CC BY
11УДК 616.697-021.6. DOI: 10.37279/2224-6444-2021-11-4-27-32
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ В СЕМЕННИКАХ ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОНАМИ ДОЗОЙ 2 ГР И ВВЕДЕНИЯ PRP
Никитин П. В.1'2, Демяшкин Г. А.1'2' Беркетова А. М.3, Марьевская Д. С.3, Петухова П. С.3
'ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова (Сеченовский Университет), 119048, ул. Трубецкая, 8, стр.2, Москва, Россия
2ФГБУ Медицинский радиологический научный центр им. А. Ф. Цыба, 249036, ул. Королева, 4, Обнинск, Россия
3ФГБУ Обнинский институт атомной энергетики, 249039, Студгородок, 1, г. Обнинск, Россия
Для корреспонденции: Демяшкин Григорий Александрович, к.м.н., Сеченовский Университет, e-mail: dr.dga@mail.ru
For correspondence: Grigory Demyashkin, PhD, I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), e-mail:dr.dga@mail.ru
Information about authors:
Nikitin P. V., https://orcid.org/0000-0003-3223-4584 Demyashkin G. A., https://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Berketova A. M., https://orcid.org/0000-0003-4821-7383 Marevskyaya D. S., https://orcid.org/0000-0002-2584-087X Petukhova P. S., https://orcid.org/0000-0002-3521-5074
РЕЗЮМЕ
Использование химиотерапевтических препаратов и/или ионизирующего y- или р-излучения для лечения злокачественных опухолей яичка может приводить к бесплодию. Облучение взывает хромосомные аберрации в KRAS-, Myc-, Met- и Yap1-протоонкогенах, ответственных за пролиферацию, дифференцировку и апоптоз половых клеток. Количество этих генов-регуляторов и их структурные изменения можно рассматривать в качестве таргетной терапии мужского бесплодия. Цель исследования: молекулярно-генетическая оценка амплификации генов KRAS, Myc, Met, Yap1 в семенниках после облучения электронами дозой 2 Гр и введенияфакторов роста плазмы, обогащенной тромбоцитами (PRP). Материал и методы. Крысы породы Вистар (n=135) были поделены на группы: I - контроль, II - 2IR, III - 2IR+LP-PRP+IGF-1, IV - 2IR+LP-PRP и V - LP-PRP. Сперматогенез у животных II, III и IV групп ингибировали однократным локальным облучением электронами дозой 8 Гр. Затем, на протяжении 11 недель крысам III и IV внутрибрюшинно вводили LP-PRP, а в III группе - дополнительно IGF-1. В семенникахметодом ПЦР изучали амплификацию генов KRAS, MYC, MET, YAP1. Результаты. После облучения было отмечено повышение экспрессии KRAS, Myc, Met, Yap1, однако на фоне введения PRP с IGF1 выявили постепенное уменьшение экспрессии изучаемых генов, которое, к окончанию исследования, были практически приближены к контрольным значениям. Заключение. Ионизирующее облучение половых клеток семенников крыс электронами дозой 2 Гр индуцирует хромосомные аберрации генов KRAS, MYC, MET, YAP1, что приводит к различным фенотипическим и функциональным нарушениям и апоптозу.
Ключевые слова: мужское бесплодие, PRP, сперматогенез, облучение электронами, хромосомные аберрации.
MOLECULAR-GENETIC CHARACTERISTICS OF CHROMOSOMAL ABERRATIONS IN THE TESTES AFTER ELECTRON IRRADIATION WITH A DOSE OF 2 GY AND PRP INJECTION
Nikitin P. V.1'2, Demyashkin G. A.12, Berketova A. M.3, Marevskyaya D. S.3, Petukhova P. S.3
1I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia 2Medical Radiological Scientific Center named after A.F. Tsyba, Obninsk, Russia 3Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering, Obninsk, Russia
SUMMARY
The use of chemotherapeutic drugs and/or ionizing gamma or beta radiation for the treatment of malignant testicular tumors can lead to infertility. Irradiation causes chromosomal aberrations in KRAS-, Myc-, Met- and Yap1-proto-oncogenes responsible for proliferation, differentiation and apoptosis of germ cells. The number of these regulatory genes and their structural changes can be considered as targeted therapy for male infertility. Objective of the study: molecular genetic evaluation of the amplification of KRAS, Myc, Met, and Yap1 genes in the testes after electron irradiation with a dose of 2 Gy and administration of platelet-enriched plasma growth factors (PRP). Material and methods. Wistar rats (n = 135) were divided into 5 groups: I - control, II - 2IR, III - 2IR+LP-PRP+IGF-1, IV - 2IR+LP-PRP, and V - LP-PRP. Spermatogenesis in animals of groups II, III, and IV was inhibited by a single local irradiation with 2Gy electrons. Then, for 11 weeks, LP-PRP was injected intraperitoneally to rats III and IV, and in group III - additionally IGF-1. The testes were examined by amplification of genes KRAS, Myc, Met, Yap1. Results: After irradiation, an increase in the expression of KRAS, Myc, Met, Yap1 was noted, however, against the background of the introduction of
PRP with IGF1, there was a gradual decrease in the expression of the studied genes, which by the end of the study were almost close to the control values. Conclusion. Ionizing irradiation of rat testis germ cells with electrons at a dose of 2 Gy induces chromosomal aberrations of the KRAS, MYC, MET, YAP1 genes, which leads to various phenotypic morphofunctional disorders and apoptosis.
Key words: male infertility, PRP, spermatogenesis, electron irradiation, chromosomal aberrations.
Мужское бесплодие обусловлено, прежде всего, различными нарушениями сперматогенеза [13]. Причин снижения мужской фертильно-сти множество, но основные из них следующие: врожденные или приобретенные аномалии мужских половых органов, инфекции мочевыдели-тельной и репродуктивной систем, варикоцеле, генетические отклонения, иммунологические и эндокринные нарушения. В том числе к бесплодию могут приводить новообразования яичка, использование цитостатических лекарственных препаратов и ионизирующего излучения (ИИ): рентгеновское, у - и в - излучения и др.
Известно, что яичко относится к группе радиочувствительных органов, при этом наиболее восприимчивыми являются сперматогонии, а самыми устойчивыми - сперматозоиды.
Под действием ионизирующего излучения в ядре возникают однонитевые и двунитевые разрывы структуры молекулы ДНК, сопровождаю-щиесяхромосомными перестройками, поэтому последующие генерации содержатпатологиче-ский набор хромосом, приводящий к фенотипи-ческим изменениям половых клеток.
Разработка новых видов облучения и совершенствование уже существующих, а также подбор режимов дозирования в настоящее время по-прежнему остаются актуальными для современной лучевой диагностики, терапии, андроло-гии и онкологии.
По литературным данным, чаще всего облучение приводит к хромосомным аберрациям в KRAS-, Myc-, Met- и Yapl -протоонкогенах, которые ответственны за пролиферацию, диф-ференцировку и апоптоз клеток. Однако их пе-нетрантность напрямую зависит от локализации в геноме, типа и морфофункционального состояния клетки. Так, KRAS из семейства RAS, играет важную роль в формировании цитоскеле-та половых клеток, придавая им определенную форму [1]. Met, находящийся в клетках Лейдига, регулирует синтез тестостерона. В тоже время, данные о его участии в синтезе белков, отвечающих за передвижение мужских половых клеток, противоречивы [5]. Ген Myc, впервые появляясь в первичных и вторичных сперматоцитах, подвергает селекции половые клетки, запуская апоптотический каскад [5]. Yapl учувствует в Hippo-сигнальном пути, контролирует диффе-ренцировку клеток Сертоли [6]. Также, данный ген был обнаружен в половых клетках и клетках
Лейдига. Однако его роль в сперматогенезе, как и вышеупомянутых генов, остается мало изучена и требует дальнейшего исследования.
В последнее время для вспомогательных репродуктивных технологий используют лечение плазмой, обогащенной тромбоцитами (PRP-терапию), содержащей различные факторы роста. В тоже время, отсутствуют данные о влиянии этих биологически-активных веществ на мужские половые клетки и об оценке хромосомных аберраций после облучения.
Структура, концентрация, количество генов-регуляторов и их перестройки, можно рассматривать в качестве таргетной терапии мужского бесплодия различной этиологии.
Цель исследования - молекулярно-генети-ческая оценка амплификация генов KRAS, Myc, Met, Yapl в семенниках после облучения электронами дозой 2 Гр и введение PRP.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Дизайн эксперимента. Крысы породы Wistar (n=135) были поделены на группы: I - контрольная (n=10; вводили физиологический раствор); II, III, IV (n=95) - однократное локальное облучение семенников электронами дозой 2 Гр (2IR); III группа (n=30) - в течение 11 недель внутри-брюшинной инъекцией вводили плазму, содержащую высокую концентрацию тромбоцитов и низкую концентрацию лейкоцитов(LP-PRP) в комбинации с рекомбинантным человеческим IGF-1, а в IV группе (n=30) - только LP-PRP; V (n=30) - получали LP-PRP. Животных всех групп постепенно выводили из эксперимента каждые 2 недели на протяжении 12 недель.
Амплификация генов KRAS, MYC, MET, YAP1. Семенники после фиксации в растворе Буэна готовили по протоколу гистологического исследования. Анализ экспрессии генов KRAS, MYC, MET, YAP1 проведен с использованием метода определения порогового цикла (ACt) и вычисления относительной экспрессии генов согласно протоколу. Нормирование и внутренний контроль выполнены относительно гена домашнего хозяйства GAPDH. Статистический контроль проводился относительно контрольной группы. Подбор праймеров был осуществлён на основании общедоступных материалов о последовательностях ДНК и мРНК генов в базе данных NCBI с использованием программы Primer-BLAST.
Статистический анализ. Полученные данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows statisticalsoftwarepackage (IBM Analytics, США). Сравнение между группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA со значимостью p<0,01.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ амплификации генов семенников-проводили для определения цитотоксического действия и наличия хромосомных аберраций в половых клетках после облучения электронами дозой 2 Гр.
Через неделю после облучения в семенниках II группы зафиксировали резкое повышение экс-
прессии KRAS, MYC, MET, YAP1. К 84 суткам экспрессия тестируемых генов у облученных животных превысила контрольные значения в 5,3 (KRAS), в 6,5 (Myc), в 7,5 (MET) ив 7,6 (YAP1) раз.
На фоне введения PRP в комбинации с IGF-1 отмечали постепенное уменьшение экспрессии KRAS, MYC, MET, YAP1, которое к окончанию исследования было практически приближено к единице. Аналогичные, однако, заметно менее эффективные результаты наблюдали в семенниках IV группы, с животными, которым после облучения вводили только PRP .
Достоверных различий экспрессии генов KRAS, MYC, MET, YAP1 в семенниках V группы (PRP без облучения) и контрольных животных - не обнаружено.
Таблица 1
Амплификация экспрессии тестируемых генов в половых клетках семенников контрольной и
опытных групп.
Группы Амплификация гена KRAS Амплификация гена Myc Амплификация гена Met Амплификация гена Yapl
Контроль 1 1 1 1
2IR 7 сутки 12.5±2.3a 12.9±2.3a 13.38±2.5a 13.45±2.6a
2IR 42 сутки 7.43±1.5a 7.87±2.0a 8.74±2.34a 8.82±2.1a
2IR 84 сутки 5.28±2.04a 6.48±2.24a 7.52±2.86a 7.64±2.38a
2IR+PRP+IGF 42 сутки 5.05±0.78b 5.58±0.85b 5.79±0.9b 5.94±0.95b
2IR+PRP+IGF 84 сутки 1.8±0.28b 1.03±0.36b 1.42±0.37b 1.7±0.4b
2IR+PRP 42 сутки 6.81±1.47c 6.96±1.56c 7.15±1.67c 7.56±1.8c
2IR+PRP 84 сутки 2.26±1.2c 2.61±1.39c 2.7±1.43c 2.83±1.62c
PRP 84 сутки 1 1 1 1
Обозначения: ap<0.01 (контроль и 2IR), bp<0.01 (2IR и 2IR+PRP+IGF), cp<0.01 (2IR и 2IR +PRP).
ОБСУЖДЕНИЕ
Настоящее исследование посвящено выявлению хромосомных аберраций путем определения уровня экспрессии генов KRAS, MYC, MET, YAP1 в половых клетках после облучения семенников электронами дозой 2 Гр и коррекции плазмой, обогащенной тромбоцитами, в комбинации с инсулиноподобным фактором роста-1.
Обнаруженное нами резкое увеличение экспрессии всех тестируемых генов уже через неделю после облучения семенников, свидетельствует о появлении мутаций, сопровождающихся структурными качественными и количественными перестройками хромосом и приводящие
к фенотипическим изменениям половых клеток и, как следствие, к нарушению сперматогенеза.
Увеличение экспрессии гена KRAS из семейства Ras, ответственного за кодирование низкомолекулярных гуанозинтрифосфат-связыва-ющих белков (ГТФ) в тканях семенника, после облучения приводит к модуляции цикличности переключения между неактивной и активной формами ГТФ, а также взаимодействию ГТФ-Ras с эффекторными белками, ответственными за фосфатидилинозитол-3-киназный (PI3-киназа) и С-протеинкиназный (ПКС) сигнальные пути [1]. Тем самым, не происходит фос-форилирование 39-OH группы инозитолового кольца до инозитолфосфолипидов и активация ПКС, участвующая в фосфолирировании а- и
Р-тубулинов - белков жгутика сперматозоидов, кодируемых остатками серина и треонина, что в итоге влечет за собой дезорганизацию цито-скелета- формообразования и подвижности половых клеток.
Известно, что Met кодирует тирозинкиназу с-met и рецептор фактора роста гепатоцитов (HGF), регулирующего уровень тестостерона [3]. Ряд авторов указывают на наличие c-met в семенных канатиках и клетках Лейдига в гонадах эмбрионов. Повышение экспрессии Metв семенниках, выявленное после облучения, приводит к уменьшению количества клеток Лейдига и снижению секреции тестостерона, а включение отрицательной обратной связи по гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной оси вызывает локальные паракринные и аутокринные изменения и снижение количества половых клеток.
Другой, не менее важный регулятор сперматогенеза - Myc, который в норме локализуется в клетках Сертоли [2] и в период активного сперматогенеза отвечает за спонтанный p53-индуцированный апоптоз сперматоцитов [4]. Увеличение экспрессии Myc после облучения электронами дозой 2 Гр, говорит об избыточном образовании у-Н2АХ-фокусов фосфорили-рования предшественников протеинкиназы-С и активации ДНК-зависимой протеинкиназы, что приводит к увеличению хромосомных и хрома-тидных разрывов. Некоторые авторы сообщают, что даже низкий уровень ионизирующего излучения (0,01 Гр в течение 1 минуты) может повышать экспрессию данного гена в клеточных линиях сперматогоний типа B и линиях клеток Сертоли, что вызывает торможение клеточного цикла и гибель клеток [8].
Увеличение экспрессии гена Yapl (yes-associatedprotein 1), связанного с семейством факторов транскрипции TEAD (transcription alenhancerfactordomain), влечёт за собой подавление апоптоза. А учитываяего участиев передаче сигналов цАМФ и, совместно с геном TAZ (Transcriptionalco-activatorwith PDZ-bindingmotif), в Hippo-сигнальном путях [7], не исключено повреждение дифференцировки половых клеток после облучения.
Мутация генов KRAS, MYC, MET, YAP1 отдельно или в совокупности приводит к активации внутреннего (митохондриального) пути апоптоза половых клеток за счёт инициирования BH3 белка - Puma и Noxa, которые инакти-вируют антиапоптатические белки Bcl2, BclX, и, напротив, индуцируют проапоптатические белки Вах, Bak, Bok/Mtd и запускают каскад ка-спазы-9.
Настоящее исследование показало, что эпигенетические изменения, связанные с герми-
нативной дисфункцией, более вероятно вызваны воздействием ионизирующего излучения электронами дозой 2 Гр, приводящим к перестройкам генов KRAS, MYC, MET, YAP1. Они относятся к индуцированным гаметическим несбалансированным летальным хромосомным аберрациям, сопровождающимся различными фенотипическими и функциональными изменениями - уменьшением количества половых клеток, дезорганизацией их цитоскелета.
На фоне введения PRP в комбинации с IGF наблюдается постепенное улучшение качественно-количественных характеристик половых клеток. В а-гранулах тромбоцитов PRP находятся такие факторы роста, ra^PDGF, TGF-P, EGF, P-FGF. Согласно литературным данным, большинство из них стимулируют пролиферацию стволовых сперматогониальных клеток. FGF также регулирует дифференцировку половых клеток [10] и модулирует нейротрофический глиальный фактор (CDNF) и рецептор семейства GDNFal (GFRal), который через GFRal активирует Ret-тирозинкиназу из семейства Src [9]. FGF и GDNF, вероятно, не оказывают влияния на повреждённые клетки с выявленными хромосомными аберрациями, но, посредством активации сигнальных путей PI3K/Akt и MAPK, приводят к размножению низкодифференциро-ванных сперматогоний [12]. При добавлении к PRP инсулиноподобного фактора роста-1 пролиферация клеток будет увеличиваться в несколько раз. Дополнительное введение IGF-1 запускает PI3K/Akt- и RAS-RAF-MEK-ERK-пути (рис. 1), которые стимулируют пролиферацию и выживание клеток [11].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Облучение половых клеток электронами дозой 2 Гр индуцирует хромосомные аберрации
Рис.1. PI3K/Akt- и MAPK-зависимые пути реализации эффектовIGF-1 в стволовых спермато-гониальных клетках, схема.
генов KRAS, MYC, MET, YAP1, что приводит к различным фенотипическим и функциональным нарушениям: от гипосперматогенеза до терминальной аплазии гамет. Введение факторов роста а-гранул тромбоцитовРЯР в комбинации с IGF-1 не вызывает хромосомные мутации данных генов.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Nagdas S., Winfrey V., Olson G. Identification of ras and its downstream signaling elements and their potential role in hamster sperm motility,2002;67(4): 1058-1066. doi:10.1095/ biolreprod67.4.1058
2. Chieffi P., Minucci S., Cobellis G., Fasano S., Pierantoni R. Changes in proto-oncogene activity in the testis of the frog, Ranaesculenta, during the annual reproductive cycle. General and Comparative Endocrinology. 1995;99(2):127-136. doi: 10.1006/gcen.1995.1093.
3. Ricci G., Catizone A. Pleiotropic Activities of HGF/c-Met System in Testicular Physiology: Paracrine and Endocrine Implications. Front. Endocrinol. 2014;5:38. doi: 10.3389/ fendo.2014.00038.
4. Phesse T., Myant K.., Cole A., Ridgway R., Pearson H., Muncan V., van den Brink G., Vousden K., Sears R., Vassilev L., Clarke A., Sansom O. Endogenous c-Myc is essential for p53-induced apoptosis in response to DNA damage in vivo. Cell Death Differ. 2014; 21:956-966. doi: 10.1038/ cdd.2014.15.
5. Suzuki M., Abe K., Yoshinaga K, Obinata M., Furusawa M. Specific arrest of spermatogenesis caused by apoptotic cell death in transgenic mice. Genes to Cells. 1996; 1(12):1077-1068. doi:10.1046/j.1365-2443. 1996.d01-228.x.
6. Sen Sharma S., Majumdar S. Mol Cell Endocrinol. Transcriptional co-activator YAP regulates cAMP signaling in Sertoli cells. 2017; 450:64-73.doi: 10.1016/j.mce.2017.04.017.
7. Liqun Y., Mengying H., Juan T., Jianbing H., Jiang H., Feng W., Hongjuan C., Liang Y. Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif overexpression promotes cell proliferation and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif deficiency induces cell cycle arrest in neuroblastoma. OncolLett. 2017;13(6):4295-4301. doi: 10.3892/ol.2017.60.
8. Leung C., Yang Y., Yu K., Tam N., Chan T., Lin X., Kong R., Chiu J., Wong A., Lui W., Yuen K., Lai K., Wu R. Low-Dose Radiation Can Cause Epigenetic Alterations Associated with Impairments
in Both Male and Female Reproductive Cells. Front. Genet. 2021; 12:710143. doi: 10.3389/ fgene.2021.710143
9. KhadiviF., Koruji M., Akbari M., Jabari A., Talebi A., AshouriMovassagh S., PanahiBoroujeni A., Feizollahi N.,Nikmahzar A., Pourahmadi M., Abbasi M. Application of platelet-rich plasma (PRP) improves self-renewal of human spermatogonial stem cells in two-dimensional and three-dimensional culture systems. ActaHistochem. 2020;122(8):151627. doi: 10.1016/j.acthis.2020.151627.
10. Salamanna F., Veronesi F., Maglio M., Della Bella E., Sartori M., Fini M.New and Emerging Strategies in Platelet-Rich Plasma Application in Musculoskeletal Regenerative Procedures: General Overview on Still Open Questions and Outlook. BioMed Research International. 2015:846045. doi: 10.1155/2015/846045.
11. LeRoith D., Roberts CT. Jr.Theinsulin-like growth factor system and cancer. Cancer Lett. 2003;195(2): 127-37.doi: 10.1016/s0304-3835(03)00159-9.
12. Kubota H., Avarbock M., Brinster R.Growth factors essential for selfrenewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101 (47), 16489-16494.doi: 10.1073/pnas.0407063101.
13. Demyashkin G. Immunophenotypic characteristics of spermatogenesis in idiopathic male infertility. Patologicheskaya Fiziologiyai Eksperimental'naya Terapiya (Pathological physiology and experimental therapy). 2020;64(2):63-73. doi:10.25557/003 12991.2020.02.63-73.
REFERENCE
14. Nagdas S., Winfrey V., Olson G. Identification of ras and its downstream signaling elements and their potential role in hamster sperm motility,2002;67(4): 1058-1066. doi:10.1095/ biolreprod67.4.1058
15. Chieffi P., Minucci S., Cobellis G., Fasano S., Pierantoni R. Changes in proto-oncogene activity in the testis of the frog, Ranaesculenta, during the annual reproductive cycle. General and Comparative Endocrinology. 1995;99(2):127-136. doi: 10.1006/gcen.1995.1093.
16. Ricci G., Catizone A. Pleiotropic Activities of HGF/c-Met System in Testicular Physiology: Paracrine and Endocrine Implications. Front. Endocrinol. 2014;5:38. doi: 10.3389/ fendo.2014.00038.
17. Phesse T., Myant K.., Cole A., Ridgway R., Pearson H., Muncan V., van den Brink G., Vousden K., Sears R., Vassilev L., Clarke A., Sansom O. Endogenous c-Myc is essential for p53-induced
apoptosis in response to DNA damage in vivo. Cell Death Differ. 2014; 21:956-966. doi: 10.1038/ cdd.2014.15.
18. Suzuki M., Abe K., Yoshinaga K, Obinata M., Furusawa M. Specific arrest of spermatogenesis caused by apoptotic cell death in transgenic mice. Genes to Cells. 1996; 1(12):1077-1068. doi:10.1046/j.1365-2443. 1996.d01-228.x.
19. Sen Sharma S., Majumdar S. Mol Cell Endocrinol. Transcriptional co-activator YAP regulates cAMP signaling in Sertoli cells. 2017; 450:64-73.doi: 10.1016/j.mce.2017.04.017.
20. Liqun Y., Mengying H., Juan T., Jianbing H., Jiang H., Feng W., Hongjuan C., Liang Y. Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif overexpression promotes cell proliferation and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif deficiency induces cell cycle arrest in neuroblastoma. OncolLett. 2017;13(6):4295-4301. doi: 10.3892/ol.2017.60.
21. Leung C., Yang Y., Yu K., Tam N., Chan T., Lin X., Kong R., Chiu J., Wong A., Lui W., Yuen K., Lai K., Wu R. Low-Dose Radiation Can Cause Epigenetic Alterations Associated with Impairments in Both Male and Female Reproductive Cells. Front. Genet. 2021; 12:710143. doi: 10.3389/ fgene.2021.710143
22. KhadiviF., Koruji M., Akbari M., Jabari A., Talebi A., AshouriMovassagh S., PanahiBoroujeni A., Feizollahi N.,Nikmahzar
A., Pourahmadi M., Abbasi M. Application of platelet-rich plasma (PRP) improves self-renewal of human spermatogonial stem cells in two-dimensional and three-dimensional culture systems. ActaHistochem. 2020;122(8):151627. doi: 10.1016/j.acthis.2020.151627.
23. Salamanna F., Veronesi F., Maglio M., Della Bella E., Sartori M., Fini M.New and Emerging Strategies in Platelet-Rich Plasma Application in Musculoskeletal Regenerative Procedures: General Overview on Still Open Questions and Outlook. BioMed Research International. 2015:846045. doi: 10.1155/2015/846045.
24. LeRoith D., Roberts CT. Jr.Theinsulin-like growth factor system and cancer. Cancer Lett. 2003;195(2): 127-37.doi: 10.1016/s0304-3835(03)00159-9.
25. Kubota H., Avarbock M., Brinster R.Growth factors essential for selfrenewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101 (47), 16489-16494.doi: 10.1073/pnas.0407063101.
26. Demyashkin G. Immunophenotypic characteristics of spermatogenesis in idiopathic male infertility. Patologicheskaya Fiziologiyai Eksperimental'naya Terapiya (Pathological physiology and experimental therapy). 2020;64(2):63-73. doi:10.25 5 5 7/003 12991.2020.02.63-73.
