CC BY
52023 т 13 № 2 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
УДК 615.849.12 DOI: 10.29039/2224-6444-2023-13-2-20-24
ПРОЛИФЕРАТИВНО-АПОПТОТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭПИТЕЛИЯ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОНАМИ В ДОЗЕ 2 ГР
Каракаева Э. Б-Г.1, Шаповалова Е. Ю.1, Саакян С. В.1, Зорин И. А.3, Корякин С. Н.2
'Институт «Медицинская академия имени С. И. Георгиевского» ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия
Национальный медицинский исследовательский центр радиологии Минздрава России (НМИЦ радиологии), 249036, ул. Королева, 4, Обнинск, Россия
3ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), 119048, ул. Трубецкая, 8, стр.2, Москва, Россия
Для корреспонденции: Шаповалова Елена Юрьевна, д.м.н., профессор, заведующая кафедрой гистологии и эмбриологии, Институт «Медицинская академия имени С. И. Георгиевского», ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского»; e-mail: shapovalova_l@mail.ru
For correspondence: Shapovalova Yelena Yu., MD, Head of the Department of Histology and Embryology, Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, e-mail: shapovalova_l@mail.ru
Information about authors:
Karakaeva E. B-G., https://orcid.org/0000-0001-9833-3433 Saakian S. V., https://orcid.org/0000-0001-8606-8716 Shapovalova E. Y., http://orcid.org/0000-0003-2544-7696 Zorin I. A., https://orcid.org/0000-0002-1621-7015 Koryakin S. N., https://orcid.org/0000-0003-0128-4538
РЕЗЮМЕ
Одним из основных компонентов пищеварительной системы является тонкий кишечник, в котором происходит переваривании и всасывание питательных компонентов (полостное, пристеночное, мембранное пищеварение). Радиационная терапия способна оказывать повреждающее действие на слизистую оболочку тонкой кишки в основном за счет истощения пула стволовых клеток в криптах. Такое повреждение может вызывать не только нарушении гистоархитектонику, но и целиком изменять структуру и функцию тонкой кишки. В то же время пролиферативный индекс на основе Ki-67 может быть использован не только для диагностики состояния, но и дальнейшего прогноза. Таким образом, на основании оценки апоптотической и пролиферативной возможно оценить влияние облучения электронами на морфофункциональное состояние эпителия тонкой кишки. Цель исследования - иммуногистохимическая оценка пролиферации и апоптоза эпителия тонкой кишки после локального облучения электронами в дозе 2 Гр. Материалы и методы. Фрагменты тонкой кишки половозрелых крыс линии Вистар (n=30) двух групп: I - контрольная (n=10); II - опытная группа (n = 20; локальное однократное облучение электронами в дозе 2 Гр) исследовали методом световой микроскопии, используя окрашивание гематоксилином и эозином и иммуногистохимические реакции с антителами к Ki-67 и Cas3.Результаты. Во II группе количество каспаза-3-позитивных эпителиоцитов было увеличено в 3,0 раза (6.34±2.17% против 2.21±0.87%). Пролиферативный индекс, оцененный по значениям Ki-67, напротив, снижался относительно контрольной группы, в 1,2 раза (72.94±8.09% против 89.83±9.41%). На 3 сутки отмечали начало регенеративно-восстановительных процессов: количество каспаза-3-позитивных эпителиоцитов тонкой кишки снижалось, а индекс пролиферации увеличивался. Во II группе количество каспаза-3-позитивных энтероцитов было увеличено в 2,0 раза (4.11 ±1.79% против 2.21±0.87%). Пролиферативный индекс составил - 80.11 ±8.23%. Заключение. При локальном облучении электронами тонкой кишки в дозе 2 Гр отмечается снижение количества энтероцитов на 1 сутки с последующим восстановлением на 3 сутки.
Ключевые слова: радиотерапия, электроны, облучение, каспаза-3, Ki-67/
PROLIFERATIVE-APOPTOTIC FEATURES OF BOWEL EPITHELIUM AFTER 2 GY ELECTRON IRRADIATION
Karakaeva E. B-G.1, Shapovalova E. Y.1, Saakian S. V.1, Zorin I. A.3, Koryakin S. N.2
'Institution «Medical Academy named after S. I. Georgievsky» of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia 2National Medical Research Centre of Radiology, Obninsk, Russia
3I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia
SUMMARY
One of the main components of the digestive system is the small intestine, where not only digestion and absorption of nutrients takes place, but also a barrier function. Radiation therapy can have a damaging effect on the mucosa of the small intestine mainly due to depletion of the stem cell pool in the crypts. Such damage can cause not only abnormal histoarchitectonics, but also completely change the structure and function of the small intestine. At the same time, proliferative index based on Ki-67 can be used not only for diagnosis of the condition but also for further prognosis. Thus, on the basis of apoptotic and proliferative assessment it is possible to assess the effect of ionizing irradiation by
electrons on the functional state of the small intestine epithelium. The aim of the investigation was immunohistochemi-cal estimation of proliferation and apoptosis of small intestinal epithelium after local electron irradiation by the dose of
2 Gy. Materials and methods. Animals - sexually mature Wistar rats (n=30) were divided into two groups: I - control (n = 10); II - experimental group (n = 20), local single electron irradiation at a dose of 2 Gy. Immunohistochemical method and hematoxylin and eosin staining were used to study colon fragments. Results. The number of caspase-3-positive cells was increased 3.0-fold (6.34±2.17% vs. 2.21±0.87%) in group II. In contrast, the proliferative index assessed by Ki-67 expression decreased 1.2-fold relative to the control group (72.94±8.09% vs. 89.83±9.41%). On day 3, the beginning of regenerative processes was noted: the number of caspase-3-positive cells decreased and the proliferation index increased. In group II, the number of caspase-3-positive cells was increased 2.0-fold (4.11±1.79% vs. 2.21±0.87%). The proliferative index co-stabilized - 80.11±8.23%. Conclusion. Under local electron irradiation of the small intestine at the dose of 2 Gy, the number of enterocytes decreased by 1 day with a subsequent recovery by
3 days.
Key words: radiotherapy, electrons, irradiation, caspase-3, Ki-67
Одним из основных компонентов пищеварительной системы является тонкий кишечник, в котором происходит переваривании и всасывание питательных компонентов (полостное, пристеночное, мембранное пищеварение), а также осуществляется барьерная функция против вредных и иммуногенных веществ [1]. Эти функции осуществляются благодаря уникальному строению слизистой оболочки, одной из важнейших критериев которой является целостность. Однако, как и все эпителиальные ткани, слизистая тонкого кишечника чрезвычайно уязвима перед действием облучения [2; 3].
На сегодняшний день облучение является одним из основных методов в терапии злокачественных новообразований. Радиационная терапия способна оказывать повреждающее действие на слизистую оболочку тонкой кишки в основном за счет истощения пула стволовых клеток в криптах. Такое повреждение может вызывать не только нарушении гистоархитектонику, но и целиком изменять структуру и функцию тонкой кишки. Несмотря на наличие данных о морфологических особенностях радиоационно-индуцированных повреждениях при различных видах облучения, сведений об ионизирующем воздействии на тонкую кишку крайне мало. Молекулярные механизмы пролиферативно-апоптотических процессов все еще остаются неизученными и требуют значительного дополнения.
В некоторых исследованиях установили, что воздействие радиации происходит по трем основным путям, инициирующих апоптоз: ионизации клеток и образованию активных форм кислорода, что приводит к дисбалансу в антиоксидантной системе и повреждению молекул ДНК (внутренний путь); взаимодействию с рецепторами клеточной смерти (внешний путь); и мембранному повреждению [4; 5]. Внутренний путь опосредован через белок р53, который отслеживает повреждения ДНК и запускает каспазный каскад, в котором задействованы инициаторные (каспаза-8, -9, -10) и эффекторные (каспаза-3, -6, -7) каспазы. Инициаторные каспазы отвечают за запуск каскада и ак-
тивируют эффекторные, которые в свою очередь обеспечивают деструктуризацию и гибель клетки [6]. Внешний путь апоптоза реализуется также через каспазный каскад, а мембранное повреждение приводит сразу к активации каспазы-3.
Стоит отметить, что эпителий тонкой кишки обладает высоким пролиферативным потенциалом. Показатели пролиферативного индекса, оцененного по значениям Ю-67, могут быть использованы не только для диагностики, но и дальнейшего прогноза лучевого повреждения [7; 8].
Таким образом, на основании оценки апопто-тической и пролиферативной возможно оценить влияние облучения электронами на функциональное состояние эпителия тонкой кишки.
Цель исследования - иммуногистохимическая оценка пролиферации и апоптоза эпителия тонкой кишки после локального облучения электронами в дозе 2 Гр.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Животные - половозрелые крысы линии Ви-стар (п=30) были поделены на две группы: I -контрольная (п=10); II- опытная группа (п = 20), локальное однократное облучение электронами в дозе 2 Гр.
Облучение животных проводили в отделе радиационной биофизики МРНЦ имени А.Ф. Цыба (г. Обнинск, Россия) на линейном акселераторе '^ОУАС-П" (мощность дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ и частота 9 Гц, размер поля - 0 100 мм).
По половине животных из каждой группы выводили из эксперимента на 1 и 3 сутки.
Все манипуляции выполняли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации.
Фрагменты тощей кишки фиксировали в за-буференом формалине, заливали в парафиновые блоки, нарезали на микротоме толщиной 3 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопический анализ выполняли с помощью си-
2023, т. 13, № 2
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
стемы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD).
Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере BondMax («Leica», Германия). Первичные антитела: к каспаза-3 (Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific; 74T2, 1:50) и Ki-67 (Abcam; ab15580, 1:100); вторичные - универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, «Cell Marque», США). Количество позитивных клеток подсчитывали в 10 полях зрения, на увеличении х400.
Полученные данные обрабатывали при помощи компьютерной программы SPSS 10.0 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США) и вычислением средней арифметической, ошибки средней, критерия Стьюдента. Значимыми считали различия между средними показателями при p<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В тощей кишке контрольной группы не выявили признаков воспаления и опухолевого роста, а также нарушения гистоархитектоники на 1 и 3 сутки.
Во всех образцах тощей кишки у животных, облученных электронами дозой 2 Гр (II группа) на 1 сутки обнаружили незначительное сниже-
ОБСУЖДЕНИЕ
Настоящее исследование посвящено иммуно-гистохимической оценке пролиферации и апоп-тоза эпителия тонкой кишки после локального облучения электронами в дозе 2 Гр.
При гистологическом исследовании было выявлено, что наибольшую радиочувствительность к облучению электронами отмечали у низкодиф-ференцированного росткового пула клеток, о чем говорит дезинтеграция эпителиоцитов в области кишечных крипт. Полученные данные частично совпадают с результатами других работ, в которых использовали другие виды излучения [9-11].
При ИГХ-исследовании на 1 сутки наблюдали значительное усиление экспрессии каспазы-3 преимущественно в стволовых клетках эпителия тонкой кишки после локального облучения элек-
ние количества бокаловидных клеток и редукцию клеток Панета. В собственной пластинке слизистой оболочки наблюдали слабую воспалительную инфильтрацию. Напротив, на 3 сутки количество бокаловидных клеток и клеток Панета были схожи с контрольной группой, воспалительную инфильтрацию не отмечали.
При иммуногистохимическом исследовании прослеживалась закономерность в преобладании апоптотических процессов над пролиферативны-ми на 1 сутки после эксперимента. Во II группе количество каспаза-3-позитивных клеток было увеличено в 3,0 раза (6.34±2.17% против 2.21±0.87%). Пролиферативный индекс, оцененный с помощью экспрессии К>67, напротив, снижался относительно контрольной группы, в 1,2 раза (72.94±8.09% против 89.83±9.41%) (табл. 1, рис. 1).
На 3 сутки отмечали начало регенеративно-восстановительных процессов: количество каспаза-3-позитивных клеток снижалось, а индекс пролиферации увеличивался. Во II группе количество каспаза-3-позитивных клеток было увеличено в 2,0 раза (4.11±1.79% против 2.21±0.87%) относительно контрольной группы. Пролифератив-ный индекс, оцененный с помощью экспрессии Ю-67 оставался сниженным относительно контрольной группы, в 1,1 раза (80.11±8.23% против 89.83±9.41%) (табл. 1, рис. 1).
тронами в дозе 2 Гр, что частично согласуется с данными других авторов, использующих, как правило, гамма-облучение. Каспаза-3 является основной эффекторной каспазой, которая запускает деструктуризацию клетки, что указывает на терминальную стадию апоптоза в иммуно-позитивных энтероцитах [5; 12]. Тем не менее, стоит отметить, что количество апоптотических клеток при облучении электронами в дозе 2 Гр значительно меньше, чем при облучении экспериментальных животных аналогичной дозой другими видами облучения, что свидетельствует о его меньшем повреждающем эффекте.
Пролиферативный индекс (митотический потенциал) оценивали маркированием на Кь 67. Значительное снижение количества Ю-67-иммунопозитивных клеток на первые сутки указывает на неспособность облученных клеток
Таблица 1
Количество ИГХ-позитивных энтероцитов, в %, средняя ± стандартное отклонение
маркер 2 Гр (II) Контроль (I)
1 сутки 3 сутки
каспаза-3 6.34±2.17а 4.11±1.79 2.21±0.87
Ki-67 72.94±8.09а 87.34±10.56 89.83±9.41
Примечание: аконтроль (I) и II группа; p <0.01
каспаза-3
Ел-67
II группа, 1 сутки
II группа, 3 сутки
контроль
Рис. 1. Тонкая кишка после локального однократного облучения электронами в дозе 2 Гр. Иммуноги-стохимическоеисследование,докрашивание -гематоксилином,увел.х200.
вступать в дальнейшие фазы клеточного цикла. Стоит отметить, что снижение количества им-мунопозитивных клеток связано с укорочением кишечных крипт. То есть наиболее радиосенситивными к облучению электронами являются стволовые клетки. Однако, на 3 сутки количество Ю-67-иммунопозитивных энтероцитов было восстановлено. Такие результаты позволяют предположить, что при облучение электронами в дозе 2 Гр количество сохранных стволовых клеток обладает высоким пролиферативным потенциалом, обеспечивая регенерацию эпителия за один про-лиферативный цикл, который в среднем длится 3 - 5 суток [7; 8; 13].
Таким образом, раскрытые в ходе настоящего исследования, механизмы клеточной гибели, индуцированной бетта-облучением, и регенеративного следует учитывать при определение лечебной тактики в современной лучевой диагностике и терапии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При локальном облучении электронами тонкой кишки в дозе 2 Гр отмечается снижение количества энтероцитов на 1 сутки с последующим восстановлением на 3 сутки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
2023, т. 13, № 2
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Collins J. T., Nguyen A., Badireddy M. Anatomy, Abdomen and Pelvis, Small Intestine. StatPearls (Internet). StatPearls Publishing; 2022. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/ NBK459366/.
2. Park H. S., Goodlad R. A., Ahnen D. J., Winnett A., Sasieni P., Lee C. Y., Wright N. A. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 1997;151(3):843-52.
3. Livanova A. A., Fedorova A. A., Zavirsky A. V., Bikmurzina A. E., Krivoi I. I., Markov A. G. Dose and time dependence of functional impairments in rat jejunum following ionizing radiation exposure. Physiol Rep. 2021;9(15):e14960. doi:10.14814/ phy2.14960.
4. Merritt A. J., Potten C. S., Watson A. J. M., Loh D. Y., Nakayama Kichi, Nakayama K., Hickman J. A. Differential expression of bcl-2 in intestinal epithelia. Correlation with attenuation of apoptosis in colonic crypts and the incidence of colonic neoplasia. J Cell Sci. 1995;108 (Pt 6):2261-2271. doi:10.1242/jcs.108.6.2261
5. Olsson M., Zhivotovsky B. Caspases and cancer. Cell Death Differ. 2011;18(9):1441-9. doi:10.1038/cdd.2011.30
6. Beroske L., Van den Wyngaert T., Stroobants S., Van der Veken P., Elvas F. Molecular Imaging of Apoptosis: The Case of Caspase-3 Radiotracers. Int J Mol Sci. 2021;22(8):3948. doi:10.3390/ ijms22083948
7. Akedo I., Ishikawa H., Ioka T., Kaji I., Narahara H., Ishiguro S., Suzuki T., Otani T. Evaluation of epithelial cell proliferation rate in normal-appearing colonic mucosa as a high-risk marker for colorectal cancer. Cancer Epidemiol Biomark Prev Publ Am Assoc Cancer Res Cosponsored Am Soc Prev Oncol. 2001;10(9):925-30.
8. Andrés-Sánchez N., Fisher D., Krasinska L. Physiological functions and roles in cancer of the proliferation marker Ki-67. J Cell Sci. 2022;135(11):jcs258932. doi:10.1242/jcs.258932.
9. Totonelli G., Maghsoudlou P., Garriboli M., Riegler J., Orlando G., Burns A. J., Sebire N. J., Smith V. V., Fishman J. M., Ghionzoli M., Turmaine M., Birchall M. A., Atala A., Soker S., Lythgoe M. F., Seifalian A., Pierro A., Eaton S., De Coppi P. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 2012;33(12):3401-10. doi:10.1016/j. biomaterials.2012.01.012.
10. Gehring J. The influence of ionising radiation (Beta/gamma) on various polymers based on the result of the cytotoxicity test. Radiat Phys Chem. 1995;46(4, Part 1):617-22.
11. Kareliotis G., Tremi I., Kaitatzi M., Drakaki E., Serafetinides A. A., Makropoulou M., Georgakilas A. G. Combined radiation strategies for novel and enhanced cancer treatment. Int J Radiat Biol. 2020;96(9):1087-103. doi:10.1080/09553002 .2020.1787544.
12. Zhou M., Liu X., Li Z., Huang Q., Li F., Li C. Y. Caspase-3 regulates the migration, invasion and metastasis of colon cancer cells. Int J Cancer. 2018;143(4):921-30. doi:10.1002/ijc.31374.
13. Kanth P., Rajan T. Chromogranin A and Ki67 Marker in Normal Colon, Serrated Polyp and Colorectal Tubular Adenoma. Am J Gastroenterol. 2011;106:S562.
