферментативной обработки. Концентрация побочных метаболитов спиртового брожения в опытном образце браги составила 2844 мг/дм3, в контроле - 4664 мг/дм3. Максимальные различия отмечены для изоамилола, 2-фенилэтанола и изобутанола. По содержанию летучих кислот, сложных эфиров и альдегидов отличия не существенны. Экструзия ржи обеспечивает значительное сокращение времени подготовки зернового сырья к осахариванию и улучшение биохимических показателей брожения концентрированного ржаного сусла: увеличивается выход спирта, снижается количество побочных метаболитов.
