CC BY
72021, т. 11, № 4
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
УДК: 616.697-021.6 DOI: 10.37279/2224-6444-2021-11-4-6-10
ОСОБЕННОСТИ S-ПЕРИОДА МИТОЗА В СЕМЕННЫХ КАНАЛЬЦАХ ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОНАМИ ДОЗОЙ 2 ГР И ВВЕДЕНИИ PRP
Демяшкин Г. А.1,2, Боровая Т. Г.3, Андреева Ю. Ю.4, Корякин С. Н.2, Щекин В. И.12, Мамзеров А. В.5
'ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), 119048, ул. Трубецкая, 8 стр.2, Москва, Россия
2ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр радиологии, 249036, ул. Королева, 4, Обнинск, Россия
Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н. Ф. Гамалеи, 123098, ул. Гамалеи, Москва, Россия
4Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования, 123098, ул. Баррикадная, 2/1, стр. 1, Москва, Россия
5ФГБУ Обнинский институт атомной энергетики, 249039, Студгородок, 1, Обнинск, Россия
Для корреспонденции: Демяшкин Григорий Александрович, к.м.н., Сеченовский Университет, e-mail:
dr.dga@mail.ru
For correspondence: Grigory Demyashkin, PhD, I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), e-mail: dr.dga@mail.ru
Information about authors:
Demyashkin G. A., https://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Borovaya T. G., https://orcid.org/0000-0001-8444-1801 Andreeva Yu. Yu., https://orcid.org/0000-0003-4749-6608 Koryakin S. N., https://orcid.org/0000-0003-0128-4538 Shchekin V. I., https://orcid.org/0000-0003-3763-7454 Mamzerov A. V., https://orcid.org/0000-0002-9211-531X
РЕЗЮМЕ
С каждым годом неуклонно растет количество случаев мужского бесплодия, в связи с чем необходима разработка новых методов диагностики и лечения этого заболевания. Известно, что высокой регенеративной активностью обладает плазма, обогащённая тромбоцитами, а-гранулы которых содержат факторы роста, поэтому мы вправе ожидать положительных эффектов после ее применения для восстановления сперматогенного эпителия. Цель исследования: иммуногистохимическая оценка PCNA в семенных канальцах на фоне активации факторов роста после облучения. Материал и методы. Крысы породы Вистар (n=135) были поделены на группы: I - контроль, II - 2IR, III - 2IR+LP-PRP+IGF-1, IV - 2IR+LP-PRP и V - LP-PRP. Сперматогенез у животных II, III и IV групп ингибировали однократным локальным облучением электронами дозой 2 Гр. Затем, на протяжении 11 недель крысам III и IV внутрибрюшинно вводили LP-PRP, а в III группе - дополнительно IGF-1. Семенники изучали иммуногистохимическим методом с антителами к PCNA. Результаты. После облучения обнаружили резкое уменьшение доли PCNA-позитивных половых клеток, преимущественно сперматогоний, которая постепенно восстанавливалась на фоне введения LP-PRP в комбинации с IGF-1. Заключение. При однократном локальном воздействии облучения электронами дозой 2 Гр на семенники происходит снижение пролиферативной активности половых клеток, оцененной по PCNA.
Ключевые слова: сперматогенез, облучение, гипосперматогенез, PRP, PCNA, факторы роста.
SPECIFIC FEATURES OF THE S-PERIOD OF MITOSIS IN THE SEMINAL TUBULES AFTER 2 GY ELECTRON IRRADIATION AND PRP INTRODUCTION
Demyashkin G. A.12, Borovaya T. G.3, Andreeva Yu. Yu.4, Koryakin S. N.2, Shchekin V. I.12, Mamzerov A. V.5
'I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia 2Medical Radiological Scientific Center named after A.F. Tsyba, Obninsk, Russia
3The National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya, Moscow, Russia
4Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Moscow, Russia 5Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering, Obninsk, Russia
SUMMARY
Every year the number of cases of male infertility is growing steadily, and therefore it is necessary to develop new
methods for the diagnosis and treatment of this disease. It is known that plasma enriched with platelets, the a-granules of which contain growth factors, possesses high regenerative activity; therefore, we can expect positive effects after its use for the restoration of spermatogenic epithelium. Objective of the study: immunohistochemical assessment of PCNA in the seminiferous tubules against the background of activation of growth factors after irradiation. Material and methods. Wistar rats (n = 135) were divided into groups: I - control, II - 2IR, III - 2IR+LP-PRP+ IGF-1, IV - 2IR+LP-PRP and V - LP- PRP. Spermatogenesis in animals of groups II, III, and IV was inhibited by a single local irradiation with electrons at a dose of 2 Gy. Then, for 11 weeks, LP-PRP was intraperitoneally injected into rats III and IV, and in group III - additionally IGF-1. The testes were examined by immunohistochemistry with antibodies to PCNA. Results. After irradiation, a sharp decrease in the proportion of PCNA-positive germ cells, mainly spermatogonia, was found, which gradually recovered after the administration of LP-PRP in combination with IGF-1. Conclusion. The increase in the number of PCNA-positive cells is directly related to the introduction of LP-PRP-IGF-1.
Key words: spermatogenesis, irradiation, hypospermatogenesis, PRP, PCNA, growth factors.
С каждым годом отмечается рост количества мужчин с бесплодием во всем мире [1], которое связано с эндокринной, аутоимунной, инфекционной причинами или возникает идиопатически и вызывает угнетение сперматогенеза, сопровождающиеся, в первую очередь дисбалансом между пролиферацией и апоптозом мужских половых клеток, который особенно проявляется после действия ионизирующего излучения или использования цитостатических препаратов. С одной стороны, радиоактивные частицы оказывают прямое повреждающее действие на нуклеиновые кислоты и белки, вызывая радио-лиз воды с образованием активных радикалов, а с другой стороны, активируют перекисное окисление липидов и образование вторичных радиотоксинов, которые нарушают целостность мембранных структур клетки.
Поэтому, разработка способов восстановления репродуктивной функции является одной из актуальной и важных задач современной андро-логии и морфологии, направленных на изучение причинно-следственных связей и внутригонад-ных патогенетических механизмов нарушения сперматогенеза, с последующей их коррекции.
Физиологический сперматогенез в том числе зависит от влияния ростовых факторов (PDGF, TGF-P, VEGF, EGF, и др.), регулирующих основные фазы жизненного цикла половых клеток, такие как пролиферация, дифференцировка и апоптоз [2]. В различные направления регенеративной медицины в последнее время широко внедряется плазма, обогащенная тромбоцитами (PRP), содержащая ряд биологички активных веществ и факторов роста, многие из которых являются мощными регуляторами и активаторами различных фаз клеточного цикла.
Для оценки эффективности применения РКР можно судить по пролиферативной активности половых клеток, учитывая значения таких маркеров, как PCNA, Ю-67 и др.
PCNA (ядерный антиген пролиферирую-щих клеток) регулирует период митоза,
отвечая за синтез и репликацию ДНК, являясь вспомогательным фактором для е- и 5- ДНК-полимеразы [3]. В единичных исследованиях сообщается, что после облучения экспрессия маркеров пролиферации, в частности PCNA, понижается, в ответ на повреждение цепей ДНК [4]. Однако, пролиферативная активность половых клеток в условиях облучения электронами, а также возможная коррекция факторами роста остаются малоизученными или противоречивыми [5; 6].
Цель исследования: иммуногистохимическая оценка PCNA в семенных канальцах на фоне активации факторов роста после облучения.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование проводили на базах Медицинского радиологического научного центра имени А.Ф. Цыба и Сеченовского университета.
Крысы породы Wistar (п=135) были поделены на группы: I - контрольная (п=10; вводили физиологический раствор); II, III, IV (п=95) -однократное локальное облучение семенников электронами дозой 2 Гр (2Ж); III группа (п=30) - в течение 11 недель внутрибрюшинной инъекцией вводили плазму, содержащую высокую концентрацию тромбоцитов и низкую концентрацию лейкоцитов ^Р-РКР) в комбинации с рекомбинантным человеческим IGF-1, а в IV группе (п=30) - только LP-PRP; V (п=30) - получали LP-PRP. Животных всех групп постепенно выводили из эксперимента каждые 2 недели на протяжении 12 недель.
Все манипуляции выполняли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации.
Семенники фиксировали в растворе Буэна, заливали в парафиновые блоки, готовили серийные срезы для иммуногистохимического исследования, которое проводили по стандартному
2021, т. 11, № 4
крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины
протоколу в ручном режиме. В качестве первичных использовали кроличьи моноклональные антитела к PCNA (Invitrogen, PA5-27214; 1:100), а вторичные - универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, «Cell Marque», США). Подсчёт иммунопозитивных половых клеток проводили в 10 случайно отобранных полях зрения при увеличении ><400 (в %). Микроскопический анализ выполнялся с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD; компьютер Platrun LG).
Полученные в результате подсчёта данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Сравнение между группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA со значимостью p<0.01.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При иммуногистохимическом исследовании с антителами к PCNA во всех образцах контрольной и опытных групп визуализировали ядерные реакции различной степени выраженности, преимущественно в сперматогониях (рис. 1, рис. 2).
В семенных канальцах животных II группы через две недели после облучения электронами дозой 2 Гр отмечали снижения доли PCNA-позитивных половых клеток, которое к окончанию эксперимента было в 4,5 раза ниже (28,1±1,2%, при p<0.01) по сравнению с контрольными значениями (70,0±2,2%, при p<0.01) (рис. 1, рис. 2).
На фоне введения LP-PRP в комбинации с IGF-1 начиная со второй недели, наблюдали постепенное увеличения количества PCNA-позитивных половых клеток (67,1±0,2%, при p<0.01). Аналогичную картину выявили и в IV группе с отставанием в две недели (46,3±0,1%, при p<0.01) (рис. 1, 2).
Рис. 1. Значение ± стандартное отклонение количества PCNA-позитивных половых клеток в контрольной и опытных группах ар<0.01 (контроль и 2ГО), ьр<0.01 (2ГО и 2IR+PRP+IGF), ср<0.01 (2ГО и 2IR+PRP)
II
III
Рис. 2. Семенные канальцы животных контрольной и опытной групп на 84 сутки эксперимента, иммуногистохимические реакции с антителом к PCNA, докрашивание - гематоксилином, увеличение х200. II группа - после локального облучения электронами дозой 2 Гр и введение PRP (IV группа), а также в комбинации с IGF-1 (III группа).
I
V
Рис. 2. Семенные канальцы животных контрольной и опытной групп на 84 сутки эксперимента, иммуногистохимические реакции с антителом к PCNA, докрашивание - гематоксилином, увеличение х200. II группа - после локального облучения электронами дозой 2 Гр и введение PRP (IV группа), а также в комбинации с IGF-1 (III группа).
Достоверных различий окрашивания на PCNA в половых клетках V-ой и контрольной групп не обнаружили (рис. 1, рис. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
Нарушение сперматогенеза напрямую связано с клеточными и молекулярными изменениями в гаметах, в первую очередь с их размножением и гибелью.
Известно, что PCNA участвует в митотическом делении и дифференцировки половых клеток, одновременно является регулятором пролиферации
[3].
Обнаруженное после локального облучения семенников электронами дозой 2 Гр снижение количества половых клеток, связанное с уменьшением их пролиферативной активности, оцененной
по PCNA, частично совпадает с данным других авторов [7]. Клеточный цикл при воздействии радиации может быть блокирован в двух критических точках-перехода из G1 в S и/или из G2 в М фазу, что сопровождается двунитевыеми разрывами ДНК, приводящая в итоге к гибели половых клеток путем апоптоза или развитию мутантных клонов.
Для коррекции гипосперматогенеза использовали плазму, обогащенную тромбоцитами (PRP) содержащую альфа-гранулы с хемотаксическими и пролиферативными факторами роста, такими как PDGF, TGF-pi, IGF, VEGF, EGF, фибрин, фи-бронектин и витронектин и др. На фоне ее введения отмечали увеличение PCNA-позитивных гамет и восстановление пула за счет сперматого-ниальных стволовых клеток. Этот регенеративный эффект можно объяснить различными свойствами, которыми обладают универсальные факторы, входящие в состав PRP. Так, тромбоцитарный фактор роста (PDGF) контролирует продолжительность Gl-периода митоза, а трансформирующий фактор роста в (TGF-в) обладает антиапоптотическим действием. Эпидермальный фактор роста (EGF) активирует Р13К-сигнальный путь, который запускает каскад биохимических реакций, что приводит к повышению уровней внутриклеточного кальция и гликогена, а также увеличению экспрессии гена EGFR, регулирующего синтез ДНК, то есть пролиферацию клеток [8].
Дополнительное введение IGF-I с PRP показало опережение обнаруженных репаративных процессов восстановления пула половых клеток, учитывая, что IGF-1 является одним из ключевых индукторов и модуляторов метаболических процессов клетки по PBK-сигнальному пути. Кроме того, IGF-I может ингибировать каскад апоптоза, вследствии лабильности антиапоптотического Akt-пути, фосфорилируя транскрипционный фактор NF-kB, а также способствует диссоциации BAD на Ser136, тем самым деактивируя каспазы
[9, 10].
Таким образом, введение LP-PRP в комбинации с IGF-1 улучшило морфологические параметры семенных канальцев и ускорило процесс восстановления сперматогенного эпителия, в частности, показатели клеточной пролиферации значительно повышались на протяжении всего эксперимента.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При однократном локальном воздействии облучения электронами дозой 2 Гр на семенники происходит снижение пролиферативной активности половых клеток, оцененной по PCNA. Факторы роста а-гранул тромбоцитов PRP способствуют увеличению количества PCNA-позитивных половых клеток и восстановлению пула.
2021, т. 11, № 4
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
ЛИТЕРАТУРА
1. Chalyi M. E., Akhvlediani N. D., Kharchilava R. R. Male infertility. Urologiia. 2017;(S2):4-19. (In Russ..).
2. Andrae J., Gallini R., Betsholtz C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 2008; 22(10): 1276-1312. doi:10.1101/gad.1653708
3. Zhao W., Wang H., Liu J., Tan P., Luo X., Zhu S., Chen X., Zhou B. Positive PCNA and Ki-67 Expression in the Testis Correlates with Spermatogenesis Dysfunction in Fluoride-Treated Rats. Biol Trace Elem Res. 2018;186(2):489-497. doi:10.1007/s12011-018-1338-6
4. Jing Pan, Jianwei Zhang, Research Progress of PCNA in Reproductive System Diseases Review Article | Open Access Volume 2021, Article ID 2391917, 8 pages. doi:10.1155/2021/2391917
5. Ahmed F. Soliman, Mostafa Saif-Elnasr, Salma M. Abdel Fattah. Platelet-rich plasma ameliorates gamma radiation-induced nephrotoxicity via modulating oxidative stress and apoptosis. Life Sciences. 2019;219:238-247. doi:10.1016/j.lfs.2019.01.024.
6. Istiqamah E., Rizal D., Puspitasari I. Effect of Platelet-rich Plasma on Caspase-3 and IGF-1 mRNA expression in the diabetic rat testis. Indonesian Journal of Pharmacy. 2019;30(2):98-104. doi:10.14499/ indonesianjpharm30iss2pp98-104
7. Ji H., Wang D., Wu Y., Niu Y., Jia L., Liu B., Feng Q., Feng M. Wuzi Yanzong pill, a Chinese polyherbal formula, alleviates testicular damage in mice induced by ionizing radiation. BMC Complement Altern Med. 2016;16(1):509. doi:10.1186/s12906-016-1481-6.
8. Kaprin A. D., Kostin A. A., Epifanova M. V., Chalyy M. E., Gameeva E. V., Artemenko S. A. Platelet-rich plasma therapy for erectile dysfunction: a review of preclinical and clinical studies. Research and Practical Medicine Journal (Issled. prakt. med.). 2019;6(2):74-86. doi: 10.17709/2409-2231-2019-6-3-7
9. Demyashkin G. Immunophenotypic characteristics of spermatogenesis in idiopathic male infertility. Pathological physiology and experimental therapy. 2020;64(2):63-73. doi: 10.25557/0031-2991.2020.02.63-73.
10. Ellis M. J., Jenkins S., Hanfeltl J., Redington M. E., Taylo M., Leek R., Siddle K., Harris A. Insulin-like growth factors in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 1998; 52:175-184.
REFERENCE
1. Chalyi M. E., Akhvlediani N. D., Kharchilava R. R. Male infertility. Urologiia. 2017;(S2):4-19. (In Russ.).
2. Andrae J., Gallini R., Betsholtz C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 2008; 22(10): 1276-1312. doi:10.1101/gad.1653708
3. Zhao W., Wang H., Liu J., Tan P., Luo X., Zhu S., Chen X., Zhou B. Positive PCNA and Ki-67 Expression in the Testis Correlates with Spermatogenesis Dysfunction in Fluoride-Treated Rats. Biol Trace Elem Res. 2018;186(2):489-497. doi:10.1007/s12011-018-1338-6
4. Jing Pan, Jianwei Zhang, Research Progress of PCNA in Reproductive System Diseases Review Article | Open Access Volume 2021, Article ID 2391917, 8 pages. doi:10.1155/2021/2391917
5. Ahmed F. Soliman, Mostafa Saif-Elnasr, Salma M. Abdel Fattah. Platelet-rich plasma ameliorates gamma radiation-induced nephrotoxicity via modulating oxidative stress and apoptosis. Life Sciences. 2019;219:238-247. doi:10.1016/j.lfs.2019.01.024.
6. Istiqamah E., Rizal D., Puspitasari I. Effect of Platelet-rich Plasma on Caspase-3 and IGF-1 mRNA expression in the diabetic rat testis. Indonesian Journal of Pharmacy. 2019;30(2):98-104. doi:10.14499/ indonesianjpharm30iss2pp98-104
7. Ji H., Wang D., Wu Y., Niu Y., Jia L., Liu B., Feng Q., Feng M. Wuzi Yanzong pill, a Chinese polyherbal formula, alleviates testicular damage in mice induced by ionizing radiation. BMC Complement Altern Med. 2016;16(1):509. doi:10.1186/s12906-016-1481-6.
8. Kaprin A. D., Kostin A. A., Epifanova M. V., Chalyy M. E., Gameeva E. V., Artemenko S. A. Platelet-rich plasma therapy for erectile dysfunction: a review of preclinical and clinical studies. Research and Practical Medicine Journal (Issled. prakt. med.). 2019;6(2):74-86. doi: 10.17709/2409-2231-2019-6-3-7
9. Demyashkin G. Immunophenotypic characteristics of spermatogenesis in idiopathic male infertility. Pathological physiology and experimental therapy. 2020;64(2):63-73. doi: 10.25557/0031-2991.2020.02.63-73.
10. Ellis M. J., Jenkins S., Hanfeltl J., Redington M. E., Taylo M., Leek R., Siddle K., Harris A. Insulin-like growth factors in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 1998; 52:175-184.
