CC BY
13вали бактериальные (58,8%), иногда бактериально-грибковые (4,4%) ассоциации, тогда как монокультуры встречались в 36,8% случаев. Сходные результаты были получены при изучении микрофлоры слизистой глотки и полости носа у часто болеющих детей [1].
Таким образом, у беременных как с признаками ОРИ так и без них со слизистой задней стенки глотки выделяли преимущественно грамположительную флору (79,3%) с доминированием стрептококков (55,9%) и стафилококков (17,1%). От беременных с симптомами ОРИ в 23,1 и 5,8% случаев выделяли S.pyogenes и M.catarrhalis, тогда как у условно здоровых женщин эти возбудители не выявлены. У женщин в периоде гестации с ОРИ и без признаков заболевания встречаемость бактериальных (57,7 и 62,5%) и бактериально-грибковых ассоциаций сопоставима (6,3 и 3,9%). Тем не менее, следует учитывать состав возбудителей у беременных без видимых симптомов острой респираторной инфекции, так как существует потенциальная угроза заражения в неонатальном периоде.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андрианова Е.Н., Снегирева Н.Ю., Рывкин А.И. Дисбиоз верхнего отдела респираторного тракта и изменения функционального состояния органов дыхания у часто болеющих детей. Педиатрия. 2009, 2: 35-39.
2. Извин А.И., Катаева Л.В. Микробный пейзаж слизистой оболочки верхних дыхательных путей в норме и патологии. Вестн. оторинолар. 2009, 2: 65-68.
3. Лопатин А.С. Диагностика и лечение ринита и риносинусита у беременных. Рос. аллергол. журн. 2006, 1. URL: http://www.allergy-journal.ru/journals/2006/1.
4. Новиков Д.К., Выхристенко Л.Р., Новиков П.Д. Иммунология и аллергология для ЛОР-врачей: Рук-во для врачей. М., ООО «МИА», 2006.
5. Пальчун В.Т., Кунельская Н.Л., Артемьев М.Е. и др. Микробный пейзаж и пути рациональной антибиотикотерапии при острых гнойных заболеваниях ЛОР-органов. Вестн. оторинолар. 2004, 5: 4-8.
6. Bartlett J.G. IDCP guidelies: management of upper respiratory tract infections. Infect Dis Clin. Practice. 1997, 6: 212-220.
7. Miravitlles M., Espinosa C., Fernandes-Laso E. et al. Relationship between bacterial flora in sputum and functional impairment in patients with acute exacerbations of COPD. Study Group of Bacterial Infection in COPD. Chest. 1999, 116: 40-46.
Поступила 17.10.13
Контактная информация: Костинов Михаил Петрович, д.м.н., проф., 105064, Москва, М.Казенный пер., 5А, р.т. (495)917-49-00
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Н.Р.Телесманич, В.В.Агафонова, О.С.Чемисова, И.А.Чайка, С.О.Водопьянов, А.С.Водопьянов, Е.В.Гончаренко, В.О.Теличева
ПРОТЕОМНЫЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ В 2010 - 2012 ГГ.
Ростовский научно-исследовательский противочумный институт, Ростов-на-Дону
Цель. Проведение сравнительного протеомного масс-спектрометрического (MS) анализа на основе использования персональной базы данных белковых масс-спектров V cholerae и генетического VNTR-типирования штаммов возбудителя холеры. Материалы и методы. Штаммы V. ^olerae О1 El Tor — 7; V ^olerae не О1/не О139 — 2. Белковое профилирование и VNTR-генотипирование штаммов проводили соответственно на масс-спектрометре MALDI TOF-MS Autoflex «Bruker Daltonics» и ГИС «Холера-штаммы-VNTR». Результаты. Установленная общность протеомного профиля эпидемических штаммов холерных вибрионов, выделенных в 2010
7. ЖМЭИ 2 № 30
97
— 2012 гг. в г. Москва, позволила определить «индийское» происхождение токсигенного штамма, изолированного в г. Таганрог в 2011 г. Идентифицированы m/z белков, отличающие штаммы V сЬо1егае О1 от не О1/не О139. Протеомный анализ подтверждают результаты VNTR-генотипирования. Заключение. Используя коллекцию масс-спектров V cholerae, возможно проводить изучение и типирование представителей V cholerae с определением их происхождения и филогенетического родства.
Журн. микробиол., 2014, № 2, С. 97—101
Ключевые слова: Vibrio cholerae, масс-спектрометрический анализ, база данных белковых профилей
N.R.Telesmanich, V.V.Agafonova, O.S.Chemisova, I.A.Chaika, S.O.Vodopianov, A.S.Vodopianov, E.V.Goncharenko, V.O.Telicheva
PROTEOME MASS-SPECTROMETRIC ANALYSIS AND TYPING OF VIBRIO CHOLERAE STRAINS ISOLATED IN THE TERRITORY OF RUSSIAN FEDERATION IN 2010 - 2012
Rostov Research Institute of Plague Control, Rostov-on-Don, Russia
Aim. Conduction of a comparative proteomic mass-spectrometric (MS) analysis using a personal database of V. cholerae protein mass-spectra and genetic VNTR-typing of cholera causative agent strains. Materials and methods. V. Лolerae О1 El Tor strains — 7, V. Лolerae non O1/non O139 — 2. Protein profiling and VNTR-genotyping of strains was carried out on MALDI TOF-MS Autoflex (Bruker Daltonics) mass-spectrometer and SIS Cholera-strains-VNTR. Results. The established community of a proteomic profile of epidemic cholera vibrio strains isolated in 2010 — 2012 in Moscow allowed to determine Indian origin of a toxigenic strain isolated in Taganrog in 2011. M/z proteins distinguishing V. cholerae О1 and non O1/non O139 strains were identified. Proteomic analysis confirms the results ofVNTR-genotyping. Conclusion. Study and typing of V. cholerae members with determination of their origin and phylogenetic relationship is possible using a collection of V. cholerae mass-spectra.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 2, P. 97—101
Key words: Vibrio cholerae, mass-spectrometric analysis, protein profile database
На протяжении последних лет проблема завоза возбудителя холеры на территорию РФ не перестает быть актуальной, что диктует необходимость совершенствования методических подходов, направленных не только на идентификацию, но и на анализ происхождения и родственности штаммов [1 — 4]. Наше внимание привлек метод масс-спектрометрии, в котором разделение ионов разных масс происходит за счет матрично-активированной лазерной десорбции (MALDI) в комплексе с анализатором TOF (Time of Flight), в котором частицы разной массы (заряда) разделяются по времени пролета определенного расстояния. Компьютерная программа MALDI Biotyper сравнивает спектр белковых масс изучаемого микроорганизма с профилями масс, находящихся в базе, содержащей, в том числе, и информацию о белковых спектрах представителей рода Vibrio [6 — 8]. В последнее время получает широкое распространение комплекс генетических методов типирования микроорганизмов на основе ПЦР-анализа — мультилокусный анализ вариабильных тандемных повторов (MLVA), мультилокусное сиквенс-типирование (MLST), типирование по полиморфизму единичных нуклеотидных замен (SNP) и др. Внедрение технологий масс-спектро-метрического анализа делает возможным развитие методов типирования холерных вибрионов, отслеживая изменения их протеома, что, в свою очередь, возможно только на основе создания коллекций спектров штаммов.
Цель работы — проведение сравнительного протеомного масс-спектрометриче-ского (MS) анализа на основе использования персональной базы данных белковых
масс-спектров V cholerae и генетического VNTR-типирования штаммов возбудителя холеры.
Идентификацию и типирование штаммов холерных вибрионов методом MALDI-TOF-MS проводили с помощью созданной персональной базы данных [5]. Белковое профилирование штаммов холерных вибрионов осуществляли с помощью масс-спектрометра MALDI TOF-MS Autoflex «Bruker Daltonics» (Германия) с программным обеспечением Biotyper. Для создания референс-библиотеки масс-зарядов m/z были использованы 100 паспортизированных музейных штаммов, охарактеризованных по комплексу показателей: принадлежность к серогруппе, биовару, объекту и году выделения, наличие генов холерного токсина (ctxAB) и токсинкорегулируемых пилей адгезии (tcpA). Подготовку чистых культур для создания библиотек спектров проводили с учетом требований биологической безопасности. Все образцы проводили через процедуру экстракции трифторуксусной кислотой (80% ТФУ) для создания репрезентативных спектров, а также с целью обеззараживания культур холерных вибрионов. Полученный супернатант проверяли на жизнеспособность при помощи высевов на стерильность. Стерильный супернатант в количестве 0,5 мкл помещали на ячейки MSP-чипа и после полного высыхания наслаивали 0,5 мкл раствора матрицы (а-циано-4-гидроксикоричная кислота в растворе ацетонитрила на трифторуксусной кислоте). В программе Flex Control проводили «обстрел» в ручном режиме и снимали до 70 спектров с каждой ячейки с образцом. С помощью программы MALDI Biotyper 3.0. открывали сохраненные спектры. Образцам (паттернам) присваивали номер и паспортные данные штамма, характеризующие вид, биовар, серологическую группу, наличие генов токсинообразования, год и объект выделения.
Для типирования на основе созданной библиотеки спектров были взяты профили штаммов: 2010 и 2012 гг., выделенные от людей, прилетевших в Москву из Индии — V. cholerae El Tor tcp+ctx+ — 19187; 19187/2; 19188; 19191 (год выделения 2010); V cholerae El Tor tcp+ctx+ — 19242 и 19243 (год выделения 2012, от одного человека); токсигенный штамм, выделенный из акватории порта Таганрог в 2011 г. — V cholerae El Tor tcp+ctx+ — Р-19241. А также штаммы V. cholerae не О1/не О139 ctx- tcp-, выделенные от людей в г. Таганрог в 2011 г. (Р-19260 и Р-19261). Амплификацию ДНК проводили с использованием авторских специфических праймеров к VNTR локусам холерных вибрионов: VcA, VcB, VcI, VcD, VcG. Результаты обрабатывали с помощью стандартного программного обеспечения. Размеры аллелей рассчитывали с использованием авторской программы GEL1.0. и программы Quatity One 4.40, «Bio-Rad». В качестве маркеров молекулярных стандартов использовали ДНК штаммов с известной аллельной формулой. Кластерный и территориально-пространственный филогенетический анализ токсигенных штаммов 2010 — 2012 гг. осуществляли на основе построения дендрограмм с использованием персональной базы данных «Белковые профили масс-спектров представителей вида V cholerae для программы MALDI-Biotyper» и геоинформационной системы (ГИС) «Холера-штаммы-VNTR» с учетом полиморфизма аллельного состояния исследованных VNTR-локусов, а также открытого программного обеспечения Phylip 3.6 [3, 4, 6 — 8]. Изучение происхождения токсигенных штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории РФ в 2010 — 2012 гг., осуществляли на основе построения дендрограмм, степени сходства и отличия белковых профилей штаммов. Изучаемая нами выборка штаммов разделилась на 2 четких кластера. В нижний кластер вошли все эпидемически опасные штаммы, выделенные от людей, приехавших в Москву из Индии в 2010 г. (3 чел. — 4 штамма), в 2012 г. (1 чел. — 2 штамма). Эффективность типирования демонстрируется тем, что токсигенный V cholerae (Р-19241), выделенный в 2011 году из воды порта Таганрога, занял место в середине этой группы, что свидетельствует о его «индийском» происхождении. Верхний кластер представлен вибрионами не О1/неО139 серогрупп — атоксигенными штаммами, выделенными в 2011 году от людей в Таганроге. Результаты
VNTR-типирования практически зеркально отражают данную ситуацию, где токси-генный штамм из воды (2011 г.) демонстрирует родство с «индийскими» штаммами. Расхождение в дендрограммах VNTR и MS наблюдаются по одному штамму V chole-rae El Tor 19243 (от человека, 2012 г.). Верхний кластер у обеих дендрограмм представлен вибрионами не О1/не О139 серогрупп, атоксигенными, выделенными от людей в 2011 году в городе Таганрог. В этот кластер уникальным образом попал один из штаммов V cholerae El Tor 19243, выделенный от больного, прилетевшего из Индии в 2012 г., но второй штамм V.cholerae El Tor 19242 от того же человека остался в группе соответствующих ему «индийских» штаммов. Штаммы 19242 и 19243 были идентифицированы бактериологическим методом и в режиме масс-спектрометрического анализа как V. cholerae El Tor ctx+.
Масс-спектр, состоящий из пиков разной интенсивности, является графическим отображением масс-пик листа (MSP List) созданной нами базы, который представляет собой таблицу всех молекулярных масс-профилей. При анализе этих данных видно, что V. cholerae не О1/неО139 Р-19261 (человек, Таганрог, 2011) имеет один интенсивный пик 100% с m/z 4367,40 Да. V. cholerae El Tor 19243 (человек, Москва, 2012) имеет такой же пик (4367,40 Да) 100%, и еще только один близкий по интенсивности (m/z 3203,30 Да; интенсивность — 43,9%). Вместе с тем, второй штамм от того же человека (V. cholerae El Tor 19242) имеет целых 6 пиков с интенсивностью выше 40%; из них один пик 100% с иным m/z 4278, что и определяет расхождение в дендрограммах двух штаммов от одного человека, не являющихся идентичными.
В результате анализа основных спектров всей коллекции были идентифицированы таксон-специфические компоненты, отличающие штаммы V.cholerae не О1/не О139 от штаммов V.cholerae El Tor. Определено, что в целом, с большими или меньшими отличиями, представители возбудителей холеры О1 серогруппы имеют в среднем 5 — 6 интенсивных пиков (интенсивность 40 — 100%) в диапазоне m/z (4000, 4400, 5000, 6000, 7000 Да), в то время как V. cholerae не О1/не О139
— один-два интенсивных пика в диапазоне 4000 — 4500 Да, где мол. масса самого интенсивного пика, составляющая 100%, имеет иную мол. массу, чем у V.cholerae El Tor.
Нами показано, что база данных позволяет проводить идентификацию, изучение и типирование представителей вида V^o^ae, эффективно определяя их происхождение и филогенетическое родство, что подтверждается формированием отдельной ветви эпидемически опасных штаммов, завезенных на территорию Москвы из Индии в 2010 — 2012 гг. Установление общности протеомного профиля этих штаммов позволило подтвердить «индийское» происхождение штамма V ^o^rae El Tor O1 19241, выделенного из акватории порта Таганрога в августе 2011 г. в период вспышки холеры в Украине. Данный факт подтверждают результаты VNTR-типирования, что свидетельствует о полной сопоставимости результатов масс-спектрометрического и VNTR-генотипирования. Более высокая чувствительность метода протеомного анализа позволила конкретизировать данные VNTR и уточнить, что два токсигенных штамма от человека, завезенных на территорию г. Москва в 2012 г. (V ^o^rae El Tor O1 19242 и 19243), не являются идентичными.
Таким образом, с помощью протеомного анализа идентифицированы масс-заряды таксон-специфических белковых компонентов, отличающие штаммы V. ^olerae не O1/ не O139 серогруппы от штаммов V. ^olerae El Tor. В соответствии с данными масс-пик листа показано, что V. ^o^rae El Tor имеют 5 — 6 интенсивных пиков масс-зарядов белков, интенсивность 40 — 100%, в то время как V ^olerae не О1/не О139
— только 1 — 2 интенсивных пика. Высота пиков демонстрирует количество белков с конкретной молекулярной массой, которые отмечены по оси абсцисс. Показано, что данные протеомного типирования полностью сопоставимы с данными VNTR-анализа и дополняют генетическую характеристику штаммов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мишанькин Б.Н., Водопьянов А.С., Ломов Ю. М. и др. Вариабельные тандемные повторы (VNTR-анализ) у Vibrio с^кте О139, выделенных от людей и из воды поверхностных водоемов России. Журн. микробиол. 2003, (6): 11-15.
2. Мишанькин Б.Н., Водопьянов А.С., Ломов Ю М. и др. Ретроспективный VNTR-анализ генотипов штаммов Vibrio с^кте О1, выделенных на территории Ростовской области в годы VII пандемии холеры. Мол. генет., микробиол., вирусол. 2004, (2): 28-33.
3. Онищенко Г. Г., Ломов Ю. М., Мишанькин Б. Н. и др. Характеристика холерных вибрионов эльтор, выделенных в г. Казань в 2001 г. Журн. микробиол. 2002, 2 : 3-6.
4. Онищенко Г.Г., Мишанькин Б.Н., Водопьянов А.С. и др. Холерные вибрионы серогруппы не О1, выделенные в Узбекистане в 1987— 1990 г.: ретроспективный анализ. Эпидемиол. инфекц. бол. 2003, 6: 25-29.
5. Свидетельство о государственной регистрации базы данных «Белковые профили масс-спектров представителей вида Vibrio cholerae для программы MALDI Biotyper» № 2013620585. РФ. Чайка И.А., Телесманич Н.Р., Сеина С.О., 20.06.2013.
6. Dieckmann R., Strauch E., Alter T. Rapid identification and characterization ofVibrio species using whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry. J. Appl. Microbiol. 2010, 109 (1): 199-211.
7. Hazen T.H., Martinez R.J., Chen Y et al. Rapid identification ofVibrio parahaemolyticus by whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75 (21): 6745-6756.
8. Welker M., Moore E.R. Applications of whole-cell matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in systematic microbiology. Syst. Appl. Microbiol. 2011, 34: 2-11.
Поступила 11.11.13
Контактная информация: Телесманич Наталья Робертовна, д.б.н.,
344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40, р.т. (863)240-27-03
ОБЗОРЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
В.М.Блинов1, В.Гайслер, Г.С.Краснов1, А.В.Шаргунов1, М.А.Шурдов2, В.В.Зверев1 КЛЕТОЧНЫЕ АНАЛОГИ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва; 2ООО «Панаген», Горно-Алтайск
Горизонтальный перенос генов между вирусами и их хозяевами сыграл важнейшую роль в эволюции как различных эукариот, в том числе современных млекопитающих, так и самих патогенов. В геноме животных можно встретить элементы вирусов различных типов. Эндогенные ретровирусные элементы, составляя до 8% от длины генома человека, не только обусловливают его высокую гибкость и потенциал к быстрой адаптации. Многие из вирусных генов, таких как Fv1, Lv2, являясь аналогами капсидных и других белков, обусловливают эффективное подавление вирусной репликации после проникновения возбудителя внутрь клетки. Внедрение этих элементов в геном самых различных животных, от рыб до приматов, могло произойти на фоне глобальных природных катаклизмов вирусной природы. Интеграция в генетический аппарат животных ретровирусных генов, кодирующих поверхностные глико-протеины с иммуносупрессивными доменами, послужила толчком к развитию живорождения и распространению плацентарных млекопитающих. Их клеточные аналоги, синцитины, выполняют двойную функцию: принимают непосредственное участие в формировании синци-тиотрофобластного слоя плаценты и обеспечивают толерантность иммунной системы матери к эмбриону. Приобретение вирусами клеточных генов также сыграло немаловажную роль в их эволюции: различные интерлейкины и другие модуляторы иммунного ответа, привнесенные в вирусный геном со стороны генетического аппарата клетки, стали одним из важных факторов патогенности самых различных возбудителей, включая поксвирусы, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барра и многие другие. Таким образом, эволюционные пути вируса и хозяи-
