CC BY
216
3. Михайлова Е.А., Воронина Л.Г., Сетко Н.П., Миронов А.Ю., Харсеева Г.Г., Жеребятьева О.О. Инфектологические аспекты урогенитальных микробных заболеваний. Оренбург: ГБОУ ВПО ОрГМа МЗ РФ; 2012.
4. Бобков Ю.А., Аль-Шукри С.Х., Горбачев А.Г., Галкина О.В., Козлов В.В., Тотолян А.А. Информативность показателей местного иммунитета при хроническом простатите. Медицинская иммунология. 2000; 2 (4): 401—8.
5. Воронина Л.Г., Михайлова Е.А., Сетко Н.П., Жеребятьева О.О., Миронов А.Ю., Харсеева Г.Г. Диагностика и лечение урогени-тальной бактериальной патологии. Методические рекомендации для врачей и слушателей факультета последипломного образования. — Оренбург: ГБОУ ВПО ОрГМА; 2012.
6. Карпищенко А.И., ред. Медицинская лабораторная диагностика. СПб: Интермедиа; 2002.
7. Меньшиков В.В., ред. Методики клинических лабораторных исследований. Справочное пособие. T. 3. Клиническая микробиология. М.: Лабора; 2009.
8. Меньшиков В.В., ред. Клиническая лабораторная аналитика. T. 4. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории. М.: Агат-Мед; 2003.
references
1. World Health Organization. Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. cambridge: cambridge university press; 2000.
2. Dolgushin I.I., Tizinger o.A., Letyaeva o.I., ziganshina T.A. condition factors antimicrobial protection reproductive tract of women with chlamydial infection before and after therapy with local magneto effects. Vestnik vosstanovitel'noy meditsiny. 2011; 5: 50—4. (in Russian)
3. Mihaylova E.A., voronina L.G., setko N.R, Mironov A.Ju., Harse-eva G.G., zherebyat'eva o.o. Infectology aspects of urogenital microbial diseases. orenburg; 2012. (in russian)
4. Bobkov Ju. a., Al'-shukri s.H., Gorbachev A.G., Galkina o.v., Kozlov v.v., Totolyan A.A. informativeness of local immunity in chronic prostatitis. Meditsinskaya immunologiya. 2008; 2 (4): 4018. (in russian)
5. voronina L.G., mihajlova E.A., setko N.R, zherebyat'eva o.o., mironov A.Yu., harseeva G.G. Diagnosis and treatment of urogenital bacterial pathologies. Guidelines for doctors and postgraduate students of the faculty of education. orenburg; 2012. (in russian)
6. Karpishhenko A.i., ed. Medical laboratory services. st. petersburg: intermedia publ.; 2002. (in russian)
7. men'shikov v.v., ed. The techniques of clinical laboratory tests: A guidebook. vol. 3. clinical microbiology. Moscow: labora; 2009. (in russian)
8. men'shikov v.v., ed. Clinical laboratory analyst. vol. 4. private Analytical Technologies in the clinical laboratory. Moscow: Agat-Med. publ.; 2003. (in russian)
Поступила 15.05.14 received 15.05.14
© КоллЕКТив АВТОРОВ, 2014 УДК 579.842.1.083.18:543.42.062.08
Телесманич Н.Р., Чайка С.о., Бодяницкая С.Ю., Чемисова о.С., Чайка и.А.
ПРИМЕНЕНИЕ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА MALDI-TOF ДЛЯ МЕЖВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИБРИОНОВ
ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, 344002, Ростов-на-Дону; Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 127994, Москва
Цель работы — использование масс-спектрометрического анализа для межвидовой дифференциации коллекционных штаммов представителей рода Vibrio и идентификация холерных вибрионов, выделенных из проб судовых балластных вод. Исследовали 207 музейных штаммов культур и 347 микроорганизмов из проб судовых балластных вод. Идентификацию микроорганизмов проводили с использованием MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Использование MALDI-биотипирования позволило выявить неточности в видовых и родовых характеристиках коллекционных штаммов V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, Shewanella, V. mimicus, усовершенствовать характеристику и качество коллекций микроорганизмов. Показано эффективное применение MALDI для мониторинга судовых балластных вод, что позволяет выявить полный вибриопейзаж патогенных и непатогенных видов. Показана возможность выявления штаммов холерных вибрионов и возбудителей холеры, ориентируясь на V. albensis на этапе отбора подозрительных колоний.
Ключевые слова: Vibrio; масс-спектрометрия; MALDI-TOF; биотипирование; score; Biotyper. N.R. Telesmanitch, S.O. Tchaiyka, S.Yu. Vodiyanitskaya, O.S. Tchemisova, I.A. Tchaiyka
the application of mass spectrometry technique maldi-tof for inter-specific differentiation of closely-related vibrio
The Rostov-on-Don anti-plague institute of Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia
The study was targeted to apply mass .spectrometry analysis for inter-specific differentiation of collection strains of representatives of genus vibrio and identification of comma bacilli extracted from samples of boat ballast waters. The samples consisted of 207 museum strains of cultures and 347 microorganisms from samples of boat ballast waters. The identification ofmicroorganisms was implemented using MALDI-TOF mass spectrometers. The application of MALDI biotyping made it possible to detect inaccuracies in specific and generic characteristics of collection strains V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, Shewanella, V. mimicus and to enhance characteristic and quality of collections of microorganisms. The effective application ofMALDI to monitor boat ballast waters is demonstrated. This technique allows detecting of complete vibrio landscape of pathogenic and non pathogenic genus. The possibility to detect strains of comma bacillus and cholera agents is demonstrated. The mode of orientation on V. albensis at the stage of selection of suspicious colonies is proposed.
Keywords: Vibrio; mass spectrometry; MALDI-TOF; biotyping; score; biotyper
Для корреспонденции: Телесманич Наталья Робертовна, науч. сотр.
Адрес: 344002, г. Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40/ E-mail: plague@aaanet.ru
Введение. Проблема особо опасных инфекций не теряет актуальности в современном мире, несмотря на развитие медицины и прогресс в технологиях. Темп жизни и глобализация приводят к распространению инфекций с одного материка на другой в крайне сжатые сроки. В сложившейся ситуации необходимы современные методы идентификации микроорганизмов, позволяющие за короткое время выявить инфекционный агент. Один из них — масс-спектрометрия, являющаяся передовым методом в мировой практике [1].
Масс-спектрометрия представляет собой аналитический метод измерения массы молекул или атомов анализируемого вещества, предусматривающий использование физических законов движения заряженных частиц в магнитных и электрических полях и позволяющий получать протеомные профили белков, пептидов, нуклеиновых кислот, а также микроорганизмов, дрожжей и грибов. MALDI-масс-спектрометрия (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) — матрично-ак-тивированная лазерная десорбция/ионизация — это метод подачи исследуемого материала, ионизации твердофазного вещества лазером с образованием однозарядных ионов, ускорения, разделения и детекции их в вакууме. MALDI-TOF (Time-of-Flight — времяпролетный) — принцип устройства анализатора масс-спектрометра, в котором заряженные частицы разделяются по времени пролета определенного расстояния. При этом время пролета частицы пропорционально отношению массы данной частицы к ее заряду.
В основе биотипирования микроорганизмов при помощи масс-спектрометра лежит программа Biotyper с базой данных, в которой заложены белковые профили около 5 тыс. видов микроорганизмов, включая мицелиальные грибы, дрожжи, грамотрицательные и грамположительные бактерии. Клетки каждого вида микроорганизмов имеют свой набор рибосо-мальных белков, который анализируется прибором. Программа Biotyper суммирует единичные спектры белковых молекул, составляющие профиль белковых масс микроорганизма. Состав константных рибосомальных белков уникален для каждого вида микроорганизмов, что позволяет проводить достоверную идентификацию. Программа сравнивает полученный спектр с профилями белковых масс, находящихся в базе данных. Результат получают в виде спектров-графиков белков или в виде масс-пик-листов, отражающих количество белков с конкретными молекулярными массами. Чувствительность метода — 104—105 микробных клеток на ячейку или 107—108 микробных клеток на 1 мл.
Работу проводили в рамках двух научных тем Ростовского противочумного института "Формирование коллекций патогенных для человека вибрионов" и "Мониторинг судовых балластных вод". В 2012 г. группа ученых [2] занималась исследованием искусственно созданной модели балластных вод с изучением и характеристикой микробного состава с использованием метода масс-спектрометрии MALDI-ToF. Воду в эксперименте закачивали в танки для хранения емкостью 55 тыс. л и хранили на открытом воздухе, имитируя таким образом условия, существующие в балластных танках судов. Исследование, проведенное специалистами нашего института, направлено на изучение популяции вибрионов в пробах балластных вод судов [3], прибывающих в международные порты Ростовской области. Цель работы — использование масс-спектрометрического анализа для межвидовой дифференциации коллекционных штаммов представителей рода Vibrio и идентификация холерных вибрионов, выделенных из проб судовых балластных вод.
Материалы и методы. Материалом для исследования явились 207 музейных штаммов микроорганизмов и 347 штаммов балластных вод судов. 207 музейных штаммов, выделенных от человека и из объектов окружающей среды в период с 1986 по 2012 г., представлены 4 видами рода Vibrio: V. parahaemolyticus — 47 штаммов, V. alginolyticus — 154 штамма, V. mimicus — 4 штамма, V. fluvialis — 2 штамма. Коллекция охарактеризована по паспортным данным основных таксономических биохимических признаков рода и вида [4].
При помощи масс-спектрометра в течение лета 2012 г. исследовано 347 штаммов микроорганизмов балластных вод судов, прибывающих в международные порты Ростовской области.
Музейные штаммы выращивали на агаре Мартена с 2% NaCl при 37oC. В качестве контрольных образцов взяты типовые музейные штаммы V. alginolyticus 16463 (ATCC 17749), V. parahaemolyticus 13580 (ATCC 17802). Пробы балластных вод культивировали на агаре Мартена с 2% NaCl при 37oC. Полученные чистые культуры после пробоподготовки наносили на мишень масс-спектрометра (MSP-чип). Затем проводили исследование с использованием масс-спектрометра Bruker Daltonics (Германия) с программным обеспечением Biotyper.
Пробоподготовку выполняли следующим образом. Полученные колонии интересующих нас культур смешивали в чашке Петри с 2 мкл матрицы, представляющей собой раствор 2,5 мг а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (HCCA, "Bruker Daltonics", Германия) в 475 мкл бидистиллирован-ной воды, 500 мкл ацетонитрила и 25 мкл трифторуксусной кислоты. Матрицу готовили путем добавления 250 мкл органического растворителя (47,5% бидистиллированной воды, 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты) к 2,5 мг HCCA, затем смешивали на вортексе в течение 30 мин до полного растворения кристаллов гидроксикоричной кислоты. Далее раствор использовали в качестве матрицы для кристаллизации белков.
В качестве стандарта калибровки применяли коммерческий препарат DH5-alpha E. coli (Bruker bacteria test standart). Объект калибрования состоял из 8 рибосомальных белков E. coli с добавлением РНКазы А и миоглобина.
Программное обеспечение Biotyper для идентификации штаммов рода Vibrio осуществляют в двух режимах: ручном — Biotyper 3.0 ("Bruker Daltonics") и автоматическом — Biotyper RTS, для управления прибором используют программу Flex-control. Измерения выполняют в автоматическом режиме с контролем мерцания, частотой излучения лазера от 50 до 60 Гц и интенсивностью излучения лазера 1:25 кВ с использованием источника ионов № 1 со значением 19,52 кВ и источника № 2 со значением 18,26 кВ и коэффициентом усиления детектора 27272 В.
Результат оценивали по значению показателя достоверности идентификации score. Значение score в диапазоне от 0 до 3: значения 2.300—3.000 указывают на высокую вероятность идентификации вида (+++), значения 2.000—2.299 — на надежную идентификацию рода бактерий и возможную идентификацию вида (++), значения 1.700—1.999 — на возможную идентификацию рода (+),< 1.700 — на отсутствие надежной идентификации.
Результаты и обсуждение. Первым этапом работы была внутривидовая дифференциация V. parahaemolyticus от V. alginolyticus, представляющая некоторые трудности при бактериологическом и биохимическом подходах с целью контроля качества коллекций микроорганизмов. Штаммы этих двух видов очень тесно связаны и имеют сходные биохимические характеристики [5]. Свойством, позволяющим дифференцировать V. parahaemolyticus от V. alginolyticus, является способность к ферментации сахарозы. V. parahaemolyticus не гидролизует арабинозу в отличие от V. alginolyticus и положителен в реакции Фогеса—Проскауэра только в 80% случаев. Тест на арабинозу и сахарозу иногда дает погрешность. Поэтому для получения достоверных результатов диагностики необходимо использование дополнительных методов дифференциации и идентификации этих двух видов микроорганизмов. Наряду с V. parahaemolyticus и V. alginolyticus посредством масс-спектрометрии были типированы поступившие в 2012 г из Новороссийской противочумной станции 4 штамма V. mimicus и 2 — V. vulnificus.
С помощью масс-спектрометрического анализа типиро-вано 154 музейных штамма V. alginolyticus, из которых 95% совпали с паспортными данными и были идентифицированы
28
Продолжение статьи на стр. 37.
как V. alginolyticus при высоком значении показателя достоверности идентификации (score 2.250), 3 штамма были иденти-фированы как V. parahaemolyticus (score 2.234). Один штамм был сахарозопозитивным, что характерно для V. alginolyticus, и по данным масс-спектрометрии идентифицирован как V. parahaemolyticus. Среди 154 штаммов V. alginolyticus выявлено 4 штамма рода Shewanella (score 2.289), недавно выделенного в отдельную таксономическую группу.
Из 47 музейных штаммов V. parahaemolyticus 8 идентифицированы масс-спектрометрическим методом как V. alginolyticus (score 2.312), 4 штамма — как V. mimicus, 2 — как V. vulnificus (score 2.197) и 2 — как V. alginolyticus (score 2.348) и Providencia (score 2.280). Столь высокие показатели (> 2.197) указывают на высокую степень достоверности результатов.
Следующим этапом работы было исследование при помощи масс-спектрометрии 347 штаммов микроорганизмов балластных вод судов, прибывающих в международные порты Ростовской области в течение лета 2012 г В результате био-типирования этих штаммов идентифицировано 12 видов рода Vibrio. Помимо постоянно выделяемых видов патогенных галофильных вибрионов V. vulnificus, V. harveyi, V. fluvialis, впервые идентифицированы виды V. metschnikovii, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. furnissii, V. albensis, а также широкий спектр непатогенных вибрионов, который представлен видами V. orientalis, V. navarrensis и недавно открытыми, но еще не внесенными в каталог Берджи видами V. brasiliensis, V. rotiferianus [6].
В таблице представлены результаты поиска и анализа галофильных вибрионов в балластных водах судов, прибывших в порты Ростовской области в 2012 г. с июня по сентябрь, и средние величины степени достоверности результатов (score). Различные значения показателя score, свидетельствующие о надежной идентификации вида (score > 2.000 и > 2.300), присвоены как патогенным, так и непатогенным видам вибрионов. К группе патогенных вибрионов с высоким показателем score отнесены V. vulnificus (2.205), V. harveyi (2.181), V. furnissii (2.014), V. parahaemolyticus (2.259), V. alginolyticus (2.121), при этом с максимальным значением достоверности определен V. fluvialis (2.316); что касается непатогенных для человека вибрионов, к микроорганизмам с показателем score > 2.000 отнесены V. rotiferianus (2.074), V. navarrensis (2.017).
Низкие значения показателя достоверности идентификации (score) отмечены для V. brasiliensis (1.717), V. albensis (1.862). Такому значению достоверности можно доверять, так как исследуемая культура не идентична белковому профилю штамма, находящегося в базе данных, но является очень близкой к белковому профилю данного микроорганизма. К тому же данные белковые профили культур представлены в коммерческой базе данных по одному экземпляру. Этот факт подтверждается в таблице результатов Bruker Daltonik MALDI Biotyper Classification Results (Expended review), в которой в главной позиции Matched pattern (с английского — подобранный образец) представлен вариант микроорганизма с наибольшим значением score, а следующему за ним подобранному образцу присвоено значение score со значительной разницей (> 0,3). Показано, что при показателе score > 1.700 можно рекомендовать использовать эту величину (score) как пороговую для надежной идентификации вида [7].
Наименьший показатель величины score имеет один из представленных в таблице микроорганизмов V. metschnikovii 1.621. Программа Biotyper в таблице результатов Bruker Daltonik выдает в нескольких главных позициях Matched pattern 1 вариант микроорганизма V. metschnikovii (разных штаммов), а следующие за ними варианты ответа со значительной разницей в значениях score. Следовательно, такому значению score можно доверять. Принадлежность к данным видам подтверждена с помощью бактериологического метода.
При исследовании образцов с помощью MALDI-ToF масс-спектрометра с июня по сентябрь выявлено 35 культур V. albensis (score 1.862). В 2005 г. V. albensis отнесен к виду V. cholerae биовар albensis [6]. Биовар albensis отличается от V. cholerae способностью к биолюминесценции.
Все полученные культуры V. cholerae биовар albensis исследованы бактериологическим методом с применением схемы лабораторной диагностики холеры [5]. Все культуры, которые программа идентификации масс-спектрометра определила как биовар albensis, при исследовании традиционными методами отнесены к V. cholerae не О1/не О139-серогруппе и холерными сыворотками О1 и О139 не агглютинировались, а также не были способными к биолюминесценции. Коммерческая база данных Biotyper, поставляемая вместе с прибором, не содержит белковых профилей возбудителей холеры и других особо опасных инфекций. Наши исследования показали
Результаты поиска галофильных вибрионов в балластных водах судов, прибывших в порты Ростовской области в 2012 г.
Месяц Патогенные для человека вибрионы Score (средняя величина) Непатогенные для человека вибрионы Score (средняя величина)
вид количество вид количество
Июнь V. albensis 3 1.862 V. rotiferianus 1 2.074
V. vulnificus 1 2.205 V. navarrensis 1 2.017
Июль V. albensis 17 1.862 V. rotiferianus 1 2.074
V. vulnificus 4 2.205 V. navarrensis 4 2.017
V. harveyi 1 2.181 V. brasiliensis 1 1.717
V. fluvialis 2 2.316 V. orientalis 1 1.777
V. furnissii 1 2.014
V. parahaemolyticus 1 2.259
V. alginolyticus 2 2.121
Август V. albensis 5 1.862 V. navarrensis 4 2.017
V. vulnificus 1 2.205
V. harveyi 3 2.181
V. fluvialis 3 2.316
V. metschnikovii 1 1.621
Сентябрь V. albensis 10 1.862 V. navarrensis 2 2.016
V. vulnificus 5 2.205 V. brasiliensis 1 1.717
V. harveyi 2 2.181
V. fluvialis 1 2.316
V. furnissii 1 2.014
V. parahaemolyticus 2 2.259
возможность выявлять с помощью масс-спектрометрического метода представителей V. cholerae, ориентируясь на V. albensis на этапе отбора проб, что позволяло проводить дальнейшую идентификацию в ключе рода Vibrio бактериологическими, серологическими и биохимическими методами. Отсутствие в коммерческой базе данных масс-спектров возбудителя холеры ограничивало методику в плане идентификации холерных вибрионов. Наличие в базе данных V. albensis позволяет выявить представителей вида V. cholerae не О1/не О139-серогруппы и провести их дальнейшую идентификацию классическими методами. При внесении масс-спектров штаммов V. cholerae в базу данных [8] и построении дендрограмм, основанных на масс-спектрометрических профилях, все штаммы V. cholerae входят в один кластер дендрограммы, достоверно удаленный от других видов Vibrio.
Заключение. Для выявления возбудителей холеры в объектах окружающей среды основополагающим этапом является отбор подозрительных колоний. От этого этапа зависит эффективность обнаружения возбудителей холеры. С применением отработанной схемы отбора подозрительных колоний культур при помощи масс-спектрометрического биоти-пирования значительно повышается вероятность выявления в пробах холерных вибрионов.
Идентификация бактерий с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии представляет собой альтернативу традиционным лабораторным методам (в частности, биохимическому методу) во многих областях применения, например в экологических исследованиях. Примером этого может быть применение масс-спектрометрии в области изучения судовых балластных вод, также чрезвычайно полезным является использование масс-спектрометрического биотипирования в контроле качества коллекций микроорганизмов.
Представленный метод в отличие от традиционных микробиологических позволяет быстро и эффективно идентифицировать различные виды рода Vibrio. Использование масс-спектрометрического анализа дает возможность повысить вероятность выявления холерных вибрионов на этапе отбора подозрительных колоний и эффективность лабораторной диагностики. Показано эффективное применение MALDI-масс-спектрометрии для мониторинга судовых балластных вод, что позволяет выявить полный вибриопейзаж патогенных и непатогенных видов. Показана возможность выявления штаммов холерных вибрионов и возбудителей холеры, ориентируясь на V. albensis на этапе отбора подозрительных колоний. Уточнены характеристики коллекции 17 штаммов рода Vibrio в соответствии с их принадлежностью к роду и виду.
Отсутствие в коммерческой базе данных масс-спектров представителей возбудителя холеры ограничивает методику в плане идентификации холерных вибрионов. Наличие в базе данных V. albensis позволяет выявить представителей вида V. cholerae не О1/не О139-серогруппы и провести их дальнейшую идентификацию классическими методами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кубанова А.А., Говорун В.М., Ильина Е.Н., Верещагин В.А.,
Фриго Н.В., Припутневич Т.А. Первый опыт применения метода
прямого белкового профилирования для идентификации и типи-
рования N. gonorrhoeae. Вестник дерматологии и венерологии. 2006; 5: 25—9.
2. Emami K., Askari V., Ullrich M., Mohinudeen K, Anil Ac et al. characterization of Bacteria in Ballast Water Using MALDI-TOF Mass spectrometry. PLoS One. 2012; 7 (6): e38515.
3. Водяницкая С.Ю., Лях О.В., Рыжков Ю.В., Ломов Ю.М., Про-метной В.И., Кругликов В.Д. Проблемы водного балласта: современные аспекты. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2011; 5: 18—22.
4. Методические указания МУ 4.2.1097-02. "Лабораторная диагностика холеры" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 15 января 2002 г.). М.; 2002.
5. Дополнение к методическим указаниям "Лабораторная диагностика холеры" МУК 4.2.1097-02. Методические указания. МУК 4.2.1793-03."Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами". М.; 2003.
6. Bergey's mannal of systematic bacteriology. New York: springer; 2005; vol. 2B.
7. Маянский Н.А., Калакуцкая А.Н., Мотузова О.В., Ломинад-зе Г.Г., Крыжановская О.А., Катосова Л.К. MALDI-TOF масс-спектрометрия в рутинной работе микробиологической лаборатории. Вопросы диагностики в педиатрии. 2011; 3 (5): 20—5.
8. Чайка И.А., Телесманич Н.Р., Сеина С.О. Свидетельство о государственной регистрации базы данных "Белковые профили масс-спектров представителей вида Vibrio cholerae для программы MALDI Biotyper" № 2013620585. Российская Федерация. Заявлено 26.02.2013; регистр: 29.04.2013; опубликовано 20.06.2013.
references
1. Kubanova A.A., Govorun V.M., Il'ina E.N., Vereshchagin V.A., Frigo N.V., priputnevich T.A. The first experience of direct protein profiling method application for the identification and typing of N. gonorrhoeae. Vestnik dermatologii i venerologii. 2006; 5: 25—9. (in Russian)
2. Emami K., Askari V., Ullrich M., Mohinudeen K, Anil Ac et al. characterization of Bacteria in Ballast Water Using MALDI-TOF Mass spectrometry. PLoS One. 2012; 7 (6): e38515.
3. Vodyanitskaya s.Yu., Lyakh o.V., Ryzhkov Yu.V., Lomov Yu.M., prometnoy V.I., Kruglikov V.D. problems of a water ballast: modern aspects. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. 2011; 5: 18—22. (in Russian)
4. Methodical Regulations MUK 4.2.1097-02 "Cholera laboratory diagnostics" (affirmed by chief sanitation physician of RF on January 15, 2002). Moscow; 2002. (in Russian)
5. supplement to methodical regulations "cholera laboratory diagnostics" MUK 4.2.1097-02. Methodical Regulations MUK 4.2.1793-03. Laboratory diagnostics of diseases caused by parahemolytic and other pathogenic for humans vibrios. Moscow; 2003. (in Russian)
6. Bergey's mannal of systematic bacteriology. New York: springer; 2005; vol. 2B.
7. Mayanskiy N.A., Kalakutskaya A.N., Motuzova o.V., Lominadze G.G., Kryzhanovskaya o.A., Katosova L.K. MALDI-TOF mass-spectrometry in routine work of microbiological laboratory. Voprosy diagnostiki vpediatrii. 2011; 3 (5): 20—5. (in Russian)
8. chaika I.A., Telesmanich N.R., seina s.o. Certificate of State Registration for database "Proteomic profiles of mass-spectra of strains representing V. cholerae species for MALDI Biotyper program" No. 2013620585. Russian Federation. Appl. 26.02.2013; registr: 29.04.2013; publ.: 20.06.2013. (in Russian).
Поступила 20.11.13 Received 20.11.13
