CC BY
26
МИКРОБИОЛОГИЯ
Russian clinical laboratory diagnostics. 2018; 63(7)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-7-445-449
microbiology
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 616.932-074:543.42.062
Чайка С.О., Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М.
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИй МАРКЁР ВИРУЛЕНТНОСТИ VIBRIO CHOLERAE
ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, кафедра общей и клинической биохимии № 1, 344022, Ростов-на-Дону, Россия
Цель исследования - выявление масс-спектрометрических протеомных маркёров токсигенности V. cholerae для разработки экспресс-диагностики возбудителя в формате MALDI-ToF. Компьютерному анализу подвергали масс-спектрометрические электронные паспорта 140 штаммов V. cholerae c заведомо известной характеристикой штаммов, которые были разделены на две основные группы по параметру наличия или отсутствия гена холерного токсина (ctx- и ctx+). Впервые выявлен таксон - специфический маркёрный белковый пик, имеющий мол. массу 3202 Da, характерный для штаммов V.cholerae ctx+ и нехарактерный для V.cholerae ctx-.
Ключевые слова: Vibrio cholerae; MALDI-TOF масс-спектрометрия; протеомный анализ; токсигенность; холера.
Для цитирования: Чайка С.О., Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М. Масс-спектрометрический маркёр вирулентности Vibrio cholerae. Клиническая лабораторная диагностика.2018; 63(7): 445-449. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-7-445-449
Chaika S.O., Telesmanich N.R., Lomov Yu.M.
MASS SPECTROMETRY VIRULENCE MARKER VIBRIO CHOLERAE
Rostov-on-Don State Medical university, chair of biochemistry №1, 344022, Rostov-on-Don, Russian Federation
Identification mass-spectrometry of marker proteins of toxicity of V. cholerae for development the express of diagnostics of the causative agent of cholera on the basis of the computer analysis in the MALDI-ToF format of electronic profiles became the purpo.se of our research. Subjected to the computer analysis mass and .spectrometer electronic passports 140 of strains of V. cholerae with obviously known characteristic of strains which were divided into 2 basic groups in the parameter of existence or lack of a gene of cholera toxin (ctx-and ctx+). We for the first time revealed a taxon - the specific marker protein ceous peak having a molecular mass of3202 Da characteristic of strains of V.cholerae ctx + and unrepresentative for V.cholerae ctx-.
Keywords: Vibrio cholerae; MALDI-TOF mass-spectrometry; proteomic analysis, toxicity cholerae
For citation: Chaika S.O., Telesmanich N.R., Lomov Yu.M. Mass spectrometry virulence marker Vibrio cholerae. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics).2018; 63 (7): 445-449 (in Russ.) DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0869-2084-2018-63-7-445-449
For correspondence: Chaika S. O., graduate student ; e-mail: [email protected] Information about authors:
Chaika Sofya Olegovna http://orcid.org/0000-0002-0270-3143 Telesmanich Natalya Robertovna http://orcid.org/0000-0002-1906-6312 Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Funding. The study had no sponsorship.
Received 22.02.2018 Accepted 03.04.2018
Введение. Из масс-спектрометрических методов для изучения протеома микроорганизмов широко используется метод времяпролётной масс-спектрометрии на базе матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (англ. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - MALDI) с времяпролёт-ным разделением (англ. Time of Flight - ToF) ионов (MALDI-ToF-MS). Можно выделить два основных технологических приёма, основанных на времяпролётной спектрометрии. В основе одного из них лежит предварительное разделение белков путём двухмерного электрофореза с последующей тан-демной масс-спектрометрией (MS-TOF-TOF).Такой анализ позволяет идентифицировать белки не только клеток, но и
Для корреспонденции: Чайка Софья Олеговна, аспирант кафедры общей и клинической биохимии № 1; e-mail: [email protected]
тканей путём фингерпринта [1-5]. В основе второго подхода лежит прямое белковое профилирование клеток микроорганизмов и получение виртуального «облика» клетки, её про-теомного спектра, минуя отдельный этап разделения белков. Диапазон изучаемых масс рибосомальных белков лимитирован 2000-18000 Da, что достигается использованием в качестве матрицы а-циано-4-гидроксикоричной кислоты, этот подход лежит в основе идентификации микроорганизмов [2]. Данный масс-спектрометрический метод ограничивается коммерческой базой данных, в которую не входит вид Vibrio cholerae [6, 7] Все штаммы холерных вибрионов, исследуемые на масс-спектрометре, определялись как Vibrio albensis с высокой степенью достоверности [8]. Точная идентификация холерных вибрионов становится возможной только после внесения протеомных профилей одного или двух представителей в базу данных Biotyper. Достоверные результаты идентифика-
МИКРОБИОЛОГИЯ
ции вибрионов описаны в ряде работ [2, 8—11]. Линейная масс-спектрометрия микроорганизмов - экспресс-метод идентификации до вида на основе константных рибосомальных белков клетки. Наличие же в спектре и вариабельных белков может дать возможность характеризовать такие признаки бактерий внутри вида, как токсигенность, наличие или отсутствие других признаков вирулентности, характеризующих возможную тяжесть течения инфекционного процесса. Эти характеристики обычно конкретизируются с помощью бактериологических методов или ПЦР-анализа [12-14]. Перспективы внутривидовой масс-спектрометрической дифференциации становятся возможными при создании виртуальных музеев - коллекций микроорганизмов [8, 15, 16].Они должны содержать информацию не только о комплексе молекулярных масс белков, большого количества штаммов представителей отдельных групп вида, но и их гено - фенотипическую характеристику [8, 15]. Такой комплекс информации даёт возможность определить не только маркёрные белки вирулентности, но и происхождение штаммов и их филогенетическое родство на основе построения дендрограмм. Протеомные MALDI-ToF-MS зеркально отображают дендрограммы на основе VNTR-типирования [2, 8]. Информация, включающая конечный результат в виде таксономической идентификации микроорганизмов и их происхождение, базируется на детальной характеристике графических спектров и таблиц (MSP - Peak List). Биохимический профиль клетки в виде протеомного спектра и его числовых характеристик интересен с научной точки зрения, он является метаболическим «отпечатком пальцев» представителя. На основе визуального или компьютерного анализа можно установить сходство и отличия клеток штаммов внутри вида. При этом исследователями делается попытка выявить маркёрный белок или комплекс белков, характерных для определённой группы штаммов, объединённых общим признаком [9, 11, 12, 17].Та-ким маркёром для V. cholerae мог бы стать белок OmpU, обнаруживаемый масс-спектрометрическим путём, при использовании другой матрицы и перенастройки параметров прибора. Нестандартная пробоподготовка и несоответствие массы белка OmpU (m/z = 34565 Da) и диапазона масс для идентификации (2000-18000 Da) значительно усложняют методику[18]. На данный момент не описан подход к выявлению токсигенных холерных вибрионов в процессе идентификации или на основе уже идентифицированных микроорганизмов при помощи линейной масс-спектрометрии в диапазоне мол. масс 200018000 Da при использовании а-циано-4-гидроксикоричной кислоты, что является стандартной пробоподготовкой. Встречаются работы, в которых описаны попытки сделать это, но осуществить внутривидовую дифференциацию по эпидемической значимости штаммов V.cholerae не удалось [19].
Для возможного выявления белка или комплекса белков, характерных для токсигенных штаммов V. cholerae, все электронные протеомные паспорта возбудителей холеры были разделены на две группы по параметру - наличия или отсутствия гена холерного токсина.
Цель исследования - выявление масс-спектрометрических протеомных маркёров токсигенности V. cholerae для разработки экспресс-диагностики возбудителя в формате MALDI-ToF.
Материал и методы. Работа проведена на масс-спектрометре MALDI-ToF Bruker Daltonics. Профили получали с помощью программ Flex control и Biotyper 3.0. В качестве матрицы использована а-циано-4-гидроксикоричная кислота, позволяющая получить спектр в диапазоне мол. масс 2000-18000 Da, которые лежат в основе биотипирова-ния. Масс-спектрометрический профиль микроорганизма представляет собой график, на котором по оси абсцисс отложены масс-заряды (m/z) (молекулярные массы), а по оси ординат - интенсивность пика (т. е. количество белка с конкретной молекулярной массой, выражающейся в процентах).
Интенсивность (количество белка) оценивается относительно самого высокого 100% пика (наибольшего количества какого-то конкретного белка). Значение масс-заряда (m/z) можно приравнять к значению массы, так как заряд равен 1 (z = 1; m/1 = m). Ограничение диапазона масс 2000-18000 Da.
Масс-спектр, состоящий из пиков разной интенсивности, является графическим отображением масс-пик листа (MSP -Peak List), который представляет собой таблицу всех молекулярных масс полученных профилей каждого штамма. Этот электронный паспорт отражает числовую характеристику протеомного спектра микроорганизма, около 70 наиболее значимых для каждого штамма белков в графике. Паспорт имеет вид таблицы, в первом столбце которой показана масса белков (Da) (m=m/z), во втором - интенсивность пика (%). Интенсивность пика отражает процентное соотношение количества белков с конкретной массой относительно максимального. Например 100% пик указывает на то, что белок с конкретной массой присутствует в данном образце в максимальном количестве, остальные соотносятся в сравнении с данной величиной.
Анализ производился при помощи программы Microsoft Excel.
Компьютерному анализу подвергали масс-спектрометрические паспорта штаммов V. cholerae (n = 140), c заведомо известной характеристикой (биовар, серогруппа, серотип, год, место и объект выделения, наличие генов токсигенности). Нас интересовала ПЦР-характеристика вибрионов на наличие или отсутствие гена холерного токсина (ctx+/ ctx-). Из 140 охарактеризованных в ПЦР штаммов: V. cholerae О1 classica (n = 2) (ctx+ 2штамма), V. cholerae О1Е1 Tor(n = 69) (ctx+ 23штамма/ ctx- 46 штаммов), V. cholerae 0139(n = 32) (ctx+ Пштаммов/ctx- 15штаммов), V. cholerae non 01/0139(n = 37) (ctx+ 17штаммов/ ctx- 20штаммов) (см. таблицу).
Масс-спектрометрические паспорта MSP-Peak List переносились в ручном режиме в таблицу Microsoft Excel. Каждый столбец соответствовал характеристике одного штамма. В верхних ячейках столбца отражались сведения о фено-типической и таксономической характеристике штамма. В остальных ячейках столбца, расположенных ниже, - значения масс, характерных для данного штамма, от 3000 до 18 000 Da. Все столбцы (штаммы) разделены на две основные группы по параметру наличия или отсутствия гена холерного токсина (ctx+ и ctx-). В левой части таблицы -столбцы с параметром наличия гена, в правой - отсутствия. Проводился поиск одинаковых значений масс (+/- 2 Da) среди штаммов визуальным способом, каждому значению масс присваивался определённый цвет ячейки.
Результаты. Методика поиска одинаковых значений масс в программе Microsoft Excel позволила обратить внимание на белок с мол. массой 3202 (+/-2) Da, который присутствовал у большинства штаммов вида V.cholerae, охарактеризованных методом ПЦР как токсигенные. Данный белок отсутствовал практически у всех атоксигенных вариантов штаммов.
В группу токсигенных штаммов (n = 59) входило: 2 штамма V. cholerae О classica, 23 штамма V. cholerae 01ElTor, 17 -V. cholerae О]39 и 17 - V. cholerae non 0/0139. Среди 59 штаммов белок с массой 3202 Da встречался у 51 (86,4%) штамма, и только 8(13,6%) штаммов не имели этого белка. Процентное соотношение наличия белка 3202 Da внутри групп (серо-группы и биовары) выглядит следующим образом: оба токсигенных штамма (100%) V. cholerae О classica имели данный пик, пик присутствовал у19 штаммов V. cholerae 0[ElTor (82,6%), 14 штаммов V. cholerae О]39 (82,4%), 16 штаммов V. cholerae non 0/0]39 (94,1%) (рис. 1; см. таблицу).
Группа атоксигенных штаммов (n = 81) состояла из 46 штаммов V. cholerae 0[ElTor, 15 - V. cholerae О139 и 20 - V. cholerae non 0/0139. Среди 81 штамма белок с массой
RuSSIAN CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTICS. 2018; 63(7) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-7-445-449
MOOBЮLOGY
Диагностическая эффективность, отражающая специфичность белка с мол. массой 3202 Dа, характерного для токсигенных штаммов
Показатели V.cholerae O, classica V.cholerae Ot El Tor V.cholerae 0„9 V.cholerae non 0./O„9 Всего
и=140 Количество / % токсигенных штаммов с на- 2 / 100 2 19 / 82,6 23 14 / 82,4 17 16 / 94,1 17 51 / 86,4 личием белка массой 3202Эа + (п = 59) Количество / % токсигенных штаммов, у 0 / 0 4 / 17,4 3 / 17,6 1 / 5,9 8 / 13,6 которых отсутствует белок массой 3202Эа - Количество / % атоксигенных штаммов, у 0 / 0 0 42/91,3 46 15 / 100 15 15 / 75 20 72 / 88,9 которых отсутствует белок массой 3202Эа - штаммов (п= 81) Количество / % атоксигенных штаммов с 0 / 0 4 / 8,7 0 / 0 5 / 25 9 / 11,1 наличием белка массой 3202Эа +
3202 Da отсутствовал у 72(88,9%) штаммов из 81, и только 9(11,1%) штаммов имели этот белок. Отсутствие белка с массой 3202 Da в группах атоксигенных штаммов представляет следующее распределение: 42 (91,3%) штамма из 46 V. chol-erae 0¡ElTor не имели данного белка. Все штаммы V. cholerae O ctx- (100%) не имели пик 3202 Da. Среди V. cholerae non О/O данный пик отсутствовал у 15(75%) из 20 штаммов (рис. 2; см. таблицу).
Высокие показатели достоверности (p = 0,021) принадлежности белка с мол. массой 3202 Da к токсигенным вариантам свидетельствуют о том, что наличие данного белка действительно является таксон-специфическим маркёрным белком, характеризующим штамм Vibrio cholerae как ток-сигенный. Соответственно отсутствие белка указывает на атоксигенность штамма.
Следующей числовой позицией, характеризующей масс-заряд клетки, является количество данного белка, измеряемого
20 т 18 16 -14 -12 10 8 6 4 2 0
19
16
14
O1 01 El Tor 0139
Classica
non 01/0139
наличие белка с массой 3202Da + отсутствие белка с массой 3202Da -
интенсивностью. Оценка интенсивности пиков с массой 3202 Da среди штаммов, имеющих ctx+ ген (59 штаммов), показала, что средний показатель интенсивности пика 65%, из них с показателем интенсивности 100% встречался в 19 случаях из 59. Если рассматривать средний показатель интенсивности пика среди токсигенных вариантов по группам, то он составлял: V. cholerae О plassica - 78%, V. cholerae 01ElTor - 70%, V cholerae O]39 - 46%, V. cholerae non O/O]39 - 75% (рис. 3).
У некоторых (w=9) атоксигенных штаммов, при отсутствии гена холерного токсина (ctx-), присутствовал пик 3202 Da, которого не должно было быть. Анализ интенсивности пиков данных штаммов, показал среднее значение 22,4% (среднее значение в группах (биовары, серогруппы) V. chol-erae О plassica - 0%, V. cholerae 01ElTor - 10%, V. cholerae О139 - 0%, V. cholerae non O/O - 33%). Высокая степень достоверности различий (p = 0,03) между значениями интенсивности пика в группах токсигенных и атоксигенных штаммов позволяет судить о влиянии интенсивности пика на характеристику токсигенности штамма (см. рис. 3).
Наличие белка с массой 3202 Da является таксонспеци-фическим маркёром наличия ctx гена, что подтверждается в
45 -, 4035 -30 25 -20 15 -105 0
42
0 0
15
15
O1 Classica
01 El Tor
0139
non 01/0139
отсутствие белка с массой 3202Da + наличие белка с массой 3202Da -
Рис. 1. Количественное соотношение среди токсигенных штаммов У.^о1егае с наличием и отсутствием белка массой 3202 Da Сх+ (п = 59).
По оси абсцисс - биовары, серогруппы КеИо1егав йх+ , столбцы собраны в пары по признаку наличия и отсутствия маркерного белка; по оси ординат - количество штаммов.
Рис. 2. Количественное соотношение среди атоксигенных штаммов У.^о1егае с отсутствием и наличием белка массой 3202 Da Сх- (п = 81).
По оси абсцисс - биовары, серогруппы V.cholerae йх-, столбцы собраны в пары по признаку наличия и отсутствия маркерного белка; по оси ординат - количество штаммов.
4
3
2
5
4
0
0
МИКРОБИОЛОГИЯ
%
100
80
60
40
20
0
¡i H
Hh¡-t¡ i i
1 3 5 7 9 12 14 16 18 20 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51
1С Интенсивность (%) пиков с массой 3220 Da среди токсигенных ctx+ штаммов V. Cholerae Щ Интенсивность (%) пиков с массой 3220 Da среди атоксигенных ctx- штаммов V. Cholerae
Рис. 3. Интенсивность (в %) пиков с массой 3202 Da среди токсигенных и атоксигенных штаммов V. cholerae.
По оси абсцисс - порядковые номера штаммов, имеющих белок массой 3202 Da; по оси ординат - интенсивность (в %) пиков
123 (88%) случаях из 140 среди токсигенных и атоксигенных штаммов вместе взятых, это свидетельствует о высокой диагностической эффективности метода. За пределы нашей теории выходит 17(12%) штаммов из 140, все эти штаммы относятся к разным годам и местам выделения. Среди них 8 штаммов V. cholerae O1ElTor (4 ctx+/4 ctx-), 3 штамма V. cholerae О13д (3 ctx+), 6 штаммов V. cholerae non O/O (1 ctx+/5 ctx-).
Обсуждение. Выявление маркёрных белков внутри вида и их принадлежность к определённой таксономической группе становится возможным благодаря созданию баз данных, в которые закладываются автором персонифицированные таксономические параметры, генетические характеристики токсигенности, что поможет сориентироваться в определении эпидемической значимости [9, 11, 12, 17]. Наличие масс-спектрометрических электронных паспортов штаммов даёт уникальную возможность - изучать молекулярно-биохимические параметры микроорганизма в виртуальном формате. Сравнивая масс-спектры между собой, можно производить внутривидовые исследования, выявлять маркёр-ные белки патологического процесса. Это в последние годы стало отражаться в публикациях, посвящённых изучению отдельных белков на масс-спектрометре в линейном режиме. Благодаря созданию таких баз данных получены масс-спектрометрические белковые профили штаммов возбудителей бруцеллёза, что позволило выявить 12 возможных родоспе-цифических фрагментов белков[20]. Коллекция масс-спектров E. coli позволила установить маркёрные белки, отличающие гемолитическую вирулентную популяцию, вызывающую дис-кинезию желчевыводящих путей, от негемолитической по наличию пика cm/z 9000 Da и идентифицировать эшерихии, вызывающие дисфункциональные нарушения желчевыдели-тельной системы. При восстановлении функционирования желчевыделительной системы гемолитический признак у эшерихий исчезает, что соответствует исчезновению пика с m/z 9000 Da и появлению негемолитических форм с доминирующим комплексом белков, имеющих m/z 5700 Da [12]. Проведён масс-спектрометрический анализ представителей рода Yersinia. Обнаружены два специфических пика, характерных для подвида pestis (m/z 3064 и m/z 5796), один - для подвида caucasica (m/z 3237). Маркёр m/z 3064 регистрировался только у вирулентных штаммов Y.pestis [19]. Что касается V.cholerae, то все исследуемые на масс-спектрометре штаммы опреде-
лялись как V. albensis с высокой степенью достоверности. Компьютерный анализ в формате MALDY-ToF данного штамма показал, что протеом спектра демонстрирует существенные отличия, при том что не отличается по таксономическим признакам от представителей V. cholerae [21]. Внесение в коммерческую базу нескольких штаммов Vibrio cholerae, позволяет проводить идентификацию возбудителей холеры. Внутривидовое типирование, установление филогенетического родства и происхождения штаммов холерных вибрионов, появление которых на территории Российской Федерации носит заносной характер, невозможны без расширенной библиотеки спектров рибосомаль-ных белков представителей вида V. cholerae. [8]. По данным литературы осуществить внутривидовую дифференциацию по эпидемической значимости, серогруппе, биовару не удавалось [19]. В нашей работе такую закономерность удалось найти.
Ранее опубликованы данные о выявлении маркёрного белка OmpU (m/z = 34565 Da) масс-спектрометрическим методом, в работе использовалась матрица - феруловая кислота (3-метокси-4-гидроксикоричная кислота, Ferulic Acid), позволяющая расширить диапазон изучаемых масс до 80 000 Da. Принадлежность найденной авторами массы 34 565 Da к белку наружной мембраны OmpU доказана методом масс-спектрометрии с выделением чистого белка путём двухмерного электрофореза. Нами использована матрица а-циано-4-гидроксикоричная кислота, предназначенная для стандартной методики масс-спектрометрии микроорганизмов и идентификации в диапазоне 2000-1800 Da. При этом коммерческие базы данных протеомов микроорганизмов созданы с применением матрицы на основе а-циано-4-гидроксикоричной кислоты, следовательно, идентификация с использованием другой матрицы станет невозможной, так как разные диапазоны масс не смогут соотноситься друг с другом. Минусом данной методики является то, что для выявления белка OmpU (m/z = 34 565 Da) необходимо два этапа исследования. Первый этап - определение вида микроорганизма стандартным методом с матрицей, предназначенной для идентификации при определённых настройках прибора. Второй этап - это повторное нанесение образца на мишень с другой матрицей и перенастройкой параметров прибора, что усложняет процесс. Теряются основные преимущества метода линейной масс-спектрометрии - быстрота и простота процесса [18]. В нашем случае невозможно говорить о каком-то конкретном белке. Выявлен специфический маркёрный белковый пик с мол. массой 3202 Da, характерный для штаммов V.cholerae ctx+ и нехарактерный для V.cholerae ctx-, что подтверждается в 88% выборки. Обнаружение данного маркёрного белка в MALDI масс-спектре может стать поводом для проведения генетической оценки токсигенности штаммов.
Показатель интенсивности обнаруженного пика отражает характеристику токсигенности штамма; так, средний показатель среди ctx+ штаммов составляет 65% против 22,4% у атоксигенных вариантов, где пика не должно быть. В группе токсигенных штаммов 19 из 59 имеют пик со 100% интенсивностью, в редких случаях встречаются низкие показатели. Среди всех атоксигенных штаммов, у которых белок все же присутствует, только у одного встречается максимальный показатель интенсивности пика (100%) (см.рис. 3).
Обнаружение пика с массой 3202 Da при помощи созданной базы данных и компьютерного анализа спектра протеома поможет определить эпидемическую значимость штаммов.
Russian clinical laboratory diagnostics. 2018; 63(7)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-7-445-449
Финансирование. Исследование не имело спонсорской
поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЛИTEРATУРA (пп. 3-5, 10, 11, 18 см. REFERENCES)
1. Кульшань Т.А., Задпова СП., Челдышова КБ., Омирпова H.K Oцеп-ка функциональных особенностей и стрессоустойчивости изогенных токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль
Тор. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.2015; (3):11-7.
2. Бочарова Ю.А., Чеботарь И.В., Mаяпский H.A. Возможности, проблемы и перспективы масс-спектрометрических технологий в медицинской микробиологии (обзор литературы). Клиническая лабораторная диагностика. 201б; б1(4): 249-5б
6. Афанасьев M^., Mиропова Л.В., Басов E.A., Oстяк A.C., и др. MAL-DI-TOF масс-спектрометрический анализ в ускоренной идентификации микроорганизмов рода Vibrio. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 2014; (3): 22-9.
7. Детушев К.В., Хомяков A.E, Тюрин E.A. Применение MALDI-TOF масс-спектрометрии на приборе Microflex (Bruker Daltonik) для идентификации белковых спектров ПБА I-II групп. Молекулярная диагностика. 2014; 1: 444.
8. Телесмапич H.R, Чайка C.O., Чайка И.А., Гопчарепко E3., Ломов Ю^. Mасс-спектрометрический анализ MALDI-TOF в идентификации и типировании штаммов холерных вибрионов. Клиническая лабораторная диагностика. 201б; б1 (б): 375-9.
9. Mиронова Л.В., Басов E.A., Афанасьев M3. и др. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ c молекулярно-генетической идентификацией Vibrio spp. в системе мониторинга вибриофлоры поверхностных водоемов. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014; 19 (б): 27-3б.
12. Гапон M.H., Телесмапич H.R, Терповская Л.К, Чайка C.O., Чайка И.А., Mикашинович З.И., Твердохлебова Т.И. Времяпролетная масс-спектрометрическая внутривидовая диагностика штаммов эшери-хий, выделенных от человека. Клиническая лабораторная диагностика. 201б; б1 (б): 371-4.
13. Гапон M.H., Телесмапич H.R, Терповская Л.К, Чайка C.O., Чайка И.А. , Mикашинович З.И. Протеомпый масс-спектрометрический анализ свежевыделенных штаммов патогенных эшерихий. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии. 2015; 3: 83-8.
14. Телесмапич H.R, Гопчарепко E.В., Чайка C.O., Чайка И.А., Теличе-ва ВЮ. Возможности применения MALDI-TOF масс-спекрометрии для изучения углевод - специфических рецепторов диагностического бактериофага эльтор. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 201б; (2): 85-90.
15. Телесмапич H.R, Чайка C.O., Чайка И.А. Расширение возможностей линейной MALDI масс-спектрометрии для анализа протеома микроорганизмов на основе создания референс - библиотеки виртуальных профилей. Актуальные вопросы современной медицины. Сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции. Eкатеринбург. Инновационный центр развития образования и науки. 2015; 2: 34-7.
16. Зуева E3., Cтояпова H.A., Токаревич КК. Применение метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для контроля коллекции штаммов Leptospira, используемых в серодиагностике лептоспироза. Молекулярная диагностика. 2014; 1: 510-1.
17. Oсипов Г.А., Родионов Г.Г. Применение метода масс-спектрометрии микробных маркеров в клинической практике. Лабораторная диагностика. 2013; (2): б8-73.
19. Афанасьев M3., Mиронова Л.В., Басов E.A., Oстяк A.C., Вдови-чепко Г.В., Климов В.Т., Богумильчик E.A., Балахнов СВ. Mасс-спектрометрический анализ межвидовой и внутривидовой дифференциации микроорганизмов Yersinia spp. И Vibrio spp. Молекулярная диагностика. 2014; (1): 477-8.
20. Ульшина Д.В., Ковалев Д.А., Головпева СИ., Чеботарева E3. Применение MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации Bru-cella spp. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2014; (25): 111-3.
21. Водяницкая СЮ., Телесмапич H.R, Чайка C.O.. Чайка И.А., Иванова H.E MALDI-TOF протеомпый анализ в исследовании судовых балластных вод в портах Ростовской области. Жизнь без опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. 2014; 4 (9) : 82-9.
REFERENCES
1. Kulshan T.A., Zadnova S.P., Cheldyishova N.B., Smirnova N.I. Evaluation of functional features and stress resistance of isogenic toxigenic and non-toxigenic biovar El Tor Vibrio cholerae strains. Zhurnal mikro-biologii epidemiologii i immunobiologii. 2015; (3):11-7 . (in Russian)
2. Bocharova Yu.A., Chebotar I.V., Mayanskiy N.A. The possibilities, problems and perspectives of mass-spectrometry in medical microbiology:
MICROBIOLOGY
publications review. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2016; 61 (4): 249-56. (in Russian)
3. Zou Q., Yan X., Li B., Zeng X., Zhou J., Zhang J. Proteome analysis of sorbitol fermentation specific protein in Vibrio cholerae by 2-DE and MS. Proteomics. 2006; Mar;6(6):1848-55.
4. Yan X., Xiao D., Zhao F., Gu Y., Meng F., Zhang J. Analysis of exopro-teins of El Tor Vibrio cholerae by 2DE and MALDI-TOF-MS/MS. Acta microbiologica Sinica. 2009; Jun;49(6):746-58.
5. Ruibai Wang, Hongzhi Zhang, Haiyan Qiu, Shouyi Gao, Biao Kan. Proteins involved in difference of sorbitol fermentation rates of the toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae El Tor strains revealed by comparative proteome analysis. BMC Microbiology. 2009; 9: 135-44.
6. Afanasev M.V., Mironova L.V., Basov E.A., Ostyak A.S., Kulikalova E.S., Urbanovich L.Ya., Balahnov S.V. MALDI-TOF mass spectrometry in the accelerated identification of microorganisms of the Vibrio genus. Molekulyar-naya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2014; (3): 22-9. (in Russian)
7. Detushev K.V., Homyakov A.E, Tyurin E.A. Application of MALDl - TOF of a mass spectrometry on the Microflex device (Bruker Dal-tonik) for identification of proteinaceous ranges of PBA I-II of groups. Molekulyarnaya diagnostika. 2014; 1: 444. (in Russian)
8. Telesmanich N.R., Chaika S.O., Chaika I.A., Goncharenko E.V., Lomov Yu.M. The mass-spectrometric analysis of MALDI-TOF in identification and typing of strains of comma bacillus. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2016; 61 (6): 375-9 (in Russian)
9. Mironova L.V., Basov E.A., Afanasev M.V., Hunheeva Zh.Yu. MALDI-ToF mass spectrometry analysis with molecular genetics identification of Vibrio spp. in the system of the monitoring of vibrio flora of surface water reservoirs. Epidemiologiya i infektsionnyie bolezni. 2014; 19 (6): 27-36. (in Russian)
10. Dieckmann R., Strauch E., Alter T. Rapid identification and characterization ofVibriospecies using whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry. Journal of applied microbiology. 2010; Jul;109(1):199-211.
11. Kaveh Emami, Vahid Askari, Matthias Ullrich, Khwajah Mohinudeen, Arga Chandrashekar Anil, Lidita Khandeparker, J. Grant Burgess, Ehsan Mesbahi. Characterization of bacteria in ballast water using MALDI-TOF mass spectrometry. PLoSONE. 2012; 7(6): e38515.
12. Gapon M.N., Telesmanich N.R., Ternovskaya L.N., Chaika S.O., Chaika I.A., Mikashinovich Z.I., Tverdohlebova T.I. The time-of-flight mass spectrometer intra-specific diagnostic of strains of Escherichia isolated from patient. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2016; 61 (6): 371-4. (in Russian)
13. Gapon M.N., Telesmanich N.R., Ternovskaya L.N., Chaika S.O., Chai-ka I.A. , Mikashinovich Z.I. Proteomic Mass-Spectrometric analysis of freshly isolated Escherichia coli strains. Zhurnal mikrobiologii epidemiologii i immunobiologii. 2015; 3: 83-8. (in Russian)
14. Telesmanich N.R., Goncharenko E.V., Chaika S.O., Chaika I.A., Teli-cheva V.O. The possibilities of application of MALDI-TOF mass-spec-trometry for investigation of carbohydrate-specific receptors of diagnostic bacteriophage El Tor. Zhurnal mikrobiologii epidemiologii i immunobiologii. 2016; 2: 85-90. (in Russian)
15. Telesmanich N.R., Chaika S.O., Chaika I.A.Expansion of opportunities of the linear MALDI of a mass spectrometry for the analysis of a proteom of microorganisms on the basis of creation the reference - libraries of the virtual profiles. Aktualnyie voprosyi sovremennoy meditsinyi. Sbornik nauchnyih trudov po itogam mezhdunarodnoy nauchno-prakticheskoy konferentsii.Yekaterinburg, Innovatsionnyiy tsentr razvitiya obrazovani-ya i nauki. 2015; 2: 34-7. (in Russian)
16. Zueva E.V., Stoyanova N.A., Tokarevich N.K. Application of the MAL-DI-TOF method of a mass spectrometry for monitoring of a collection of strains of Leptospira in se-rodiagnostics of leptospirosis. Molekulyar-naya diagnostika. 2014; 1: 510-1. (in Russian)
17. Osipov G.A., Rodionov G.G.. Use of a method of a mass spectrometry of microbial markers in clinical practice. Laboratornaya diagnostika. 2013; (2): 68-73. (in Russian)
18. Paauw A., Trip H., Niemcewicz M., Sellek R., Heng J.M., Mars-Groenendijk R.H. et al. OmpU as a biomarker for rapid discrimination between toxigenic and epidemic Vibrio cholerae O1/O139 and nonepi-demic Vibrio cholerae in a modified MALDI-TOF MS assay. BMC Mi-crobiol. 2014; 14: 158.
19. Afanasev M.V., Mironova L.V., Basov E.A., Ostyak A.S., Vdovichenko G,V., Klimov V.T., Bogumilchik E.A., Balahnov S.V. Mass -spectrometry analysis of trans-species and intraspecific differentiation of microorganisms of Yersinia spp. and Vibrio spp. Molekulyarnaya diagnostika. 2014; 1: 477-8. (in Russian)
20. Ulshina D.V., Kovalev D.A., Golovneva S.I., Chebotareva E.V. Application of MALDI-TOF mass spectometry to Brucella spp. identification. Dalnevostochny zhurnal infektsionnoy patologii. 2014; (25): 111-3. (in Russian)
21. Vodyanitskaya S. Yu., Telesmanich N.R., Chaika S.O., Chaika I.A., Ivanova N.G. MALDI-TOF proteomic analysis in the study of shipping ballast waters in sea ports of Rostov regions. Zhizn Bez Opasnostey. Zdorov'e. Profilaktika. Dolgoletie. 2014; 4 (9) :82 -9. (in Russian)
Поступила 22.02.18 Принята к печати 03.04.18
