CC BY
263
6. Tatarunas V., Lesauskaitè V., Veikutienè A., Jakuska P., Benetis R. The influence of CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphisms on optimal warfarin doses after heart valve replacement. Medicina (Kaunas). 2011; 47(1): 25-30.
7. Gaikovitch E.A., Cascorbi I., Mrozikiewicz P.M., Brockmoller J., Frotschl R., Kopke K. et al. Polymorphisms of drug-metabolizing enzymes CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP1A1, NAT2 and of P-glycoprotein in a Russian population. Eur. J. Clin. Pharmacol. 2003; 59(4): 303-12.
8. Sullivan-Klose T.H., Ghanayem B.I., Bell D.A., Zhang Z.Y., Kamin-sky L.S., Shenfield G.M. et al. The role of the CYP2C9-Leu359 al-lelic variant in the tolbutamide polymorphism. Pharmacogenetics. 1996; 6(4): 341-9.
9. Chubaryan V.T. Clinical-pharmacological approaches to individual dozing of isoniazid and rifampicin in patients with pulmonary tuberculosis [Clinico-pharmacologicheskiy podchod k individualnomy dozirovaniyu isoniazida i rifampicina u bolnyh tuberculosom legkih]. Dis. Rostov-na-Donu; 1994 (in Russian).
10. Shenderova R. I. Opredeleniye activnogo tubazida v sivorotke krovi methodom Villenberga [Detection of active tubazid in blood serum by Villenberg method]. Laboratornoe delo. 1975; 2: 114-6 (in Russian).
11. COMPENDIUM 2012 - medical agents [Electronic resource] : handbook / editors - V.N.Kovalenko, A.P.Victorov Online address: http:// compendium.com.ua/akt/82/2826/rifampicinum (in Russian).
Recived 05.10.13
POLYMORPHISM OF THE BIOTRANSFORMATION GENE - CYTOCHROME-450 2C9 IN THE PATIENTS WITH TUBERCULOSIS
Antonenko P. B, Kresyun V. I.
Odessa National Medical University, Ministry of Healthcare of Ukraine, Odessa, Ukraine
The goal of this work was to study cytochrome-450 (CYP) 2C9 (CYP2C9) gene polymorphism in patients with tuberculosis (TB) and its meaning for development, progress, and outcome of TB, for the pharmacokinetics of the antituberculosis antibiotic rifampicin on the basis of the southern region of Ukraine.
Among the TB patients it was 24.9% less than in carriers of the genotype *1/*1 and than in healthy donors. At the same time, it was 25.0% less than in carriers of the genotypes *1/*2, *1/*3. In the TB patients with the genotype *2/*3, *3/*3 the level of rifampicin in blood was the lowest. At the beginning of the treatment in carriers of genotype *1/*1 the pulmonary destruction was observed 2.5 times more often than in *1/*2, *1/*3 genotype. According to the cultural method, the carriers of *1/*1 more frequently became smear-negative than the carriers of *1/*2, *1/*3 genotype.
Key words: CYP2C9 gene; polymorphism; tuberculosis; rifampicin.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.843.1.083.18л535.243.08
Афанасьев М.В., МироноваЛ.В., Басов Е.А., Остяк А.С., Куликалова Е.С., Урбанович Л.Я.,
Балахонов С.В.
MALDI-TOF МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ В УСКОРЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА VIBRIO
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Иркутск
Цель настоящей работы - разработка методологических подходов идентификации представителей рода Vibrio с использованием технологии MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа. В работе изучены аспекты биологической безопасности пробо-подготовки для масс-спектрометрического анализа, получены референсные спектры шести типовых штаммов V. cholerae. С использованием базы MALDI Biotyper 3.0, включающей референсные спектры V. cholerae, проведена идентификация 55 штаммов - представителей рода Vibrio, в том числе 45 штаммов V. cholerae разной эпидемической значимости. Продемонстрирована возможность достоверного определения таксономической принадлежности исследуемых микроорганизмов до видового уровня, при этом результаты полностью соответствуют данным классической микробиологической идентификации. Экспериментально показана стабильность и воспроизводимость предлагаемого метода исследования.
Полученные результаты дают основание рассматривать методику идентификации представителей рода Vibrio с использованием технологии масс-спектрометрического анализа как достаточно эффективную, позволяющую в кратчайшие сроки определять видовую принадлежность основных представителей рода Vi -brio.
Ключевые слова: род Vibrio; MALDI-TOF масс-спект-рометрический анализ; идентификация.
Род Vibrio насчитывает более 50 видов, часть из которых играет значительную роль в инфекционной патологии человека [1]. Наибольшее клиническое и эпидемическое значение среди представителей рода Vibrio имеет Vibrio cholerae - возбудитель холеры, особо опасной острой кишечной инфекции, сопровождающейся дегидратацией организма больного.
В мире с начала седьмой пандемии официально зарегистрировано более 7 млн случаев холеры. При этом в последние годы отмечается рост заболеваемости, в том числе и за счет вовлечения в эпидемический процесс стран Американского континента (р. Гаити, Доминиканская Республика, Куба) [2, 3], что свидетельствует о существовании реальной угрозы заноса возбудителя из неблагополучных по холере стран на новые территории с последующим развитием эпидемических осложнений.
К числу других клинически значимых представителей рода Vibrio относятся галофильные вибрионы, в том числе V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V fluvialis, V. vulnificus, вызывающие острые кишечные инфекции, а также инфекции внекишечной локализации (раневые инфекции, поражения ЛОР-органов, септицемия) [1, 4, 5].
Традиционная микробиологическая идентификация микроорганизмов рода Vibrio, основывающаяся на фе-нотипических тестах (культурально-морфологические, тинкториальные, биохимические свойства, агглютинация со специфическими сыворотками), требует от 36 до 42 ч с момента поступления первичного материала [6, 7]. Молекулярно-генетические методы детекции возбудителя позволяют ускорить процесс, сократив его до нескольких часов [6].
В последние годы в молекулярной диагностике инфекционных заболеваний для экспресс-идентификации
и типирования микроорганизмов применяется новый метод - прямое белковое профилирование с использованием MALDI-ToF (Matrix-Assisrted Laser Desorption/ Ionization Time Of Flight) масс-спектрометрии. Получаемые в процессе анализа видоспецифичные белковые паттерны сравниваются с базой данных и на основании этого определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма [8, 9]. Метод отличает высокая скорость и простота выполнения, низкая стоимость расходных материалов, высокая диагностическая чувствительность и специфичность, что делает этот подход весьма перспективным для скрининговых исследований большого объема клинического материала и/или объектов окружающей среды. Вместе с тем для некоторых микроорганизмов, в частности для возбудителя холеры, данный метод разработан недостаточно полно. В ряде недавних работ показана эффективность MALDI-ToF MS-идентификации и межвидовой дифференциации микроорганизмов рода Vibrio [10, 11]. Однако подавляющее большинство исследованных в этих работах штаммов были выделены из объектов окружающей среды, а не из клинического материала, что затрудняет объективную оценку метода для клинической лабораторной диагностики холеры. Еще одним серьезным ограничением более широкого применения масс-спектрометрической идентификации в клинико-лабораторной диагностике микроорганизмов рода Vibrio является отсутствие рефе-ренсных спектров возбудителя холеры в базе программы MALDI Biotyper 3.0, поставляемой производителем на территорию Российской Федерации.
В соответствии с изложенным цель настоящего исследования - разработка методологических подходов идентификации на основе MALDI-ToF масс-спектрометрического анализа представителей рода Vibrio, в частности возбудителя холеры, выделенных как из объектов окружающей среды, так и из клинического материала.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы
В работе использовали 55 штаммов рода Vibrio, выделенных от больных, из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации и за рубежом с 1957 по 2012 г.
Группа штаммов V. cholerae (n = 45) включала 27 штаммов О1-серогруппы, 5 штаммов О139-серогруппы, 2 штамма RO и 11 - не О1/О139. Относятся к биовару эльтор 24 штамма V. cholerae О1, к классическому биовару - 3. Среди V. cholerae O1-серогруппы 18 штаммов охарактеризованы как эпидемически опасные (содержат гены холерного токсина ctxAB), в том числе V. cholerae O1 классического биовара - 3 штамма, V. cholerae O1 биовара эльтор - 15 штаммов. По структуре детерминант патогенности эпидемически опасные изоляты V. cholerae el-tor дифференцируются на 3 группы: ctxB1rstREL+rstRCL+ (n=12), ctxB1rstREL+rstrCL- (n = 1) и ctxB3rstREL+rstfCL- (n = 2). V. cholerae cholerae характеризуются однородностью указанных признаков (содержат специфические для классического биовара аллели генов - ctxB1 и rstRCL). Из группы штаммов V. cholerae О139 к эпидемически опасным относятся 2 с генотипом ctxB3rstREL+rstrCL-.
Остальные включенные в выборку штаммы V. cholerae O1-серогруппы (n=9), O139-серогруппы (n = 3), RO-варианта (n=2), не О1/О139-серогрупп (n=11) не содержат генов основных факторов патогенности холерного вибриона и относятся к эпидемически неопасным.
Из других представителей рода Vibrio в исследование были включены штаммы V. alginolyticus (n = 2), V. parahaemolyticus (n=3), V. metschnicovii (n=1),V vulnificus (n=1), V. fluvialis (n = 3). В качестве представителей близкородственной таксономической группы исследовали 4 штамма Aeromonas spp.
Таксономическую принадлежность взятых в исследование штаммов определяли при их изоляции на основании стандартных бактериологических тестов, включающих изучение тин-кториальных, культурально-морфологических, биохимических, серологических и ряда других свойств.
Дополнительную идентификацию микроорганизмов по комплексу биохимических характеристик проводили с применением «Набора для идентификации Enterobacteriaceae и других неприхотливых грамотрицательных палочек API 20Е» (API 20Е) («BioMérieux», Франция). Для интерпретации результатов использовали базу данных API 20E v 4.1, содержащую информацию о 102 таксонах.
MALDI-ToF масс-спектрометрический анализ Для масс-спектрометрического исследования использовали 18-часовые культуры, выращенные при 37°С на казеиново-дрожжевом агаре (рН 7,6). V. alginolyticus, V. parahaemolyticus и V. vulnificus культивировали на питательных средах с добавлением 3% раствора NaCl.
Подготовку материала для масс-спектрометрического анализа с учетом требований биологической безопасности и целей его проведения осуществляли двумя способами. Первый способ - прямое нанесение исследуемой культуры в виде мазка на MSP-чип (MSP 96, «Bruker Daltonics», Германия) с последующим наслаиванием на образец 1 мкл насыщенного раствора матрицы (а-циано-4-гидроксикоричная кислота в 50% растворе ацетони-трила и 2,5% трифторуксусной кислоты). Данный способ использовали при исследовании микроорганизмов III-IV групп патогенности. Второй способ - предварительная экстракция белка, при которой происходит одновременное обеззараживание исследуемого материала - применяли при исследовании токсигенных штаммов V. cholerae, а также для получения белковых профилей штаммов для создания библиотек референсных спектров. Процедура экстракции белка заключалась в последовательной обработке микробной взвеси этиловым спиртом, 70% муравьиной кислотой с последующим добавлением ацетонитрила [12]. По окончании экстракции по 1 мкл супернатанта анализируемых образцов переносили в лунки MSP-чипа, образцы подсушивали на воздухе, сверху наносили 1 мкл матрицы.
В качестве калибровочного стандарта и положительного контроля анализа использовали белковый экстракт штамма E. coli DH5a (ref. № 255343; «Bruker Daltonics», Германия).
Спектры собирали в автоматическом режиме на масс-спектрометре Microflex™ LT MALDI-TOF («Bruker Daltonics», Германия) с использованием программы Flex Control (v. 3.3, build 108), при функционировании прибора в линейном позитивном режиме со следующими параметрами: напряжение Ion Source 1 (IS1) 20 кВ, Ion Source 2 (IS2) 18,05 кВ, напряжение на фокусирующей линзе 6кВ, частота азотного лазера 60 Гц. Параметры работы прибора оптимизировали для диапазона отношения массы иона к его заряду (m/z) от 2000 до 20 000. Каждый спектр получали путем суммирования 6 одиночных спектров (240 импульсов лазера).
Для получения референсных библиотек спектров образец исследовали в 12 повторах, для идентификации - в 3 (в случае прямого нанесения) и 5 (при проведении экстракции) повторах.
Анализ спектров, генерацию референсных библиотек и идентификацию выполняли с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0 («Bruker Daltonics», Германия). Заключение о таксономической принадлежности микроорганизма осуществляли на основании значения индекса совпадения (параметр score value - SV). Значение SV > 2,3 соответствовало достоверной идентификации до вида; SV менее 2,299, но более 2,000 - достоверной идентификации до рода, вероятной идентификации до вида, значение SV в диапазоне 1,7-1,999 рассматривали как вероятную идентификацию до рода и менее 1,7 - недостоверный результат.
проверка белковых экстрактов для масс-спектро-метрического анализа на специфическую стерильность
Проверке на специфическую стерильность подвергали полученные по описанному выше протоколу белковые экстракты трех штаммов холерного вибриона: один токсигенный и один нетоксигенный штаммы V. cholerae eltor O1-серогруппы и один штамм V. cholerae не О1/О139. Для каждого штамма осуществляли приготовление 4 серий белковых препаратов. Полученные
экстракты, а также смывы с поверхности MSP-чипа с нанесенным на него экстрактом и матрицей, исследовали на наличие V. cholerae в соответствии с «Инструкцией по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного или холерного микробов» [13].
Биоинформационный и статистический анализ данных
Для учета результатов исследования, формирования промежуточных таблиц, осуществления элементарных расчетов использовали программные ресурсы пакета Microsoft Office Excel 2003. Для оценки достоверности различий значений SV для штаммов, подготовленных для исследования разными методами, применяли критерий Вилкоксона. Кластерный анализ осуществляли с использованием функции Principal Component Analysis программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0, а так-
же методом ближайших соседей (Neighbor-Joining - NJ) при помощи программного комплекса Bionumerics v. 6.01 («Applied Maths», Бельгия).
Результаты и обсуждение
Масс-спектрометр представляет собой сложный аналитический инструмент, эксплуатационные характеристики которого не предусматривают возможности проведения пользователем деконтаминации и дезинфекции внутренних рабочих поверхностей и пространств. Поэтому одними из первых задач настоящей работы являлись выбор и оценка обеззара-
Рис. 1. Референсные спектры штаммов V. cholerae.
Сравнительные результаты идентификации исследованных штаммов масс-
система API 20E)
Таблица
спектрометрическим н бнохнмческнм методом (тест-
Исходная таксоно- Результаты масс-спектрометрического анализа Результаты идентификации в системе API 20E
мическая характеристика штаммов по микробиологическим тестам число исследованных штаммов основной таксон идентификация число исследованных штаммов основной таксон идентификация
V. cholerae Ol
V. cholerae Ol39
V. cholerae не Ol/ Ol39
V. alginolyticus
V. parahaemolyticus V. metschnicovii V. vulnificus
V. fluvialis
Aeromonas sp.
l0 V. cholerae
2 V. cholerae
7 V. cholerae
2 V. alginolyticus
3 V. parahaemolyticus l V. metschnicovii
l V. vulnificus
3 V. fluvialis
Aermonas caviae
Достоверная до вида То же
Вероятная до рода
Достоверная до рода, вероятная до вида
Достоверная до вида
То же
l0 V. cholerae
2 V. cholerae 4 V. cholerae
3 V. cholerae V. alginolyticus V. alginolyticus V. parahaemolyticus Aeromonas sp. V. vulnificus
V. fluvialis
A. hydrophila/caviae/sorbia V. fluvialis
A. hydrophila/caviae/sorbia V. fluvialis
A.hydrophila/caviae/sorbia A. hydrophila
V. fluvialis
A. hydrophila/caviae/sorbia V. fluvialis
A. hydrophila/caviae/sorbia V. fluvialis
A. hydrophila/caviae/sorbia
Предположительная То же
Сомнительная
Хорошая
Сомнительная
Неприемлемый Сомнительная
Низкая
дискриминация
Сомнительная Низкая
дискриминация
Сомнительная
4
живающей способности метода пробоподготовки токсигенных штаммов V. cholerae, относящихся ко II группе патогенности.
Ранее было показано, что метод подготовки проб для масс-спектрометрии посредством спиртовой обработки с последующей экстракцией муравьиной кислотой и ацетонитрилом оказывает обеззараживающее действие на многие виды патогенных микроорганизмов, обеспечивает максимальное качество получаемых спектров и позволяет сохранять образцы для проведения повторных или отсроченных исследований [14].
Проведенные экспериментальные исследования по оценке специфической стерильности белковых препаратов V. cholerae, полученных с использованием указанного метода, подтвердили его эффективную обеззараживающую способность. Отсутствие роста холерного вибриона при посеве белковых экстрактов из трех штаммов V. cholerae, а также смывов с поверхности MS-чипа позволило дальнейшие исследования осуществлять в соответствии с требованиями, предъявляемыми к обеззараженному материалу [15].
Для получения референсных спектров V cholerae использовали белковые экстракты 5 типичных штаммов О1 (классического и эльтор биоваров) и О139 се-
рогрупп разной эпидемической значимости, а также одного штамма V. cholerae не О1/О139. Штаммы и соответствующие им масс-спектрометрические профили представлены на рис.1. Каждый референсный спектр представлял собой сумму 72 одиночных спектров, отвечающих следующим качественным критериям: алгоритм идентификации пика - Centroid, соотношение сигнал/шум для каждого пика спектра - не менее 2, количество качественных пиков - до 300, минимальная интенсивность пика - не менее 100 отн. ед., ширина пика 4 m/z. Полученные таким образом референсные спектры импортировали в базу данных программы Biotyper MALDI Biotyper 3.0 (build 25), которую использовали для дальнейшей работы по идентификации.
На первом этапе выполняли исследование неток-сигенных штаммов V. cholerae, а также других представителей рода Vibrio и Aeromonas, относящихся к III-IV группам патогенности (всего 39 штаммов) с использованием метода прямого нанесения. Результаты идентификации соответствовали данным классического бактериологического анализа. Для подавляющего большинства штаммов полученное значение SV составило 2,3 и более, что позволяет с высокой
Рис. 2. Спектры штаммов V. cholerae, полученные с интервалом 2 мес (линия А- июль 2012 г., линия Б - сентябрь 2012 г, линия В - ноябрь 2012 г).
вероятностью относить исследуемый микроорганизм к определенному виду. Меньшие значения SV зарегистрированы для штамма V. cholerae не О1/О139 1-10 и V. metschnicovii 5 (1,976, 1,955 и 1,948 соответственно).
На втором этапе исследовали токсигенные и нетоксигенные штаммы V. cholerae (n=32) разных серогрупп, предварительную про-боподготовку которых осуществляли методом белковой экстракции. В процессе идентификации все штаммы отнесены к виду V. cholerae (зарегистрированы значения SV 2,3 и более).
Для дополнительной проверки и сравнительной оценки эффективности результатов масс-спект-рометрического анализа проводили выборочное исследование некоторых штаммов с использованием системы биохимической идентификации API 20E.
Из 19 отнесенных масс-спектрометрическим методом к V. cholerae штаммов 16 были идентифицированы системой API 20E как V. cholerae на уровне предположительной идентификации, с идентичностью (% ид.) с представителями данного вида 99,9%. Для 3 штаммов V. cholerae не О1/ О139-серогруппы зарегистрирован сомнительный профиль идентификации (99,6% ид.).
Результаты биохимической идентификации с использованием системы API 20E для других представителей рода Vibrio (n=10) оказались более вариабельными: идентичность профилей штаммов
V alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. vulnificus с существующими в базе составляла от 90,8 до 99,6%. Провести при помощи системы API 20E идентификацию
V metschnicovii не удалось - профиль идентификации неприемлемый. Также при использовании этого метода оказались затруднены идентификация штаммов
V fluvialis и их дифференциация с представителями рода Aeromonas. Сравнительные результаты идентификации разными методами представлены в таблице.
Во всех случаях результаты масс-спектрометрического анализа полностью соответствовали данным классической микробиологической идентификации. Высокие значения SV позволяли
MALDI
ll J Ill.LiI .,].,
1 1,1 Li. J
u.,.,1. i.
1 Nil ij..i,. i
1 и,
ll J
ll ..1. U.,.1 . i
hi. Ll..L.
. 4i.LL.4i. .1
±1Л1
I I.LI.IiIJ 1.1.1.1 ,
Illil Li. i
ii...,. i
ii I,I . i
b...< i
...... u.,,1 1
Vibrio metchnicovii 5 2010 water Kemerovo -
Aeromonas 140 1974 water Yakutia -
Aeromonas 141 1975 water Irkutsk region -
Aeromonas 1-09 2009 water Irkutsk -
Aeromonas 137 1975 nd nd -
Vibrio alginolyticus 134 nd nd nd -
Vibrio vulnificus 1-12 2012 water Sochi -
Vibrio parahaemolyticus 3-12 2012 water Sochi -
Vibrio parahaemolyticus 155 nd patient Japan -
Vibrio parahaemolyticus 81 nd nd nd -
Vibrio alginolyticus 80 nd nd nd -
Vibrio fluvialis 1-11f 2011 water Irkutsk -
Vibrio fluvialis 3-11f 2011 silt Irkutsk -
Vibrio fluvialis 2-11f 2011 water Irkutsk -
Vibrio cholerae 0139 1-13 1993 patient Azov ctxB3 +
Vibrio cholerae cholerae 01 145 1958 nd India ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 I-638 1974 water Irkutsk -
Vibrio cholerae eltor 01 10-11 2011 silt Irkutsk -
Vibrio cholerae 0139 3-06 2006 water Irkutsk -
Vibrio cholerae non01/0139 ch_13 2011 water Beijing -
Vibrio cholerae non01/0139 18-10 2010 water Irkutsk -
Vibrio cholerae non01/0139 8-10 2010 silt Irkutsk -
Vibrio cholerae non01/0139 1-11 2011 water Irkutsk -
Vibrio cholerae non01/0139 19-11 2011 water Irkutsk -
Vibrio cholerae non01/0139 1-10 2010 water Irkutsk -
Vibrio cholerae non01/0139 2-10 2010 silt Irkutsk -
Vibrio cholerae non01/0139 5-11 2011 silt Irkutsk -
Vibrio cholerae non01/0139 P-9741 1973 water nd -
Vibrio cholerae non01/0139 8-11 2011 water Irkutsk -
Vibrio cholerae non01/0139 3-11 2011 water Irkutsk -
Vibrio cholerae eltor 01 1-11 2011 water Irkutsk -
Vibrio cholerae RO 4-06 2006 water Irkutsk -
Vibrio cholerae eltor 01 1-1181 1994 patient Novosybirsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 69 2011 water Borzya -
Vibrio cholerae 0139 204 1999 sewage Novosybirsk -
Vibrio cholerae 0139 59Din nd nd France ctxB3 +
Vibrio cholerae cholerae 01 8 1942 nd Stalingrad ctxB1 +
Vibrio cholerae cholerae 01 569В 1948 nd Calcutta ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-441 1972 patient Omsk ctxB3 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1263 1997 patient Irkutsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 357-11-C 2011 water Ussuriisk -
Vibrio cholerae 0139 1-16 2006 water Irkutsk -
Vibrio cholerae eltor 01 107 2011 water Barnaul -
Vibrio cholerae eltor 01 1-1299 1999 patient Y-Sakhalinsk -
Vibrio cholerae RO 1-1353 2000 water Vladivostok -
Vibrio cholerae eltor 01 1-1309 1999 patient Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1303 1999 patient Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1305 1999 patient Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1312 1999 silt Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 M-878 nd nd nd ctxB3 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1307 1999 patient Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1425 2007 water Ussuriisk region -
Vibrio cholerae eltor 01 1-1452 2010 water Irkutsk -
Vibrio cholerae eltor 01 1-1298 1999 patient Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1300 1999 patient Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1310 1999 water Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1302 1999 patient Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1313 1999 sewage Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Vibrio cholerae eltor 01 1-1308 1999 patient Y-Sakhalinsk ctxB1 +
Рис. 3. Дендрограмма, построенная по алгоритму Neighbor-Joining на основании сравнения масс-спектрометрических профилей исследованных штаммов (указан идентификационный номер штамма, год, источник и место выделения. ctxB1/ctxB3 - тип холерного
токсина, +/- - наличие/отсутствие ctxAB, nd - характеристика неизвестна).
MOЛEKУЛЯPНAЯ ГЕНЕТИКА, MИKPOБИOЛOГИЯ И ВИPУСOЛOГИЯ №3, 2014
достоверно определять таксономическую принадлежность исследуемых микроорганизмов до видового уровня. Идентификация же штаммов в системе API 20E в большинстве случаев оказывалась на уровне предположительной или сомнительной, что требовало постановки дополнительных тестов.
При сопоставлении результатов исследования образцов с использованием разных методов пробоподго-товки выявлена значимая зависимость SV от метода: среднее значение SV при исследовании одних и тех же штаммов при прямом нанесении составляло 2,316, а при белковой экстракции - 2,456 (р=0,012793). Это свидетельствует о том, что метод белковой экстракции более предпочтителен для пробоподготовки. В то же время необходимо отметить, что при любом варианте пробоподготовки удалось выполнить идентификацию и правильно классифицировать микроорганизм. На наш взгляд, прямое нанесение реактивов как наиболее простой и быстрый метод, не требующий дополнительного оборудования, может рассматриваться в качестве метода выбора при масштабных скрининговых микробиологических исследованиях вибриофлоры поверхностных водоемов на этапе идентификации подозрительных на принадлежность к роду Vibrio колоний (после их предварительного тестирования в ориентировочной реакции агглютинации с О1 и О139 холерными сыворотками). При этом масс-спектрометрическому анализу посредством прямого нанесения материала следует подвергать не агглютинирующиеся указанными сыворотками колонии. Масс-спектрометрическую идентификацию агглютинирующихся колоний, а также культур, полученных при исследовании клинического материала и материала из объектов окружающей среды в условиях неблагополучной эпидемической обстановки, следует осуществлять после предварительной белковой экстракции.
Для оценки стабильности и воспроизводимости спектров культуры исследовали троекратно с интервалом 2 мес. Результаты анализа для некоторых штаммов представлены на рис. 2. Спектры, полученные для одного штамма в течение 6 мес, остаются практически неизменными (повторные исследования позволяют идентифицировать штамм до вида с высоким значением SV).
Нами также была предпринята попытка оценки возможности использования масс-спектрометрического анализа для внутривидовой дифференциации штаммов. Результаты кластерного анализа, выполненного на основе сравнения масс-спектрометрических профилей, представлены в виде дендрограммы на рис. 3.
При этом наблюдалась достаточно четкая дифференциация штаммов, относящихся к разным видам рода Vibrio. Все представители вида V. cholerae формировали отдельную группу, в которой выделяли несколько подгрупп. Разделение ассоциировали с некоторыми фенотипическими и эпидемиологическими особенностями исследованных штаммов. Так, отдельный кластер формировался штаммами не О1/О139-серогрупп, выделенными из воды поверхностных водоемов и ила. Штаммы, изолированные на вспышке холеры в г. Южно-Сахалинске в 1999 г., также составляли обособленную группу. В то же время закономерностей распределения штаммов в зависимости от их биовара, токсигенных свойств, особенностей струк-
туры детерминант вирулентности не наблюдалось.
Результаты проведенного исследования позволяют рассматривать методику идентификации представителей рода Vibrio с использованием технологии масс-спектрометрического анализа как достаточно эффективную. Oтносительно высокую стоимость оборудования компенсируют высокая производительность и простота метода, а также низкая стоимость расходных материалов. Возможность использования данного подхода для эпидемиологического типирования требует дополнительного изучения и иных алгоритмов анализа масс-спектров. В этом направлении перспективными представляются исследования по сравнению результатов масс-спектрометрического типирования и традиционных методов молекулярно-генетического анализа (мультилокусное сиквенстипирование, анализ числа вариабельных тандемных повторов, пульс-электрофорез), необходимые для уточнения возможностей метода и определения его места в лабораторной диагностике инфекций, вызываемых микроорганизмами рода Vibrio.
Сведения об авторах: ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Афанасьев Mаксим Владимирович - вед. науч. сотр. отдела эпидемиологии, канд.биол.наук. 664047 Иркутск; ул. Трилиссера, 78; е-mail: [email protected]
Mиронова Лилия Валерьевна - и.о. зав. лабораторией холеры, канд.мед.наук;
Басов Евгений Александрович - мл. науч. сотр. лаборатории холеры;
OaraE Александр Сергеевич - мл. науч. сотр. OБТK; ^ликалова Елена Станиславовна - ст. науч. сотр. лаборатории холеры, канд.мед.наук;
Урбанович Людмила Яковлевна - ст. науч. сотр. лаборатории холеры, д-р мед.наук;
Балахонов Сергей Владимирович - директор института, д-р мед.наук, проф.
ЛИТЕРАТУРА
1. Oнищенко Г.Г., Ганин В.С., Голубинский Е.П. Вибрионы не Ol серологической группы и их значение в патологии человека. M.: ГОУ ВУНMЦ M3 РФ; 2001.
2. Dieckmann R., Strauch E., Alter T. J. Appl. Microbiol. 2010; 109(1): 199-211.
3. Harris J.B., LaRocque R.C. et al. Lancet. 2010; 376: 1961-65.
4. Weekly Epidemiol. Rec. 2012; 87(31-32): 289-304.
5. Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемо-литическими и другими патогенными для человека вибрионами: Mетодические указания MУK 4.2.1793-03. M.; 2003.
6. Смоликова n.M., Ломов ЮМ., Хоменко Т.В. и др. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2001; 6: 3-7.
7. Лабораторная диагностика холеры: Mетодические указания MУK 4.2.2218-07. M.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2007.
8. Laboratory methods for the diagnosis of epidemic dysentery and cholera. Centres for Disease Control and Prevention. Atlanta, Georgia: CDC; 1999.
9. Croxatto A., Prod'hom G., Greub G. FEMS Microbiol. Rev. 2012; 36(2): 380-407.
10. van Belkum A., Welkee M. et al. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(5): 1513-7.
11. Dieckmann R., Strauch E., Alter T. J. Appl. Microbiol. 2010; 109(1): 199-211.
12. Eddabra R., Prévost G., Scheftel J.-M. Microb. Res. 2012; 167: 226-30.
13. Marklein G., Josten M., Klanke U. et al. J. Clin. Microbiol. 2009; 47: 2912-7.
14. Инструкции по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного и холерного микробов. Саратов; 1982.
15. Drivenek M., Dresler J., Klimentova J. et al. Lett. Appl. Microbiol. 2010; 109(1): 199-211.
16. Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патоген-ности (опасности): Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03. М.; 2003.
Поступила 27.03.13
MALDI-TOF MASS-SPECTROMETRIC ANALYSIS IN THE ACCELERATED IDENTIFICATION OF THE VIBRIO GENUS MICROORGANISMS
Afanasev M. V., Mironova L. V., Basov E. A., Ostyak A. S., Kulikalova E. S, Urbanovich L. Ya, Balahonov S. V.
Irkutsk Antiplague Research Institute, Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Irkutsk, Russia
The goal of this work was to develop methodological approaches to identification of the Vibrio genus representatives using the MALDI-TOF mass-spectrometric analysis technologies. The aspects of the biological safety in sample preparations for mass-spectrometric analysis were studied, reference spectra of six typical V. cholerae strains were developed. Identification of 55 strains, representatives of the Vibrio genus, including 45 V. cholerae strains with different epidemic importance, was performed using the MALDI Biotyper 3.0 basis comprising V. cholerae reference spectra. The possibility of reliable definition of the tested strain taxonomic belonging to the species level was demonstrated. Thus, the results completely corresponded to the data of classical microbiological identification. Stability and reproducibility of the offered research method was experimentally shown.
The results allow identification of the Vibrio genus representatives to be implemented with the use of the mass-spectrometric analysis as an effective method that defines a species belonging of the basic Vibrio genus representatives in the shortest terms.
Key words: Vibrio genus; MALDI-TOF mass-spectrometric analysis; identification.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.36-002-022:578.891]-078
Воронина О.Л., Кунда М.С., Гудов В.П., Аксенова Е.И., Шилова В.С., Ярош Л.В., ЭльгортД.А.,
Лунин В.Г., Семененко Т.А.
ПОИСК РНК АУТОХТОННОГО ДЛЯ РОССИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА Е В НАИБОЛЕЕ
ВЕРОЯТНЫХ ИСТОЧНИКАХ ИНФЕКЦИИ
ФГБУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи
Минздрава РФ, 123098, Москва, Россия
Исследования, проводившиеся на протяжении 30 лет с момента открытия вируса гепатита Е (ВГЕ), доказали наличие аутохтон-ного ВГЕ в неэндемичных районах - Европе и России в целом. Мониторинг антител к ВГЕ (анти-ВГЕ) у населения РФ выявил регионы с повышенной серопревалентностью, что свидетельствует о высокой вероятности инфицирования ВГЕ лиц, проживающих в этих областях. Особую опасность контакт с ВГЕ может представлять для пациентов из групп риска. В настоящем исследовании проведено тестирование сывороток крови этих контингентов на наличие анти-ВГЕ. Серопозитивные сыворотки от лиц из регионов с высоким процентом выявления анти-ВГЕ, пациентов из групп риска, образцы с высокой вероятностью содержания ВГЕ, в том числе от животных, являющихся возможным резервуаром ВГЕ, были использованы для выделения РНК. Разработанная система детекции РНК ВГЕ как в ОТ-ПЦР в реальном времени, так и в варианте гнездовой ПЦР, подтвердила свою чувствительность на синтетических контролях и положительных контролях коммерческой тест-системы компании «Genesig» (Великобритания).
Во всех исследованных образцах РНК ВГЕ отсутствовала, что свидетельствует о низкой частоте встречаемости вирусоноси-тельства аутохтонного ВГЕ и необходимости расширения выборки до десятков тысяч человек для достоверного выявления РНК вируса.
Ключевые слова: вирус гепатита Е; анти-ВГЕ IgG; анти-ВГЕ IgM; РНК ВГЕ.
30 лет назад М.С. Балаян и соавт. идентифицировали вирус гепатита Е (ВГЕ) с помощью иммуноэлектронной микроскопии [1].
Через 20 лет по результатам исследования эндемичных по ВГЕ районов Узбекистана и Киргизии С.Н. Кузиным и соавт. было показано, что в Кашкадарьинской области Узбекистана антитела к ВГЕ были обнаружены у 22,1% пациентов с острым гепатитом Е (ГЕ), включая смешанные инфекции (гепатит А (ГА) или гепатит В (ГВ)). В неэндемичных районах антитела к ВГЕ обнаружены у 4% доноров в Сургуте, у 1,6% пациентов с ВИЧ и у 1,1% медицинских работников в Москве [2].
Еще через 10 лет в Нижегородской области среди мигрантов из эндемичных по ВГЕ районов А.В. Поляниной и соавт. анти-ВГЕ IgG выявлены у 31,9±3,7% обследованных. Среди «условно-здорового» населения частота выявления анти-ВГЕ IgG составила 4,4±2,1% [3]. Таким образом, резких изменений в показателях сероконверсии за прошедшие годы не обнаружено.
Гепатит Е отличает фульминантное течение у беременных женщин в эндемичных по ВГЕ районах. Изучение этой группы пациентов в 2000-х годах показало, что частота обнаружения анти-ВГЕ IgG среди беременных женщин, проживающих в Египте, составила 61,4%, а в России — 1,2% [4]. Таким образом, в неэндемичных районах (в том числе в России) и в этой группе выявление лиц, контактировавших с ВГЕ, чрезвычайно редко.
Подтверждением фактов завоза вируса ГЕ из эндемичных районов служат ретроспективные исследования заболеваемости ГЕ в 2000-2012 гг. в Санкт-Петербурге (установленные с помощью исследования анти-ВГЕ IgG, IgM в сыворотке больных), показавшие, что и в эти годы ГЕ преимущественно болели мигранты из стран с тропическим и субтропическим климатом и лица, приехавшие на учебу из Индии [5].
Как показали исследования геномов ВГЕ, генотипы 1 и 2 распространены в эндемичных районах: генотип 1 — в странах тропических и субтропических районов Азии и Африки, генотип 2 — в Мексике, Нигерии, Чаде, и циркулируют среди людей [6]. ВГЕ генотипа 3 распространен повсеместно как среди животных, так и среди людей [7]. ВГЕ генотипа 4, ранее признанный эндемичным для Индии [8], в настоящее время обнаружен у свиней в Нидерландах и Бельгии и является причиной гепатита у человека [9].
Заболевания, вызываемые ВГЕ генотипов 3 и 4, по всей видимости, следует отнести к зоонозам. Это предположение высказал М.С. Балаян в 2000 г [10], и оно находит все больше подтверждений, в том числе и филогенетических. A.M. Purdy и Yu.E. Khudyakov, проанализировав 55 геномов ВГЕ,
