CC BY
11
Раздел - молекулярная медицина, патоморфология
Влияние факторов роста тромбоцитов на пролиферацию сперматогенного эпителия после локального облучения электронами в нестерилизующей дозе
12 3 4 1 2
' Демяшкин Г.А., Боровая Т.Г., Андреева Ю.Ю., Корякин С.Н., Вадюхин М.А.,
12 5
' Щекин В.И., Лысанская Е.В.
1Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба - филиала Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Обнинск 249036, ул. Королева, 4
2Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва 119435, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2
3Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва 123098, ул. Гамалеи, 18 4Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации, . Москва 123098, ул. Баррикадная, д. 2/1, стр. 1
5Обнинский институт атомной энергетики - филиал Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», Обнинск, 249040, Студгородок, 1 Информация об авторах
Демяшкин Григорий Александрович - к.м.н., заведующий отделом патоморфологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, ведущий
научный сотрудник Института трансляционной медицины и биотехнологии ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) Минздрава России; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8447-2600
Боровая Татьяна Геннадьевна - д.м.н., член-корреспондент РАН, профессор, главный научный сотрудник лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ НИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8444-18013
Андреева Юлия Юрьевна - д.м.н., профессор кафедры патологической анатомии ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4749-6608 Корякин Сергей Николаевич - к.б.н., заведующий отделом радиационной биофизики МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0128-4538
Вадюхин Матвей Анатольевич - студент факультета Международная школа «Медицина будущего» ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) Минздрава России, ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6235-1020
Щёкин Владимир Иванович - студент факультета Международная школа «Медицина будущего» ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) Минздрава России, ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3763-7454
Лысанская Елена Викторовна - студент ИАТЭ НИЯУ МИФИ, ORCID:
https://orcid.org/0000-0002-6396-1090
Контактное лицо
Демяшкин Григорий Александрович, e-mail: dr.dga@mail.ru Резюме
Нарушение мужской репродуктивной функции, вызванное облучением электронами, приводящим к снижению пролиферативной активности половых клеток, а также разработка способов её коррекции являются актуальными. Влияние факторов роста бедной лейкоцитами
плазмы, обогащенной тромбоцитами (LP-PRP), обладающих высокой регенеративной способностью для восстановления сперматогенеза остается малоизученным. Цель исследования: иммуногистохимическая оценка пролиферации сперматогенного эпителия после облучения электронами дозой 2 Гр и коррекции плазмой, обогащенной тромбоцитами.
Материал и методы. Крысы породы Wistar (n=135) были поделены на 5 групп: I - контроль, II - 2IR, III - 2IR+LP-PRP+IGF-1, IV - 2IR+LP-PRP и V - LP-PRP. В I группе (n=10), крысам вводили физиологический раствор; крысы II, III, IV групп (n=95) получали однократное локальное облучение семенников электронами дозой 2 Гр. Крысам III-ей группы в течение 11 недель вводили плазму, содержащую высокую концентрацию тромбоцитов и низкую концентрацию лейкоцитов - LP-PRP в комбинации с рекомбинантным человеческим IGF-1 (2IR+LP-PRP+IGF-1), крысам IV-ой группы (n=30) вводили только LP-PRP. Крысы V-ой группы (n=30) получали LP-PRP (без облучения). Животных всех групп выводили из эксперимента 1 раз в 2 недели на протяжении 12 недель. Семенники изучали гистологическим и иммуногистохимическим (ИГХ) методами, используя антитела к Ki-67, Bcl-2 и p53.
Результаты. К окончанию эксперимента, при ИГХ-исследовании в семенных канальцах после облучения выявили смещение пролиферативно-апоптотического баланса в сторону апоптоза половых клеток: уменьшение уровней экспрессии Ki-67 (16,3±1,1%, P < 0,05) и Bcl-2 (9,1±1,1%, P < 0,05), увеличение р53-позитивных клеток (74,8±1,2%, P < 0,05). На фоне введения PRP в комбинации с IGF-1 отмечали восстановление пролиферативной активности гамет, что было подтверждено увеличением доли Ki-67- и Bcl-2-позитивных половых клеток (56,7±1,2%, P < 0,05 и 3,9±1,2%, P < 0,05 соответственно).
Заключение. Факторы роста а-гранул активированных тромбоцитов PRP, являющиеся ключевыми регуляторами жизненного цикла половых клеток, после облучения стимулируют
восстановление пролиферативно-апоптотического баланса, усиленное дополнительным введением IGF-1 и подтвержденное на уровне экспрессии Ki-67, Bcl-2 и p53. Ключевые слова: сперматогенез, бесплодие, клеточный цикл, облучение, плазма, обогащенная тромбоцитами, факторы роста
Influence of platelet growth factors on the proliferation of germinal epithelium after local irradiation with electrons in a non-sterilizing dose
1,2Demyashkin G.A., 3Borovaya T.G., 4Andreeva Yu.Yu., 1Koryakin S.N., 2Vadyukhin M.A., 12Shekin V.I., 5Lysanskaya E.V.
1A.F. Tsyba Medical Radiological Research Center - branch of the Federal State Budgetary Institution "National Medical Research Center of Radiology" of the Ministry of Health of the Russian Federation, Obninsk 249036, Koroleva str., 4
Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education "I.M. Sechenov First Moscow State Medical University" (Sechenov University) Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow 119435, Trubetskaya str., 8, build. 2
"3
Federal State Budgetary Institution "National Research Center of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamalei" of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow 123098, Gamalei str., 18
4Federal State Budgetary Educational Institution of Additional Professional Education "Russian Medical Academy of Continuous Professional Education" of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow 123098, Barricadnaya str., 2/1, build. 1
5Obninsk Institute of Atomic Energy - branch of the Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education "National Research Nuclear University "MEPhI", Obninsk, 249040, Campus, 1
Authors
Demyashkin G.A. - PhD, Head of the Department of Pathomorphology of A.F Tsyb MRRC, leading researcher at the Institute of Translational Medicine and Biotechnology of Sechenov University, ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8447-2600
Borovaya T.G. - Doctor of Medical Sciences, Professor, Principal Researcher of the Laboratory of Anatomy of Microorganisms of the National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamalei, ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8444-18013
Andreeva Yu.Yu. - Doctor of Medical Sciences, Professor of the Department of Pathological Anatomy of the Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4749-6608
Koryakin S.N. - PhD, Head of the Department of Radiation Biophysics of A.F. Tsyb MRRC, ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0128-4538
Vadyukhin M.A. - student of the Faculty of the International School "Medicine of the Future" of Sechenov University, ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6235-1020
Shchekin V.I.- student of the Faculty of the International School "Medicine of the Future" of Sechenov University, ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3763-7454
Lysanskaya E.V. - student of the Obninsk Institute of Atomic Energy, ORCID:
https://orcid.org/0000-0002-6396-1090
Address for correspondence
Demyashkin Grigory Alexandrovich, e-mail: dr.dga@mail.ru Summary
Violation of male reproductive function caused by electron irradiation, leading to a decrease in the proliferative activity of germ cells, as well as the development of ways to correct it are relevant.
The influence of growth factors of platelet-rich leukocyte-poor plasma (LP-PRJ), which have a high regenerative ability to restore spermatogenesis, remains poorly understood.
Objective of the study: immunohistochemical assessment of the proliferation of germinal epithelium after electron irradiation with a dose of 2 Gy and the administration of platelet-rich plasma.
Material and methods. Wistar rats (n=135) were divided into 5 groups (conditional names): I -control, II - 2IR, III - 2IR+LP-PRP+IGF-1, IV - 2IR+LP-PRP and V - LP-PRP. In group I (n=10), rats were injected with saline solution; rats of groups II, III, IV (n=95) received a single local irradiation of the testes with electrons at a dose of 2 Gy. Group III rats were injected for 11 weeks with plasma containing a high concentration of platelets and a low concentration of leukocytes -LP-PRP in combination with recombinant human IGF-1 (2IR+LP-PRP+IGF-1), group IV rats (n=30) were injected only LP-PRP. Group V rats (n=30) received LP-DRP (without irradiation). Animals of all groups were removed from the experiment once every 2 weeks for 12 weeks. The testes were studied by histological and immunohistochemical (IHC) methods using antibodies to Ki-67, Bcl-2 and p53.
Results. IHC analysis of testes after irradiation showed a shift in the proliferative-apoptotic balance towards apoptosis of germ cells: a decrease in the expression levels of Ki-67 (16.3±1.1%, P < 0.05) and Bcl-2 (9.1±1.1%, P < 0.05), and an increase in p53-positive cells (74.8±1.2%, P < 0.05) by the end of the experiment. Against the background of the introduction of PRP in combination with IGF-1, a gradual restoration of the proliferative activity of gametes was noted, which was confirmed by an increase in the proportion of Ki-67- and Bcl-2-positive germ cells (56.7±1.2%, P < 0.05 and 33.9±1.2%, P < 0.05, respectively) by the end of the experiment.
Conclusion. Growth factors of a-granules of activated platelets PRP, which are key regulators of the germ cell life cycle, stimulate the restoration of proliferative-apoptotic balance after irradiation, enhanced by additional administration of IGF-1 and confirmed at the expression level of Ki-67, Bcl-2 and p53.
Key words: spermatogenesis, infertility, cell cycle, irradiation, platelet-rich plasma, growth factors
Введение
Проблема мужского бесплодия затрагивает до 15% супружеских пар и связана с эндокринной, аутоимунной, инфекционной причинами или возникает идиопатически. При этом клинико-лабораторные проявления бесплодия (в первую очередь азооспермия) зависят от патоморфологических изменений сперматогенеза, к которым относятся снижение количества мужских половых клеток, подвижность сперматозоидов и др. [1, 2].
При изучении патогенетических механизмов мужского бесплодия применяют различные модели на лабораторных животных с последующей экстраполяцией результатов на человека. При моделировании, в качестве гонадотоксичных факторов используют лекарственные препараты из группы цитостатиков или ионизирующее излучение (Р-, у-, X-лучи и др.), приводящие к нарушению репликации ДНК и транскрипции РНК, подавляющему клеточный цикл мужских гамет [3].
В последнее время, активно проводят доклинические исследования различных препаратов и их аналогов, действие которых направлено на восстановление мужской репродуктивной функции [4, 5]. Одним из перспективных направлений можно считать использование бедной лейкоцитами плазмы, обогащенной тромбоцитами (LP-PRP), содержащей множество факторов роста (PDGF, TGF-P, VEGF, EGF и др.), которые участвуют в регуляции различных фаз жизненного цикла мужских половых клеток [6, 7]. Так, при ингибировании сперматогенеза цитостатиком на фоне введения PRP выявили увеличение количества сперматогенных стволовых клеток, подвижности сперматозоидов и уровня тестостерона [8]. В специализированной научной литературе данные об изучении влияния PRP на сперматогенез после облучения практически отсутствуют.
Размножение и гибель мужских половых клеток регулируются белками Ю-67, обеспечивающими пролиферацию, и каспазами, ответственными за апоптоз [9, 10].
Семенник обладает высокой чувствительностью к радиоактивному излучению, что проявляется снижением митотического деления и гибелью половых клеток, в особенности сперматогоний [11]. Активация апоптоза происходит по внешнему и внутреннему путям, а за терминальную фазу ответственна каспаза-3. Другими регуляторами клеточного цикла являются проапоптотический (р53) и антиапоптотический (Bcl-2) белки [9].
Дисбаланс между пролиферацией и апоптозом мужских половых клеток, в том числе вызванный облучением, сопровождающийся уменьшением клеточного пула, за счет модуляции GSK3-, ERK- и Ras/Raf/MEK-1 сигнальных путей, ведет к деактивации Вс1-2 и индукции p53 [12, 13].
Таким образом, в настоящее время снижение мужской репродуктивной функции, вызванное различными видами облучения и, в частности электронами, обусловленное повреждением различных стадий жизненного цикла гамет, остается актуальным. Не менее важной является разработка методов коррекции возникших патоморфологических изменений.
Цель исследования: иммуногистохимическая оценка пролиферации сперматогенного эпителия после облучения электронами дозой 2 Гр и коррекции плазмой, обогащенной тромбоцитами.
Для осуществления цели поставлены следующие задачи: изучение уровня экспрессии универсального фактора пролиферации - Ki-67; маркеров антиапоптоза (Bcl-2) и проапоптоза (р53) в извитых семенных канальцах. Материал и методы
Экспериментальное морфологическое исследование проводили на базах Медицинского радиологического научного центра имени А.Ф. Цыба и Сеченовского университета.
Животные для исследования in vivo. Крысы породы Wistar (n=135) были поделены на группы (условные названия): I - контрольная (n=10), которым вводили физиологический
раствор; II, III, IV (n=95) - однократное локальное облучение семенников электронами дозой 2 Гр (2IR; мощность дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ и частота 9 Гц, размер поля - 0 100 мм, линейный акселератор «NOVAC-11»); животным III-ей группы (n=30) в течение 11 недель вводили плазму, содержащую высокую концентрацию тромбоцитов и низкую концентрацию лейкоцитов - LP-PRP в комбинации с рекомбинантным IGF-1, а IV-ой группе (n=30) только LP-PRP; самцы V-ой группы (n=30) получали LP-PRP. Животных всех групп постепенно выводили из эксперимента 1 раз в 2 недели на протяжении 12 недель.
Все манипуляции осуществляли согласно Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (ЕЭС, Страсбург, 1985), Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ЕЭС, Страсбург, 1986), Руководствам по проведению медико-биологических исследований по уходу и использованию лабораторных животных (ILAR, DELS), Правилам лабораторной практики и приказу Минздрава России № 199н от 01.04.2016 «Об утверждении правил лабораторной практики». Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), протокол № 043 от 11.08.2020 г.
Семенники после фиксации в растворе Буэна для иммуногистохимического исследования приготавливали по стандартному протоколу. Демаскировку антигенов проводили в цитратном буфере, рН 6,0. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к Ki-67 (Clone MM1; 1:200), Bcl-2 (Clone bcl-2/100/D5; 1:50) и p53 (Clone DO-7; 1:200). Для определения вторичных антител использовались универсальная двухкомпонентная система детекции HiDef Detection™ HRP Polymer system, («Cell Marque», США), анти-IGG мыши/кролика, пероксидаза хрена (HRP) и субстрат DAB. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера.
Подсчет количества иммунопозитивных клеток проводили в 10 случайно отобранных полях зрения при увеличении х 400 (в процентах).
Микроскопический анализ выполнялся с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD).
Статистический анализ. Полученные данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Рассчитывали средние арифметические величины с предельными отклонениями и среднеквадратичную ошибку. Сравнение между группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA со значимостью P < 0,05. Результаты исследования
Гистологическое исследование. В контрольной группе - физиологический сперматогенез. В семенниках крыс II-ой, III-ей и IV-ой групп через неделю после облучения наблюдали нарушение гистоархитектоники и признаки гипосперматогенеза, которые сохранялись в группе облученных животных без PRP-коррекции до окончания эксперимента (Рис. 1). На фоне введения LP-PRP+IGF-1 и LP-PRP наблюдали постепенное увеличение количества половых клеток, начиная с 14 суток эксперимента: на 42 сутки сперматогоний - в 2,0 раза, сперматоцитов - в 4,0 раза и сперматид - в 3,0 раза в сравнении с самцами II-ой группы. К окончанию исследования количество половых клеток увеличивалось до значений, близких к показателям контрольной группы, а в просвете семенных канальцев присутствовали сперматозоиды (на 12 неделе) (Рис. 1). Животные V-ой группы после введения LP-PRP на протяжении эксперимента не показали достоверных отличий по всем изученным параметрам по сравнению с контрольной группой (Рис. 1).
Контроль
2IR (2 Гр)
2IR+PRP+IGF
2IR+PRP PRP
Рис. 1. Морфологическая картина семенников крыс на 12 неделе эксперимента в группах контроля, облучения (2Ж), облучение+PRP+IGF-1 (2IR+PRP+IGF-1), облучение+PRP (2IR+PRP) и PRP. Окраска - гематоксилином и эозином, увелич. х200.
Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование. При анализе распределения Кь67 после облучения (П-ая группа) отмечали уменьшение экспрессии исследуемого маркера в 4,6 раз (16,3±1,1%, Р < 0,05) к окончанию эксперимента по сравнению с контрольными значениями (76,0±1,4%, Р < 0,05). На фоне введения PRP самцам Ш-ей и ГУ-ой групп отмечали постепенное увеличение Кь67-позитивных половых клеток по сравнению со ГГ-ой группой: к окончанию эксперимента оно было выше в 3,5 раза (в комбинации с ГGF-1) и 2,8 раза -56,7±1,2% и 46,4±1,2%, соответственно, при Р < 0,05. В У-ой группе достоверных различий по сравнению с контрольными образцами не было обнаружено (Табл. 1, Рис. 2).
Практически аналогичную иммуногистохимическую картину демонстрировал антиапоптотический белок Вс1-2: через неделю после облучения отмечали снижение позитивно окрашенных половых клеток в 1,8 раз (29,3±1,1%, Р < 0,05) по сравнению с контрольной группой (53,4±1,2%, Р < 0,05). После введения PRP в комбинации с ГGF-1, начиная со 2-ой недели после облучения, обнаружили постепенное увеличение количества Вс1-2-позитивных половых клеток, которое к 12-ой неделе было в 3,7 раз больше (33,9±1,2%, Р < 0,05), чем у самцов ГГ-ой группы (9,1±1,1%, Р < 0,05), а в семенных канальцах животных ГУ-ой группы - в 2,5 раза (23,5±1,2%, Р < 0,05). Показатели Вс1-2 в семенниках У-ой группы были близки к контрольным значениям (Табл. 1, Рис. 2).
Количество р53-окрашенных половых клеток варьировало на разных стадиях эксперимента (Табл. 1). Так, через неделю после облучения электронами в дозе 2 Гр наблюдалось увеличение количества р53-позитивных гамет в 1,3 раз (57,1±1,1%, Р < 0,05), преимущественно сперматогоний, по сравнению с контрольной группой (54,3±1,2%, Р < 0,05), в которой преобладали р53-окрашенные сперматиды и сперматозоиды. После введения комбинации РЯР и ЮБ-1 крысам Ш-ей группы и РЯР животным ГУ-ой группы отмечали постепенное уменьшение доли позитивных половых клеток в 1,8 (40,3±1,1%, Р < 0,05) и в 1,6 (44,1±1,1%, Р < 0,05) раз, соответственно, к 12-ой неделе по сравнению со ГГ-ой группой. В У-ой группе на всем протяжении эксперимента не было выявлено статистически значимых различий в количестве р53-позитивных гамет по сравнению с контрольной группой (Табл. 1, Рис. 2).
Таким образом, на основании полученных результатов иммуногистохимического исследования четко прослеживается увеличение пролиферативной активности половых клеток, особенно сперматогоний, после введения РЯР в комбинации с ЮБ-1 с опережением на 2 недели по сравнению с группой, которой вводили только РЯР.
Таблица 1. Доля ИГХ-позитивных клеток в извитых семенных канальцах контрольной и опытных групп, %
Группы Ю-67 Bcl-2 p53
M±STD M±STD M±STD
Контроль 76,0±1,4 53,4±1,2 54,3±1,2
2Ж 7 сутки 53,7±1,2а 29,3±1,1а 57,1±1,1а
2ГЯ 14 сутки 34,2±1,3а 15,2±1,1а 65,4±1,1а
2ГЯ 56 сутки 21,4±1,0а 12,5±1,1а 69,9±1,2а
2ГЯ 84 сутки 16,3±1,1а 9,1±1,1а 74,8±1,2а
2IR+PRP+IGF 14 сутки 42,5±1,3Ь 23,7±1,1ь 60,3±1,2Ь
2ГО.+РКР+ЮЕ 56 сутки 47,1±1,2Ь 26,5±1,2Ь 51,6±1,1ь
2ГО.+РКР+ЮЕ 84 сутки 56,7±1,2Ь 33,9±1,2Ь 40,3±1,1ь
2IR+PRP 14 сутки 39,4±1,1с 17,8±1,1с 62,9±1,2С
2ГЯ+РЯР 56 сутки 43,2±1,3С 20,3±1,1с 57,6±1,2С
2IR+PRP 84 сутки 46,4±1,2c 23,5±1,2c 44,1±1,1c
PRP 73,6±1,4 48,8±1,3 51,3±1,2
aP < 0,05 (Контроль и 2IR), bP < 0,05 (2IR и 2IR+PRP+IGF-1), CP < 0,05 (2IR и 2IR+PRP); M -выборочное среднее, STD - выборочное стандартное отклонение
Д
Рис. 2. Семенные извитые канальцы на 12 неделе эксперимента. Иммуногистохимические реакции с антителами к К1-67, Вс1-2, р53; доокрашивание ядер - гематоксилином, увелич. х400. А - контроль; Б - после облучения электронами дозой 2 Гр (2ГЯ); В - после облучения электронами дозой 2 Гр и введения плазмы, обогащенной тромбоцитами с инсулиноподобным фактором роста-1 (2ГК+ЬР-РКР+ЮБ-1); Г - после облучения электронами дозой 2 Гр и введения плазмы, обогащенной тромбоцитами (2ГЯ+ЬР-РЯР); Д -после введения плазмы, обогащенной тромбоцитами (ЬР-РЯР).
Обсуждение результатов
Данное исследование посвящено изучению нарушения пролиферации половых клеток, возникшего после воздействия ионизирующего излучения на сперматогенез, и модулируемое факторами роста плазмы, обогащенной тромбоцитами.
После локального облучения электронами дозой 2 Гр в экспериментальных группах наблюдали выраженное снижение количества Кь67-позитивных половых клеток, которое связано с прямым токсическим действием Р-излучения на активно пролиферирующие гаметы, прежде всего сперматогоний, в которых происходят повреждения и нарушения и повреждения клеточных мембран и структуры макромолекул (ДНК, РНК, белков, липидов и др.), МАРК-, РГ3К-и NFкB-сигнальных путей, белков семейства БгЬВ и клеточного дыхания на уровне цепи переноса электронов в митохондриях, что приводит к дисбалансу антиоксидантной и прооксидантной систем [14]. Кроме того, обнаруженное угнетение дифференцировки половых клеток связано с повреждением таких сигнальных путей как РГ3-киназы/АЙ; и Ка8/ЯаГ/МЕК-1, а также гликоген синтазы киназы-3 (ОБК-3) и киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ЕЯК) [12].
Модулирование активности вышеперечисленных каскадов также приводит к хромосомным мутациям, что подтверждено увеличением доли р53-позитивных половых клеток. Следует отметить, что после облучения наблюдали снижение количества митотически делящихся генераций, в то время как при нормальном сперматогенезе преимущественно уменьшается пул мейотически делящихся гамет вследствие их активной селекции при кроссинговере [15].
Индуцированное облучением электронами уменьшение количества Вс1-2-позитивных клеток связано с ингибированием трансляции мРНК Мс1-1 (белок, родственный Вс1-2) и его быстрым разрушением за счет протеасомной деградации, опосредованной фосфодегроном при участии ОБК-3-сигнального пути, что приводит к смещению пролиферативно-апоптотического баланса в сторону апоптоза [13].
Известно, что действие ионизирующего излучения приводит к снижению экспрессии ключевых факторов роста, оказывающих прямое положительное влияние на пролиферацию и дифференцировку половых клеток. В связи с этим, было целесообразным применение плазмы, обогащенной тромбоцитами, а-гранулы которых содержат высокую концентрацию факторов роста, что, в итоге, приводит к усилению регенеративной активности гамет [16].
Входящие в состав РКР биологически-активные вещества, в первую очередь трансформирующий фактор роста-Р, эпидермальный фактор роста и инсулиноподобный фактор роста-1, индуцируют митотическую активность неповрежденных сперматогониальных стволовых клеток и, тем самым, восстанавливают пролиферативно-апоптотический баланс [17].
Для усиления положительных эффектов РКР был выбран рекомбинантный ЮБ-1, который, проходя через гематотестикулярный барьер и плазмолемму половых клеток, стимулировал их пролиферацию, дифференцировку и регенеративную активность, что было подтверждено увеличением К1-67- и Вс1-2-позитивных клеток в ГГГ-ей группе.
Заключение
Факторы роста а-гранул активированных тромбоцитов PRP, являющиеся ключевыми
регуляторами жизненного цикла половых клеток, после облучения стимулируют
восстановление пролиферативно-апоптотического баланса, усиленное дополнительным
введением IGF-1 и подтвержденное на уровне экспрессии Ki-67, Bcl-2 и p53.
Список литературы
1. Vander Borght M., Wyns C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clin Biochem. 2018. V. 62. P. 2-10. DOI: doi: 10.1016/j.clinbiochem.2018.03.012.
2. Jafari H., Mirzaiinajmabadi K., Roudsari R.L., Rakhshkhorshid M. The factors affecting male infertility: A systematic review. Int J Reprod Biomed. 2021. V. 19. No. 8. P. 681-688. DOI: 10.18502/ijrm.v19i8.9615.
3. Qu N., Itoh M., Sakabe K. Effects of Chemotherapy and Radiotherapy on Spermatogenesis: The Role of Testicular Immunology. Int J Mol Sci. 2019. V. 20. No. 4. Article ID 957. DOI: 10.3390/ijms20040957.
4. Abd El Tawab A.M., Shahin N.N., AbdelMohsen M.M. Protective effect of Satureja montana extract on cyclophosphamide-induced testicular injury in rats. Chem Biol Interact. 2014. V. 224. P. 196-205. DOI: 10.1016/j.cbi.2014.11.001.
5. Alp B.F., Kesik V., Malkog E., et al. The effect of melatonin on procarbazine induced testicular toxicity on rats. Syst Biol Reprod Med. 2014. V. 60. No. 6. P. 323-328. DOI: 10.3109/19396368.2014.930212.
6. Everts P., Onishi K., Jayaram P., et al. Platelet-Rich Plasma: New Performance Understandings and Therapeutic Considerations in 2020. Int J Mol Sci. 2020. V. 21. No. 20. P. 77-94. DOI: 10.3390/ijms21207794.
7. Garcia A., Su T.T. Cell cycle regulation. Fly (Austin). 2008. V. 2. No. 3. P. 133-137. DOI: 10.4161/fly.6333.
8. Dehghani F., Sotoude N., Bordbar H., et al. The use of platelet-rich plasma (PRP) to improve structural impairment of rat testis induced by busulfan. Platelets. 2019. V. 30. No. 4. P. 513-520. DOI: 10.1080/09537104.2018.1478400.
9. Guo M., Hay B.A. Cell proliferation and apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 1999. V. 11. No. 6. P. 745-752. DOI: 10.1016/s0955-0674(99)00046-0.
10. Zhao W.P., Wang H.W., Liu J., et al. Positive PCNA and Ki-67 Expression in the Testis Correlates with Spermatogenesis Dysfunction in Fluoride-Treated Rats. Biol Trace Elem Res. 2018. V. 186. No. 2. P. 489-497. DOI: 10.1007/s12011-018-1338-6.
11. Bagheri H., Salajegheh A., Javadi A., et al. Radioprotective Effects of Zinc and Selenium on Mice Spermatogenesis. J Biomed Phys Eng. 2020. V. 10. 707-712. DOI: 10.31661/jbpe.v0i0.957.
12. Wang Q., Zhou Y., Wang X., Evers B.M. Glycogen synthase kinase-3 is a negative regulator of extracellular signal-regulated kinase. Oncogene. 2006. V. 25. No. 1. P. 43-50. DOI: 10.1038/sj.onc.1209004.
13. Morel C., Carlson S.M., White F.M., Davis R.J. Mcl-1 integrates the opposing actions of signaling pathways that mediate survival and apoptosis. Mol Cell Biol. 2009. V. 29. No. 14. P. 3845-3852. DOI: 10.1128/MCB.00279-09.
14. Reisz J.A., Bansal N., Qian J., et al. Effects of ionizing radiation on biological molecules-mechanisms of damage and emerging methods of detection. Antioxid Redox Signal. 2014. V. 21. No. 2. P. 260-292. DOI: 10.1089/ars.2013.5489.
15. Демяшкин Г.А. Иммунофенотипическая характеристика сперматогенеза при идиопатической форме мужского бесплодия. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2020. Т. 64. No. 2. С. 63-73. DOI: 10.25557/0031-2991.2020.02.%2063-73
16. Кубатиев А.А., Боровая Т.Г. Жуховицкий В.Г. и др. Микрочастицы тромбоцитов: образование и свойства. Патогенез. 2017. Т. 15. No. 2. С. 4-13. DOI: 10.25557/GM.2017.2.7296
17. Maria-Angeliki G., Alexandros-Efstratios K., Dimitris R, Konstantinos K. Platelet-rich Plasma as a Potential Treatment for Noncicatricial Alopecias. Int J Trichology. 2015. V. 7. No. 2. P. 54-63. DOI: 10.4103/0974-7753.160098.
