CC BY
12демического процесса ветряной оспы. Эпидемиология и вакцинопрофилактика.2010, 6 (55): 17-22.
4. Дружинина Т.А. Особенности эпидемиологии ветряной оспы в Ярославской области. Опыт вакцинопрофилактики. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011, 1 (56): 28-32.
5. Дубоделов Д.В. Эпидемиологическая характеристика и специфическая профилактика ветряной оспы и краснухи в воинских коллективах: автореф. дисс. канд. мед. наук. М., 2013.
6. Ерофеев Ю.В., Костенко М.Б., Мигунова О.В. и др. Вакцинация — приоритетное направление профилактики (опыт Омской области по организации иммунизации против ветряной оспы). Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2012, 3 (64): 45-47.
7. Казанова А.С., Лавров В.Ф., Дубоделов Д.В. и др. Ветряная оспа и опоясывающий лишай: история и перспективы вакцинопрофилактики. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2011, 2: 36-41.
8. Краснова Е.И., Гайнц О.В., Гаврилова Н.И. и др. Геморрагическая форма ветряной оспы у детей: исходы и возможности профилактики. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2012, 3 (64): 31-35.
9. Лавров В.Ф., Казанова А.С., Кузин С.Н. и др. Ветряная оспа и опоясывающий лишай: особенности заболеваемости и клинических проявлений. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2011, 3: 54-60.
10. Рыбин В.В, Гладинец И.В., Казанова А.С. и др. Некоторые особенности эпидемического процесса ветряной оспы и иммунного статуса военнослужащих по призыву внутренних войск МВД России. Военно-медицинский журнал. 2013, 1: 55-57.
11. Galil K., Fair E., Mountcastle N. et al. Younger age at vaccination may increase risk ofvaricella vaccine failure. J. Infect. Dis. 2002, 186 (1): 102-105.
12. Marin M., Meissner H.C., Seward J.F. Varicella prevention in the United States: a review of successes and challenges. Pediatrics. 2008, 122 (3): e744-751.
13. Roush S.W., Murphy T.V. Vaccine-preventable disease table working group. Historical comparisons of morbidity and mortality for vaccine-preventable diseases in the United States. JAMA. 2007, 298 (18): 2155-2163.
14. Seward J.F., Marin M., Vázquez M. Varicella vaccine effectiveness in the US vaccination program: a review. J. Infect. Dis. 2008, 197 (2): S82-89.
15. Takahashi M., Asano Y., Kamiya H. et al. Development of varicella vaccine. J. Infect. Dis. 2008, 197 (2): S41-44.
Поступила 17.06.14
Контактная информация: Казанова Александра Сергеевна, к.м.н.,
105064, Моска, М. Казенный пер., 5А, р.т. (495)917-49-00
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
М.Н.Гапон1, Н.Р.Телесманич2, Л.Н.Терновская1, С.О.Чайка2, И.А.Чайка2, З.И.Микашинович2, Т.Б.Чернухина2, Т.И.Твердохлебова1
ПРОТЕОМНЫЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СВЕЖЕВЫДЕЛЕННЫХ ШТАММОВ ЭШЕРИХИЙ
Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии; 2Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону
Цель. Времяпролетный масс-спектрометрический анализ свежевыделенных от человека популяций кишечной палочки для идентификации маркеров протеома, характерных для гемолитических и негемолитических штаммов, эшерихий — ассоциантов условно патогенных бактерий. Материалы и методы. 20 штаммов монопопуляции гемолитических эшерихий; 100 штаммов монопопуляции негемолитических эшерихий; 15 негемолитических штаммов, выделенных из ассоциации с условно патогенными бактериями. Белковое профилирование на масс-спектрометре MALDI-TOF MS АШ;ойех «Вгикег Daltonik». Результаты. Значение внутри вида масс-заряда пика со 100% интенсивностью равного
9000 Да может служить дифференциальным признаком выявления гемолитических эше-рихий при масс-спектрометрическом биотипировании. Заключение. Даны протеомные характеристики штаммов разных популяций внутри вида Escherichia coli. Установлены таксон-специфические маркеры для протеомной дифференциации популяции эшери-хий.
Журн. микробиол., 2015, № 3, С. 83-88
Ключевые слова: эшерихии, масс-спектрометрия, масс-пик-лист, биотипирование
M.N.Gapon1, N.R. Telesmanich2, L.N. Ternovskaya1, S.O. Chaika2,
I.A. Chaika2, Z.I. Mikashinovich2, T.B. Chernukhina2, T.I. Tverdokhlebova1
PROTEOMIC MASS-SPECTROMETRIC ANALYSIS OF FRESHLY ISOLATED ESCHERICHIA COLI STRAINS
1Rostov Research Institute of Microbiology and Parasitology; 2Rostov State Medical University, Rostov-on-Don, Russia
Aim. Time-of-flight mass-spectrometric analysis of colon bacilli populations freshly isolated from humans for identification of proteome markers, that are characteristic for hemolytic and non-hemolytic strains, E.coli — associants of opportunistic bacteria. Materials and methods. 20 strains of monopopulation of hemolytic E.coli; 100 strains of monopopulation of non-hemolytic E.coli; 15 non-hemolytic strain, isolated from association with opportunistic bacteria. Protein profiling on MALDI-TOF MS Autoflex «Bruker Daltonik» mass-spectrometer. Results. Value within species for mass-charge peak with 100% intensity of 9000 Da could be a differential sign for isolation of hemolytic E.coli during mass-spectrometric biotyping. Conclusion. Proteomic characteristics of strains from various populations within E.coli are given. Taxon-specific markers for proteomic differentiation of E.coli populations are established.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 3, P. 83—88
Key words: Escherichia coli, mass-spectrometry, mass-peak-list, biotyping
Изменение нормального состава микробиоценоза толстого кишечника, определяемое понятием дисбактериоз, является широко распространенным состоянием и, согласно современным данным, представляет патогенетическую основу разнообразных по локализации и проявлению патогенетических процессов, включая такие как липидный дистресс-синдром, сахарный диабет 2 типа, ожирение, атеросклероз, метаболический синдром [1, 2].
С целью ранней диагностики и выявления людей, составляющих группу риска развития подобных состояний, актуальной задачей является определение специфических особенностей состава микробиоценозов, позволяющих разработать методические критерии диагностики и прогнозирования различных заболеваний [3].
В предыдущих наших исследованиях было показано, что в этиологической структуре дисбактериозов толстого кишечника людей значительное место занимают дис-бактериозы, обусловленные эндогенными факторами [6], одним из которых являются дисфункциональные нарушения желчевыделительной системы, а микробиологическим маркером этих состояний служит наличие гемолитических эшерихий в составе микробиоценоза толстого кишечника [7]. Коррекция функции желчного пузыря приводит к исчезновению гемолитического признака у эшерихий, что свидетельствует о его индуцибельности.
В работе [3] подчеркнуто, что в основе бактериально-гостальных отношений лежит полиморфизм клонов кишечной палочки. При этом выделено четыре кластера эшерихий (мутуалисты, коменсалы, паразиты, случайные симбионты человека), в связи
с чем предложен поиск маркеров, способных обеспечить их дифференциальную характеристику. Поиск маркеров протеома у различных кластеров эшерихий, в частности, у гемолитических и негемолитических форм является актуальной проблемой, расширяющей перспективы дифференциальной диагностики, анализа происхождения факторов патогенности эшерихий и совершенствования подходов к коррекции дисбиотических состояний.
Наше внимание привлек метод масс-спектрометрии на основе матричноактиви-рованной лазерной десорбции (MALDI) в комплексе с анализатором TOF (Time of Flight). Принцип метода основан на детекции прибором белковых спектров молекул, которые в случае характеристики микроорганизмов составляют комплекс константных рибосомальных белков, характерных для изучаемого микроорганизма, что открывает перспективы протеомного анализа штаммов определенного вида и поиска сходств и отличий в их белковых профилях.
В связи с изложенным, целью нашего исследования явилась идентификация про-теомных маркеров, характерных для гемолитических и негемолитических эшерихий, а также эшерихий-ассоциантов условно патогенных энтеробактерий путем масс-спектрометрического анализа свежевыделенных от человека штаммов кишечной палочки.
Популяции кишечной палочки выделяли и идентифицировали бактериологическим методом в соответствии с ОСТ 2003 г. от людей, проходивших обследование на дисбактериоз толстого кишечника в Ростовском НИИ микробиологии и паразитологии. УЗИ людей на наличие дисфункциональных нарушений желчного пузыря (ДЖВП) осуществляли в медицинском лечебно-диагностическом центре ООО «Альянс-2000».
Для масс-спектрометрического анализа было взято 135 свежевыделенных штаммов кишечной палочки, из них 20 штаммов гемолитических эшерихий (монопопуляция), выделенных от одного человека с ДЖВП; 100 штаммов негемолитических эшерихий (монопопуляция) от одного человека; 15 штаммов негемолитических вариантов, выделенных из ассоциации с условно патогенными энтеробактериями (клебсиеллой, энтеробактером) от одного человека.
Исследования проводили с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF MS Autoflex «Braker Daltonik» (Германия).
Пробоподготовку осуществляли с применением в качестве матрицы а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (HCCA, Bruker Daltonik). Все образцы штаммов проводили через процедуру экстракции трифторуксусной кислотой (80% ТФУ) для создания репрезентативных спектров. Супернатант штаммов в количестве 0,5 мкл помещали на ячейки MSP-чипа и после полного высыхания наслаивали 0,5 мкл раствора матрицы. В программе Flex control проводили обстрел лазером в ручном режиме. В качестве стандарта калибровки использовали коммерческий препарат DH5-alpha Escherichia coli (Bruker bacteria test standart). В качестве контроля использовали масс-пик-листы (MSP-peak-list) и графики масс-спектров референтных штаммов: E.coli ATCC 25922 CHB; E.coli ATCC 35218 CHB; E.coli ATCC 25922 TH4; E.coli B 421 UF4; E.coli DH5-alpha BR4; E.coli DSMS 300 83 THAM; E.coli ESB4-EA-RSS-1528TCHB базы данных Biotyper.
Для визуализации, постобработки и анализа полученных спектров, в частности, масс-пик-листов штаммов, использовали программу Flex analysis. Измерения осуществлялись в автоматическом режиме с контролем мерцания, частотой измерения лазера от 50 до 60 Гц, излучения лазера 1:25 кВ, с использованием источника ионов № 1 со значением 19,52 кВ и источника № 2 со значением 18,26 кВ и коэффициентом усиления детектора 27272 В.
В процессе сравнительного анализа спектров представителей разных популяций E.coli сравнивали такие параметры, как положение пиков, их частота и интенсивность.
Графическое изображение спектра, состоящее из пиков разной интенсивности (коротких и длинных), является отображением масс-пик-листа, который представляет собой таблицу с числовыми значениями основного белкового спектра каждого штамма, где в первом столбце — молекулярная масса белков (их масс-заряд — m/z), во втором — количество белков с конкретной молекулярной массой, выражающееся в интенсивности пика (в %), на графике в высоте пика [5].
Нами выявлены общие закономерности строения протеома, характерные для всех популяций вида E.coli : наличие у всех штаммов 70 пиков; наличие одного пика со 100% интенсивностью; минимальное количество высокомолекулярных пиков, имеющих m/z >10 000 Da; низкомолекулярные белки представлены спектром от 3000 до 4000 Da, практически равное количество пиков с m/z 3000 — 4000 Da у всех штаммов низкой интенсивности; отсутствие у всех штаммов пептидов с m/z до 2500 Da, что также соотносится с характеристикой референтных профилей E.coli из базы данных Biotyper.
В качестве маркеров, дифференцирующих монопопуляции, выявлены характерные признаки. Популяция гемолитических эшерихий отличалась тем, что у всех без исключения штаммов самый высокий пик со 100% интенсивностью имел m/z 9063
— 9066 Da. У негемолитических штаммов пик со 100% интенсивностью имел m/z в диапазоне 5381 — 5410 Da и только у 10% m/z составлял 9713 — 9745 Da.
Популяция негемолитических эшерихий—ассоциантов была гетерогенна по данному признаку — у 25% штаммов 100% пик имел m/z 5382 — 5383 Da (как у негемолитических), у 42 % — m/z 100% пика составлял 9740 — 9743 Dа (как у гемолитических), а 6% обнаруживали 100% пик с m/z 6258 Da.
Для негемолитической монопопуляции характерно наличие двух высокомолекулярных пиков с интенсивностью до 10% m/z 10 140 Da и 10 280 Da, что соотносится с данными референтных штаммов, имеющих такие же пики. Монопопуляция гемолитических эшерихий имеет один высокомолекулярный пик m/z 10 500 Da низкой интенсивности, составляющей 15%. Однако у некоторых гемолитических штаммов появляются белки с молекулярной массой m/z 14 000 Da, что отсутствует как у гемолитической популяции, так и у референтных образцов.
Масс-спектры негемолитической популяции в целом интенсивнее, что выражается наличием преимущественно высоких пиков (интенсивностью 40 — 90%), большим количеством низкомолекулярных белков с m/z 3000 — 4000 Da с высокой интенсивностью.
Весь спектр гемолитических штаммов отмечает наличие преимущественно коротких пиков низкой интенсивности (до 30%) и только двух пиков высокой интенсивности (70 — 100 %).
Применение MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа для идентификации различных патогенов бактериального и грибкового происхождения на основе базы данных Biotyper, включающей 5000 референтных профилей микроорганизмов, является практически рутинным методом, широко освещенным в мировой литературе [4, 9].
Однако программное обеспечение Biotyper 3.0 позволяет получать персональные виртуальные коллекции спектров изучаемых популяций, а программа Flex analysis
— анализировать сходство и отличие вновь появляющихся и исчезающих протеомных признаков [5], что обеспечивает не только видовую идентификацию, но и получение новых данных об изменчивости видов.
E. coli является тем микроорганизмом, изучение которого лежало в основе идентификации MALDY, так как первые работы были посвящены рутинной идентификации эшерихий и использованию кишечной палочки в качестве бактериального стандарта калибровки для масс-спектром етрии [8]. Большинство современных статей посвящено препаративной идентификации отдельных белков E. coli, предварительно выделенных посредством двумерного электрофореза. Изуче-
ние межпопуляционных отличий с помощью анализа спектров коллекций кишечной палочки, выделенных от людей, в литературе не описаны.
Нами установлено, что один пик самой высокой интенсивности (100%) может служить дифференциальным протеомным таксономическим признаком, по которому можно определить наличие у штаммов E. coli гемолитических свойств, так как только у гемолитических эшерихий пик со 100 % интенсивностью имеет m/z 9063 — 9066 Да, в отличие от негемолитической популяции, имеющей данный пик с m/z 5381 — 4100 Да.
Популяция эшерихий-ассоциантов гетерогенна по данному признаку, хотя и относится к негемолитической группе. Молекулярные массы 100% пика представлены масс-зарядами 9000, 5000, 6000 Да. Референтные штаммы E. coli базы данных Biotyper имеют 100% пик с m/z 5000 Да, что характерно для негемолитической популяции.
Данные факты являются косвенным подтверждением версии изменчивости негемолитических эшерихий в условиях организма хозяина и индуцибельности гемолитического признака. В целом спектр белков гемолитических вариантов отличается меньшей интенсивностью (высота пиков до 30%) и наличием только двух пиков высокой интенсивности (70 — 100%).
Проведенные нами исследования позволяют конкретизировать данные масс-спектрометрической идентификации, дифференцируя гемолитические варианты от негемолитических по 100% пику, тогда как программа Biotyper не позволяет проводить идентификацию гемолитических вариантов и определяет только принадлежность к виду Escherichia.
Проведенные ранее исследования позволили установить, что в составе микробиоценозов толстого кишечника людей с дисфункциональными нарушениями желчевыделительной системы гемолитические эшерихии встречаются достоверно чаще, чем у условно здоровых людей, что позволяет полагать, что нарушение поступления желчи в просвет кишечника, наблюдаемое при ДЖВП, возможно, является одним из факторов, способствующих вегетированию гемолитических эшерихий в микробиоценозах толстого кишечника. Однако данный вид патологии, вероятно, является далеко не единственной причиной, приводящей к появлению в составе микрофлоры кишечника гемолитических эшерихий. Возможно, что на их вегетиро-вание оказывают влияние и другие изменения в желчеобразующих и желчевыдели-тельных органах, что требует дальнейшего изучения.
Очевидно, что появление гемолитических эшерихий в составе полостной микрофлоры толстой кишки можно рассматривать как индикатор, реагирующий на изменения гомеостаза хозяина. С этих позиций, ранняя и быстрая идентификация гемолитических эшерихий с помощью таксономических протеомных маркеров является экспресс-методом выявления группы риска формирования заболеваний желчевыводящих путей и пищеварительной системы среди условно здоровых людей.
Л ИТЕРАТУРА
1. Бондаренко В.М. Роль условно патогенных бактерий при хронических воспалительных процессах различной локализации. Тверь,Триада, 2011.
2. Бондаренко В.М., Рябиченко Е.В. Роль дисфункции кишечного барьера в поддержании хронического воспалительного процесса различной локализации. Журн. микробиол. 2010, 3: 92-100.
3. Гриценко В.А., Бухарин О.В. Экологические и медицинские аспекты симбиоза Escherichia coli и человека. Журн. микробиол. 2000, 3: 93-99.
4. Кубанова А.А., Говорун В.М., Ильина Е.Н. Первый опыт применения метода прямого профилирования для идентификации и типирования N. gonorrhoeae. Вестник дерматологии и венерологии. 2006, 5: 25-29.
5. Телесманич Н.Р., Агафонова В.В., Чемисова О.С., Чайка И.А., Водопьянов О.С., Водопьянов А.С, Гончаренко Е.В., Теличева В.О. Протеомный масс-спектрометриче-
ский анализ и типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных на территории Российской Федерации в 2010-2012 гг. Журн. микробиол. 2014, 2: 97-99.
6. Терновская Л.Н., Гапон М.Н., Кузнецова В.М., Балицкая Л.Л., Соловьева Е.И. Этиологическая структура дисбактериозов толстого кишечника людей в г. Ростове-на-Дону. В: Актуальные вопросы инфекционной патологии. 2009, с. 308-311.
7. Терновская Л.Н., Гапон М.Н., Хиштова Н.С., Соловьева Е.И., Балицкая Л.Л. Особенности микробиоценоза толстой кишки людей с дисфункциональными расстройствами биллиарного тракта. Журн. микробиол. 2009, 3: 89-92.
8. Patrick A Pribil. Catherine fenselau characterization of Enterobacteria using MALDI-TOF mass spectrometry. Analytical Chemistry. 2005, 77 (18): 6092-6095.
9. Williamson YM., Moura H.M., Woolfitt A.R. et al. Differentiation of Streptococcus pneumoniae conjunctivitis outbreak isolates by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74: 5891-5897.
Поступила 10.12.14
Контактная информация: Гапон Марина Николаевна,к.б.н.,
344000, Ростов-на-Дону, пер. Газетный, 119, р.т. 234-90-85
©КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ 2015
О.В.Нечаева1, Е.И.Тихомирова2, Д.А.Заярский2, М.М.Вакараева2
АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЛИАЗОЛИДИНАММОНИЯ, МОДИФИЦИРОВАННОГО ГИДРАТ-ИОНАМИ ЙОДА
Саратовский государственный медицинский университет, 2Саратовский государственный технический университет
Цель. Изучение антимикробной активности полимерного соединения — полиазоли-диаммония, модифицированного гидрат-ионами йода. Материалы и методы. Изучена антимикробная активность полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода, в отношении референс-штаммов и клинических изолятов грамположительных и грамотрицательных бактерий, микроскопических грибов, а также РНК-содержащих вирусов. Результаты. Установлена высокая антибактериальная активность исследуемого соединения, особенно в отношении грамположительных бактерий. Более высокая концентрация препарата (125 — 250 мкг/мл) характеризовалась противогрибковым действием. Отмечена высокая чувствительность к полимеру вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Заключение. По результатам исследований полимерное соединение является перспективным антисептическим и этиотропным средством для борьбы с возбудителями инфекционных заболеваний.
Журн. микробиол., 2015, № 3, С. 88—92
Ключевые слова: антимикробная активность, полиазолидинаммоний, модифицированный гидрат-ионами йода
O.V.Nechaeva1, E.I.Tikhomirova2, D.A.Zayarsky2, M.M.Vakaraeva2
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF POLYAZOLIDINAMMONIUM, MODIFIED WITH HYDRATE-IONS OF IODINE
1Saratov State Medical University, 2Saratov State Technical University, Russia
Aim. Study of antimicrobial activity of a polymer compound — polyazolidinammonium, modified with hydrate-ions of iodine. Materials and methods. Antimicrobial activity of polyazolidinammonium, modified with hydrate-ions of iodine, against reference strains and clinical isolates of Gram positive and negative bacteria, microscopical fungi, as well as RNA viruses was
